脑深部电刺激治疗帕金森病作用机制的探讨
王尔松，季耀东，胡锦，王晨，姚慧斌，呼建文，江澄川
【摘要】目的从蛋白组学的角度探索脑深部电刺激（DBS）与毁损术治疗帕金森病的机制是否类同。
方法采用荧光差异凝胶电泳（DIGE）技术，测定3例行双侧丘脑底核DBS治疗的帕金森病病人脑脊液中蛋白，在手术前（未干预组）、手术7d后但未刺激前（微毁损组）和刺激1周后（DBS组）的表达变化。
另留取3例非中枢系统疾病病人的脑脊液蛋白作为正常对照组。
结果未干预组和微毁损组、未干预组和DBS组、微毁损组和DBS组的组间比较分别发现14、18和13个明显差异蛋白点。
除3个蛋白点外，未干预组和微毁损组与未干预组和DBS组的组间蛋白差异点完全不同；且在这3个相同的蛋白点中，两个蛋白点呈相反方向表达。
结论结果初步提示DBS与毁损术治疗帕金森病的机制不相同。
【关键词】帕金森病；脑深部电刺激；毁损术
中图分类号：R742.5文献标志码：A文章编号：1009-122X（2012）03-0107-03
Study of mechanisms of deep brain stimulation for Parkinson's disease
Wang Ersong1,Ji Yaodong1,2,Hu Jin2,Wang Chen2,Yao Huibin1,Hu Jianwen3,Jiang Chengchuan1,2
1.Department of Neurosurgery,Jinshan Hospital,Fudan University,Shanghai200540,China;
2.Department of Neurosurgery, Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai200040,China;
3.Research Center for Proteome Analysis,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Shanghai200031,China
Abstract:Objective To study similarities and differences in mechanisms between deep brain stimulation(DBS)and lesioning operation for Parkinson's disease(PD)from the perspective of proteomics.Methods The proteins in the cerebrospinal fluids were assayed before operation(nonintervention group),the7th day after operation with no stimulation(slightly-lesioned group),and1week after stimulation(DBS group)respectively,in3patients with PD who had undergone bilateral subthalamic nucleus DBS.And the cerebrospinal fluid proteins taken from3patients with non-central nervous system diseases served as normal control group. Two-dimensional difference gel electrophoresis(DIGE)technique was used to determine the protein change.Results There were14, 18,and13significantly altered protein spots between nonintervention group and slightly-lesioned group,nonintervention group and DBS group,slightly-lesioned group and DBS group respectively.Within these altered protein spots from nonintervention/slightly-lesioned groups and nonintervention/DBS groups,there were only three identical protein spots in paired groups,of which two were regulated in different ways.Conclusions Our preliminary results suggest that the role of DBS for PD is probably different from that of lesioning.
Key words:Parkinson disease;deep brain stimulation;lesioning operation
脑深部电刺激（deep brain stimulation，DBS）因安全、可逆、效果好等优势，已逐步取代丘脑核团毁损术，成为外科治疗帕金森病的首选，但其作用机制目前仍不清楚[1]。
在临床治疗过程中，DBS开启前常发生“微毁损效应”，其发生机制与毁损术相似。
因此，监测微毁损后和DBS后有效指标可初步判断DBS治疗机制是否与毁损术类同。
蛋白质浓度和结构的变化往往是疾病发生或治疗干预的结果，监测蛋白质可揭示疾病发生或治疗干预的内在机制[2-3]。
因此，本研究采用荧光差异凝胶电泳（difference gel electrophoresis，DIGE）技术，测定脑脊液中的蛋白在手术损伤（微毁损）后和DBS后的变化，初步探讨DBS治疗的可能机制，现报道如下。
1对象与方法
1.1研究对象收集复旦大学附属华山医院神经外科收治的3例行双侧丘脑底核DBS治疗帕金森病病人的脑脊液作为研究组，另取3例非中枢系统疾病病人的脑脊液作为正常对照组。
两组病人的年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2方法
1.2.1DBS手术指征：参照Benabid[4]制定的筛选标准。
先进行植入电极（Model3389，Medtronic Inc，
基金项目：上海市科委基金资助（编号：04dz14005；10140903500）；上海交通大学基金资助（编号：YG2010MS40）
作者单位：200540上海，复旦大学附属金山医院神经外科（王尔松、季耀东、姚慧斌、江澄川）；200040上海，复旦大学附属华山医院神经外科（季耀东、胡锦、王晨、江澄川）；200031上海，中国科学院上海生命科学院蛋白质组研究分析中心（呼建文）
通讯作者：江澄川，Email：jiangcc1987@
·临床研究·
Minneapolis，USA），1周后植入脉冲发生器（Kinetra Model7424，Medtronic，Minneapolis，USA）。
术后第1天即开机。
两组病人均局麻下腰椎穿刺，留取脑脊液3～5ml，经2000转/min，离心10min，－70℃冰箱保存。
收集脑脊液标本征得学校伦理委员会的同意，参与者签署知情同意书。
研究组按取样时间分3个亚组：未干预组（脑脊液取自术前）、微毁损组（脑脊液取自植入电极7d后但开机刺激前）、DBS 组（脑脊液取自开机刺激1周后）。
1.2.2DIGE检测方法：①蛋白沉淀：每个样品各取约400μg蛋白，丙酮沉淀，12000转/min离心10min，沉淀蛋白加入预冷丙酮清洗3遍，真空干燥后加入适量裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫尿，4%CHAPS，65mmol/L Tris），裂解液和酶抑制剂以体积比50∶1混合复溶。
②定量：使用Bradford法将蛋白分装成50μg1管，－80℃低温保存。
③标记：把样品浓度均稀释到5μg/μL，将所有样品等量混合后分装作为内标。
取样品和内标各50μg，调节pH至8.0~9.0，加入DIGE染料Cy2、Cy3、Cy5各1μL 标记30min（冰上，避光）。
标记结束后，加10mmol/L 赖氨酸1μL终止反应10min。
④双向电泳：将上述3个标记好的样品混合、等电聚焦。
第一相进行等电聚焦（Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System，GE Amersham公司）为pH3~10，13cm非线性胶条；电泳条件：30V12h，500V1h，1000V1h，8000V 8h，500V4h。
第二相十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（Hofer SE600，GE Amersham公司）胶浓度12.5%T，电泳起始电流为15mA/胶，20min后改为30mA/胶，至溴酚蓝离胶下沿0.5cm时结束。
注意始终避光。
⑤扫描：使用Typhoon扫描仪，分别用3种不同波长488nm（Cy2），532nm（Cy3），633nm （Cy5）扫描，获得图谱。
⑥结果分析：采用图谱分析软件Decyder v6.5（GE healthy care公司），选择蛋白差异点标准：蛋白点在6块分析胶中均有显现；两组比较选择t检验，P＜0.05；平均数比率＞1.5或平均数比率＜－1.5。
1.3临床治疗效果分析分别在药物“开”和药物“关”状态下，按帕金森病评定量表（UPDRS），分别于手术前1d和开机后7d对帕金森病人的日常生活能力和运动能力进行评分，采用统计学软件（GraphPad Prism V5.0，GraphPad Software Inc.）进行统计学处理：对DBS前后进行配对t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
同时分别计算其改善率：改善率=（DBS前评分－DBS后评分）/DBS 前评分×100%。
2结果
2.1临床治疗效果分析（表1）研究组病人围手术期未发生明显不良反应。
所有病人在植入电极时均发生微毁损效应。
DBS后，无论在药物“开”或“关”状态下，UPDRS日常生活能力和运动能力评分均明显改善（P＜0.05）。
2.2脑脊液中蛋白胶内和胶间分析（图1）明显差异蛋白点在正常对照组和未干预组有48个；在未干预组和微毁损组有14个，其中上调表达6个，下调表达8个；在未干预组和DBS组有18个，其中上调表达10个，下调表达8个；在微毁损组和DBS 组有13个。
未干预组和微毁损组与未干预组和DBS组的差异蛋白点仅3个相同（331、398、721），且除点331均呈下调表达外，另两个蛋白点在各组间的表达方向正好相反。
在微毁损组和DBS组的13个明显差异蛋白点中，仅点331在未干预组和微毁损组及未干预组和DBS组的差异点中出现，其余
图1差异表达蛋白位点图1A未干预组和微毁损组比较，蛋白点824、398、1201、1211、1023、829呈上调表达，其他8个蛋白点呈下调表达1B未干预组和DBS组比较，蛋白点1044、533、671、392、721、415、1135、408、397、293呈上调表达，其他8个蛋白点呈下调表达
398
331
721
829824
878
10421023
1201
1211
1275
1285
1442
1381
1393
1135
967
10191044
846
721
633671
533
535
293
331
408
415
398
392
1A1B 表1帕金森病DBS手术前后UPDRS评分比较（x±s）
评分“开”状态“关”状态
日常生活能力评分
术前（分）19.3±1.229.3±3.0
术后（分）15.3±0.6①17.0±1.0①
改善率（%）20.4±4.041.8±3.3
运动能力评分
术前（分）35.0±8.267.3±8.0
术后（分）25.3±4.9①30.3±3.2①
改善率（%）27.1±8.154.8±3.9注：①与术前比较，均P＜0.05
12个蛋白点未在任一配对组的差异点中出现。
3讨论
目前，DBS已经基本取代毁损术治疗帕金森病。
本组研究中3例帕金森病病人在DBS围手术期均未发生明显的不良反应，DBS手术后所有病人的UPDRS运动能力评分和日常生活能力评分均明显改善，提示：双侧丘脑底核DBS治疗帕金森病安全、有效的。
DBS的机制存在两种假说[5]：①DBS在局部起抑制或阻止作用。
②DBS在局部起激活作用。
前者是基于DBS治疗帕金森病的临床效果与毁损术相同，认为其机制也应该相同。
部分研究结果支持这一假说，如Ogura等[6]对丘脑底核DBS治疗的相同部位进行毁损后，治疗效果与DBS完全一致；Trost 等[7]用PET对比研究丘脑底核DBS和毁损治疗的代谢改变，结果显示两种治疗均为抑制表现。
但这一假说仍存在很大争议。
有研究显示：丘脑底核高频电刺激引起的递质释放，与丘脑底核毁损或活动阻断所致的结果并不一致[5]；且电刺激引起的靶位及其周围神经元生理学改变无法简单地用局部抑制解释[8]。
临床接受DBS治疗的病人常发生微毁损效应，即植入电极后，在未开机刺激的情况下症状亦不同程度缓解。
从微毁损效应出现的时间和部位推断，其发生机制类似于毁损术[9]。
在机制研究中，蛋白质是最常用的检测指标之一。
目前认为：帕金森病的发生与蛋白的异常聚集有关[10]。
因此，本研究试图从蛋白质的角度，观察手术损伤与DBS治疗引起的蛋白变化之间的区别，探讨DBS治疗的机制与毁损术是否类同。
DIGE技术是一种新颖的测定差异蛋白的方法，可定量研究相对微量的蛋白质。
该技术在每块凝胶中加入内标，减少普通双向凝胶电泳中不同凝胶间的误差，是目前定量蛋白质研究中可信度和准确性最高的技术之一[11]。
本研究使用DIGE技术分析电极植入后（损伤丘脑底核，微毁损组）和开机后（刺激丘脑底核，DBS组）引起的蛋白变化。
与未干预组比较，微毁损组和DBS组分别发现14和18个差异蛋白点；这两组差异点中仅3个蛋白点相同，且其中2个表达趋势相反；这一结果说明：在影响蛋白表达方面，丘脑底核毁损和刺激是不同的。
本研究中，微毁损组和DBS组发现13个蛋白点发生显著改变，且除蛋白点331外，其余12个差异点与丘脑底核损伤后（14个）和DBS后（18个）的差异点相比无一相同；这进一步说明损伤后和刺激后蛋白差异表达是不同的。
这一结果与Mclntyre等[5]用微量渗析法研究细胞外递质释放的结果一致。
也即本研究结果提示：DBS治疗机制不同于毁损术。
虽然这些蛋白点尚需进一步质谱分析才能明确具体是哪些蛋白，但并不影响判定这一结论。
需要指出的是由于病例有限，本研究结论仅为初步观察分析，尚需大宗病例进一步证实。
但从脑脊液蛋白质变化的角度来探索DBS治疗机制，国内外尚未见报道。
本研究的尝试可能为DBS的作用机制研究提供新的思路。
【参考文献】
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（收稿日期：2011-08-02；修回日期：2012-02-02）。
