甲硫腺苷磷酸化酶基因多态性与汉族人缺血性脑卒中的关系

中国煤炭工业医学杂志２０１５年３月第１８卷第３期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒ．２０１５，Ｖｏ１．１８，Ｎｏ．３　・３４５・　甲硫腺苷磷酸化酶基因多态性与汉族人缺血性　脑卒中的关系　

李映雪　李永秋　王拥军　摘要　目的　研究甲硫腺苷磷酸化酶（ＭＴＡＰ）基因ｒｓ１０１１８７５７和ｒｓ７０２７９８９位点与中国汉族人缺血性脑　卒中（ＩＳ）的相关性。方法　入选２９７例大动脉粥样硬化性ＩＳ的患者作为Ｉｓ组及３１３例同期该院体检的　汉族健康人群作为对照组。应用ＰＣＲ及ＳＮＰ　ｓｔｒｅａｍ技术对ＭＴＡＰ基因中的ｒｓ１０１１８７５７和ｒｓ７０２７９８９　位点进行基因分型及分析。结果　在总体样本及以性别分层后的样本，ｒｓ１０１１８７５７和ｒｓ７０２７９８９位点的　ＧＧ基因型和Ｇ等位基因在ＩＳ组的分布频率高于对照组，但差异无统计学意义（Ｐ均＞Ｏ．Ｏ５）。结论　ＭＴＡＰ基因与汉族人大动脉粥样硬化型ＩＳ无相关。　关键词　遗传；单核苷酸多态性；甲硫腺苷磷酸化酶；缺血性脑卒中，汉族　中图分类号　Ｒ７４３　文献标识码　Ｂ　文章编号　１００７—９５６４（２０１５）０３—０３４５—０３　Ｄ０Ｉ编码　１Ｏ．１１７２３／ｍｔｇｙｙｘ　１００７—９５６４　２０１５０３００１　

ＴＨＥ　ＡＳＳｏＣＩＡＴＩｏＮ　ＢＥＴＷＥＥＮ　ＭＴＡＰ　ＧＥＮＥ　ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭＳ　ＡＮＤ　ＩＳＣＨＥＭＩＣ　ＳＴＲＯＫＥ　ＩＮ　ＣＨＩＮＥＳＥ　ＨＡＮＳ　ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮ　Ｌｉ　Ｙｉｎｇｘｕｅ，Ｌ　Ｙｏｎｇｑｉｕ，Ｗａｎｇ　ＹｏｎｇＪｕｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｔａｎｇｓｈａｎ　Ｇｏｎｇｒｅｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ－Ｈｅｂｅｉ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｔａｎｇｓｈａｎ　０６３０００，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　１０１１８７５７　ａｎｄ　ｒｓ７０２７９８９　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｉｎ　ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ—　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＭＴＡＰ）ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｓｔｒｏｋｅ（ＩＳ）ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｏｔａｌｌｙ　２９７　ｌａｒｇｅ　ｖｅｓｓｅｌ　ＩＳ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　３１３　ｈｅａｌｔｈｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｅｎｒｏｌｌｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　１０１１８７５７　ａｎｄ　ｒｓ７０２７９８９　ｉｎ　ＭＴＡＰ　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＳＮＰ—ｓｔｒｅａｍ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　ｐｌａｔｆｏｒｍ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｓａｍｐｌｅ，ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｌｌｅｌｅ　ｏｆ　１０１１８７５７　ａｎｄ　ｒｓ７０２７９８９　ｌｏｃｉ．Ａｎｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｆｏｕｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｒｐｐｌｅ　ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎ—　ｄｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｎｏ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＭＴＡＰ　ｇｅｎｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ａｎｄ　ＩＳ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ；Ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ；Ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｓｔｒｏｋｅ；Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｎ　

缺血性脑卒中（ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｓｔｒｏｋｅ，ＩＳ）是一种涉及　多病因和多种生理、病理变化的慢性复杂疾病，其中　大动脉粥样硬化型ＩＳ的主要病理过程就是动脉粥　样硬化。近年来多项研究结果提示人类染色体９ｐ２１　区带的甲硫腺苷磷酸化酶（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ１ａｓｅ，ＭＴＡＰ）基因单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）同动脉粥样硬化疾　病相关＿１—３１。然而，研究发现的阳性位点不尽相同，　研究结果也缺乏验证性研究的进一步证实。本研究　

基金项目：河北省自然科学基金（编号：ｃ２０１１１Ｏ５ＯＯ３）　作者单位：０６３０００河北省唐山市，河北联合大学附属唐山市工　人医院神经内科（李映雪、李永秋）；首都医科大学附属北京天　坛医院神经内科（王拥军）　＊通讯作者　

・临床论著・　拟根据以往国内外动脉粥样硬化研究中发现的阳性　位点ｒｓ１０１１８７５７和ｒｓ７０２７９８９作为研究目标位点，　探讨其与汉族人群大动脉粥样硬化型ＩＳ的关系。　

１资料与方法　１．１一般资料　ＩＳ组：２０１３年３月１日一２Ｏ１４年５月３０日收　住唐山市工人医院神经内科的汉族ＩＳ患者２９７例　入选。诊断符合１９９５年第四届全国脑血管病会议　修订的Ｉｓ诊断标准ｌｌ４］，对所有入选患者进行　ＴＯＡＳＴ病因分型。为排除选择偏性的影响，本研究　仅选择ＴＯＡＳＴ分型为大动脉粥样硬化性Ｉｓ的汉　族患者作为研究对象。排除标准：所有人选研究病　例均除外心源性脑栓塞及患有心房纤颤、恶性肿瘤、　血液病、自身免疫性疾病、甲状腺疾病、近期内有急　中国煤炭工业医学杂志２０１５年３月第１８卷第３期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒ．２０１５，Ｖｏ１．１８，Ｎｏ．３　性感染、手术或创伤、肝肾严重疾病等的患者及应用　雌激素替代疗法的女性患者。近２周应用降脂、降　纤和／或抗凝药物。对照组：选择同期在唐山市工人　医院体检中心进行体检汉族健康受检者３１３例，所　有入选者均排除Ｉｓ、肝肾功能不全、冠心病、外周血　管病、恶性肿瘤、自身免疫病等病史。　ＩＳ组２９７例中男１７２例，女１２５例；平均年龄　（６７．３５±７．２３）岁。对照组３１３例中男１８１例，女　１３２例；平均年龄（６６．２９±９．７２）岁。二组性别和年　龄比较差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ＩＳ组的　ＢＭＩ为２５．３７±４．４２，对照组为２４．０６±４．３９，二组　比较差异有统计学意义（Ｐ＝０．０１６）；ＩＳ组的研究对　象既往存在吸烟史、高血压病病史、糖尿病病史及高　脂血症史等危险因素的比例显著高于对照组，差异　有统计学意义（Ｐ＝０．０００）；ＩＳ组研究对象既往存在　饮酒史的比例高于对照组，但是差异无统计学意义　（Ｐ＝０．０５８）（见表１）。Ｉｓ组和对照组人群在入组前　１个月内均未服用阿司匹林、华法林、氯吡格雷及他　汀类药物。　１．２标本收集与保存　所有研究对象抽取外周静脉血３ｍｌ，采用酚一　氯仿法抽提ＤＮＡ。保存于一２０。Ｃ冰箱。　１．３　ＳＮＰ分型　ＳＮＰ位点的引物由ｗｗｗ．ａｕｔｏｐｒｉｍｅｒ．ｃｏｒｎ在　线设计，上海生物工程有限公司合成。ｒｓ１０１１８７５７　游引物：　ＴＡＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＡＴＣＴＴＡＴＡＡＡＴ—　ＧＣＴＧＡ，延伸引物：ＧＧＣＴＡＴＧＡＴ　ＴＣＧＣＡＡＴ—　ＧＣＴＴＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＴＡ。　ｒｓ７０２７９８９上游引物：ＡＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴ—　ＴＧＣ，下游引物：ＴＧＴ　ＣＡＴＧＣＴＣＴＧＴＡＴＡＡＡＧ—　ＧＡＴｃＡ，　延伸引物：　ＧＴＧＡＴＴＣＴＧＴＡＣＧＴ—　ＧＴＣＧＣＣＡＣＧＴＴＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＧＣＴＧ　

。用双蒸水将ＤＮＡ稀释到１０ｎｇ／Ｆ１。将ＰＣＲ引物　及延伸引物稀释到终浓度１０Ｆｍｏｌ／Ｌ。依次加入引　物、ｄＮＴＰ、缓冲液、氯化镁、Ｔａｑ酶及稀释后的　ＤＮＡ，扩增条件：９５℃变性１５ｒａｉｎ，然后循环４０次　（９４℃变性３０ｓ、５５℃退火３０ｓ、７２℃延伸ｌｍｉｎ），最后　４￣Ｃ保温。在扩增产物中加入３　ｌ纯化液，纯化反应　条件：３７℃３０ｍｉｎ，９６℃１０ｍｉｎ，４℃保温。再向每个　样本中加入７　１引物延伸反应混合物，延伸引物，延　伸反应条件：９６℃３ｍｉｎ，然后进入４０次循环（９４℃　２０ｓ，４０℃１１ｓ），４℃保温。取１０Ｆ１延伸产物加入杂　交板，４２℃杂交２ｈ。应用ＳＮＰ　Ｓｔｒｅａｍ基因分型系　统（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｃｏｕｌｔｅｒ公司）进行扫描分析。实验所　用的ｄＮＴＰ购自ＴａＫａＲａ公司，ＰＣＲ缓冲液、氯化　镁、Ｔａｑ酶均购自Ｒｏｃｈｅ公司，其余试剂购自Ｂｅｃｋ—　ｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ公司。　１．４统计学方法　采用ＳＰＳＳ　１７．０统计软件，组间计量资料比较　用ｔ检验，不同基因型分布及等位基因频率比较用　上游引物：ＴＣＴＴＡＡＣＴＴＴＡＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧ，下　检验。检验水准ａ＝０．０５。　表１二组的一般特征（例。％）　

具有群体代表性。在总体样本中，ｒｓｌ０１１８７５７和　２　结果　ｒｓ７０２７９８９的（ＡＧ＋ＧＧ）Ｎ；ＮＮ￣Ｇ等位基因在ＩＳ　

基因型及等位基因频率分析：本研究所选取的２　组分布频率均高于对照组，但差异无统计学意义（Ｐ　个ＳＮＰ位点经检验均符合Ｈａｒｄｙ　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡，　＞０．０５）。为排除性别对统计结果的混杂影响，我们　中国煤炭工业医学杂志２０１５年３月第１８卷第３期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒ．２０１５，Ｖｏ１．１８，Ｎｏ．３　・３４７・　对研究位点的基因型和等位基因分布频率进行性别０．０５）（见表２、表３）。　分层后仍未得到差异有统计学意义的结果（均Ｐ＞　表３研究位点基因型和等位基因在不同性别中的分布频率比较（例。　）　

９７（５６．４）　１２０（６６．３）　７２（５７．６）　７７（５８．３）　９３（５４．１）　１０９（６０．２）　７１（５６．８）　８１（６１．４）　６３（３６．６）　５２（２８．７）　４６（３６．８）　５１（３８．６）　６３（３６．６）　６１（３３．７）　４２（３３．６）　４１（３１．１）　１２（７．Ｏ）　９（５．０）　７（５．６）　４（３．Ｏ）　１６（９．３）　１１（６．１）　１２（９．６）　１０（７．６）　０．３６８　０．７１８　２５７（７４．７）　２９２（８０．７）　１９Ｏ（７６．Ｏ）　２０５（７７．７）　２４９（７２．４）　２７９（７７．１）　１８４（７３．６）　２０３（７６．９）　８７（２５．３）　７０（１９．３）　

６０（２４．Ｏ）　５９（２２．３）　

９５（２７．６）　８３（２２．９）　

６６（２６．４）　６１（２３．１）