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基于16SrRNA与转录组学测序分析新型鹅细小病毒对雏鸭的致病性随着经济的快速发展和人们对食品安全的关注日益增加，农业养殖业也面临着新的挑战。
禽类疾病的爆发不仅对农民的经济利益造成了严重损失，而且还对公众的健康构成了潜在的威胁。
因此，了解和控制禽类疾病的传播途径和致病机理变得至关重要。
近年来，一种新型鹅细小病毒引起了人们的关注。
这种病毒主要感染雏鸭，并导致严重的病理症状，如呼吸困难、消化道炎症和神经系统病变。
为了深入了解这种病毒的致病机理，科学家们运用了16SrRNA测序和转录组学分析的方法。
首先，科学家们通过采集感染了新型鹅细小病毒的雏鸭组织样本，提取其中的RNA。
然后，利用16SrRNA测序技术，研究人员鉴定出了感染雏鸭的新型鹅细小病毒的基因组序列。
通过与已知的病毒数据库进行比对，他们发现这种病毒属于一种新的病毒株。
随后，科学家们利用转录组学测序技术，对感染雏鸭的组织样本进行了分析。
通过比较感染组织和健康组织的基因表达差异，他们发现感染雏鸭的新型鹅细小病毒可以显著影响宿主的基因表达水平。
特别是一些与免疫系统和炎症反应相关的基因，其表达被显著上调。
进一步的功能富集分析表明，感染雏鸭的新型鹅细小病毒还可以影响一些重要的信号通路，如NF-κB和JAK-STAT通路。
这些信号通路在免疫应答和炎症调节中起着关键作用。
因此，这些研究结果为进一步理解新型鹅细小病毒的致病机理提供了重要线索。
综上所述，基于16SrRNA与转录组学测序的分析揭示了新型鹅细小病毒对雏鸭的致病性机制。
这些研究结果对于预防和控制禽类疾病具有重要意义，为农业养殖业的可持续发展提供了科学依据。
未来的研究可以进一步探索病毒的传播途径和开发针对该病毒的疫苗和抗病毒药物。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解猫细小病毒（FPV ）在国内的流行状况及其遗传变异和演化方向，本研究对采集的30份疑似感染FPV 的肛拭子进行检测，利用常规方法从中分离并鉴定出3株FPV 。
然后扩增出3株FPV 的VP2基因，利用DNAstar 等软件将获得的VP2基因与国内外报道的流行株和疫苗株的VP2基因序列进行比对和遗传进化分析。
研究结果显示，本文分离的3株FPV 均能在猫肾细胞中良好增殖，并产生典型致细胞病变（CPE ），在电子显微镜下呈现典型的细小病毒形态特征。
序列比对结果显示，此3株FPV 的VP2序列与国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.6%~99.8%和98.5%~99.8%；与疫苗株的VP2基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%~99.4%和99.1%~99.5%；进化树分析结果显示，本研究分离的FPV 与国内流行株及疫苗株均具有较近的遗传距离，并处于同一拓朴群，但是SH612株和ZZ6293株与疫苗株的距离稍微远些，处于不同的拓朴亚群。
本文研究结果丰富了中国FPV 的流行病学资料，为进一步研发FPV 疫苗提供了参考资料。
关键词：猫细小病毒；VP2；序列同源性；遗传进化中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）02-0086-07Isolation, Identifi cation and Genetic Evolution Analysis of Three Feline Parvovirus StrainsTANG Aoxing 1, LIU Chuncao 1, WANG Zhenzhen 1,2, MENG Chunchun 1, ZHU Jie 1, TANG Jingyu 1,LI Chuanfeng 1, GUO Hongyuan 1, SONG Xinyu 3, LIU Guangqing 1(1. Small Animal Infectious Disease Prevention and Control Innovation Team, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Xinjiang Agricultural University, Xinjiang 830052, China; 3. State Key Laboratory of Animal Genetic EngineeringVaccine, Qingdao 266114, China)收稿日期：2021-06-29基金项目：上海市科技兴农项目（沪农科创字（2019）第3-3号）；国家重点研发计划项目（2016YFD0500108、2016YFD0501003）；上海市科技兴农创新项目（沪农科创字(2019)第3-3号）；动物基因工程疫苗国家重点实验室开放课题（AGVSKL-ZD-202010）作者简介：汤傲星，男，博士研究生，预防兽医学专业通信作者：刘光清，E-mail：**************.cn.3株猫细小病毒的分离鉴定及其遗传进化分析汤傲星1，刘春草1，王真真1,2，孟春春1，朱 杰1，唐井玉1，李传锋1，郭宏元1，宋新宇3，刘光清1（1.中国农业科学院上海兽医研究所 小动物传染病预防与控制创新团队，上海200241；2.新疆农业大学，乌鲁木齐830052；3.动物基因工程疫苗国家重点实验室，青岛266114）2023,31(2):86-92Abstract: To understand the domestic prevalence of Feline p arvovirus (FPV) and its genetic variation and evolution, 30 anal swabs suspicious of FPV infection were collected for virus isolation. As a result, 3 FPV isolates were obtained and their VP2 gene was sequenced by PCR. Then VP2 gene homology of the epidemic strains and vaccine strains reported in the literature were aligned for genetic evolution analysis. The results showed that the VP2 gene of these 3 isolates had nucleotide and amino acid sequence identities at 98.6%-99.8% and 98.5%-99.8% with domestic/international reference strains and at 99.1%-99.4% and 99.1%-99.5% with the domestic vaccine strain. Furthermore, phylogenic tree analysis showed that these 3 isolates were grouped in the same branch as the domestic epidemic and vaccine strains except that the SH612 and ZZ6293 isolates are not in the same branch as the domestic vaccine strain. These results showed that the domestic FPV was obviously experiencing evolutionary trend, which was the reason why traditional vaccines couldn’t achieve good· 87 ·汤傲星等：3株猫细小病毒的分离鉴定及其遗传进化分析第31卷第2期 猫细小病毒（ F eline parvovirus, FPV）俗称猫瘟病毒，是一种可感染猫科动物的常见病原体，属于细小病毒科。
鹅细小病毒vp3基因PCR检测方法的建立及应用
张颖;高旭;鲁承;赵文婧
【期刊名称】《吉林农业：学术版》
【年(卷),期】2012(000)001
【摘要】本试验根据GenBank上发表的鹅细小病毒B株基因序列，针对vp3基
因设计并合成了一对特异性引物，建iGPVvp3基因的PCR诊断方法。
结果表明，该方法扩增的产物与预期大小相符（约654bp），而其他相关病毒均为阴性反应，敏感度为12．4pg。
对15份GPV疑似病例检出的阳性率为100％，而琼脂扩散试验（AGP）检出的阳性率为60％。
证明建立的PCR方法特异性强、敏感性高，可用于临床病料的快速诊断。
【总页数】1页(P169-169)
【作者】张颖;高旭;鲁承;赵文婧
【作者单位】延边大学农学院动物医学系,吉林延吉133400
【正文语种】中文
【中图分类】S835
【相关文献】
1.鹅细小病毒PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 王倩;鞠环宇;荆志强;李彦伟;王春媛;马波;王君伟
2.鹅细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 [J], 高旭;鲁承;杜秋明
3.鹅细小病毒PCR检测方法的建立及应用 [J], 邵洪泽;李琳;毛文智;辛英;姚新华
4.鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用 [J], 董浩;徐楠楠
5.鹅星状病毒、鹅细小病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 苗艳;朱庆贺;陈亮;兰世捷;冯万宇;李丹;黄宝银;沈思思;史同瑞
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新型鹅细小病毒信阳株的全基因组扩增及遗传进化分析焦凤超;张鑫;李迎晓;雷震;曲哲会;董建国;赵瑜;何书海;李洵;黄立;赵聘【期刊名称】《畜牧与兽医》【年(卷),期】2023(55)1【摘要】为了解信阳地区新型鹅细小病毒(NGPV)的遗传变异特性,对疑似NGPV 感染麻鸭病例进行病原检测,采集肝脏和脾脏无菌处理后接种SPF鸭胚,成功分离到1株NGPV,命名为HNXY21株,并对其进行全基因组序列分析和VP1基因重组鉴定。
序列比对和系统发育树表明,分离株HNXY21和其他9株NGPV同处于鹅细小病毒(GPV)组内的一个独立分支上,与山东分离株SD0316(GenBank登录号:MN415969)核苷酸同源性最高;VP1蛋白的氨基酸序列分析显示,与经典GPV 和番鸭细小病毒(MDPV)相比,有8个氨基酸位点突变;通过Simplot软件对VP1基因进行重组分析表明,分离株HNXY21 VP1基因存在重组信号,其潜在的主要亲本为山东分离株SD0316和弱毒疫苗株SYG61v。
本研究结果丰富了NGPV的分子生物学资料,为进一步研究NGPV的致病机制奠定了基础。
【总页数】8页(P112-119)【作者】焦凤超;张鑫;李迎晓;雷震;曲哲会;董建国;赵瑜;何书海;李洵;黄立;赵聘【作者单位】信阳农林学院/河南省水禽资源开发利用与疫病防控工程技术研究中心【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.新型鹅细小病毒四川株的全基因组扩增及遗传进化分析2.5株鹅细小病毒分离鉴定及VP3基因遗传进化分析3.江苏省盐城市3株白羽肉鸭源鹅细小病毒的分离鉴定及其VP3基因遗传进化分析4.东北地区3株猪细小病毒7型毒株基因组测定及遗传进化分析5.2株鸭源新型鹅细小病毒分离鉴定及遗传进化分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物医学进展,２０１８,３９(６):２０Ｇ２３P r o g r e s s i nV e t e r i n a r y Me d i c i n e 新型鸭细小病毒V P ３基因克隆与原核表达㊀收稿日期:２０１７Ｇ０９Ｇ０４㊀基金项目:河北省高校百名优秀创新人才支持计划(S L R C ２０１７０３９);国家重点研发计划项目(２０１７Y F D ０５００８０６)㊀作者简介:经㊀美(１９９２－),女,河北三河人,硕士,主要从事预防兽医学研究.ә同等贡献作者.∗通讯作者经㊀美１ә,王建昌２ә,崔㊀元１,李晓轩１,陈㊀萍１,王金凤２,侯绍华３,孙继国１,４,袁万哲１,４∗(１．河北农业大学动物医学院,河北保定０７１００１;２．河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心,河北石家庄０５００５１;３．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京１００１９３;４．河北省兽医生物技术工程技术研究中心,河北保定０７１００１)㊀㊀摘㊀要:应用P C R 方法扩增新型鸭细小病毒(N D P V )V P ３基因,将其克隆至原核表达载体p Q E １中,获得重组质粒p Q E １ＧV P ３.重组质粒p Q E １ＧV P ３经优化诱导表达后,通过S D S ＧP A G E 对表达产物进行分析并利用H i s 标签抗体对表达的蛋白进行W e s t e r nb l o t 鉴定.结果表明,N D P V V P ３蛋白在２５ħ㊁I P T G 浓度为１．０mm o l /L 经诱导５h ,可获得最大诱导表达量,表达蛋白的分子质量约为６０k u,主要以不溶性包涵体形式存在.纯化复性后,可获得浓度为５．１６５m g/m L 及纯度为９７％的V P ３蛋白.获得的重组菌p Q E １ＧV P ３以及高纯度的V P ３蛋白,为进一步研究N D P V 检测方法和新型疫苗奠定了基础.㊀㊀关键词:鸭细小病毒;V P ３;原核表达中图分类号:S ８５２．６５文献标识码:A 文章编号:１００７Ｇ５０３８(２０１８)０６Ｇ００２０Ｇ０４㊀㊀２０１４年１１月以来,我国山东㊁河北和安徽等地商品肉鸭群发生了以雏鸭发育迟缓㊁上下喙萎缩㊁舌头外伸为特征的疾病,养殖户俗称为 鸭长舌病 或 鸭大舌病 .该病多发生于１０日龄~３０日龄的肉鸭,发病率为５％~１０％,患鸭后期瘫痪,不愿活动,部分患鸭因无法进食而死亡[１Ｇ２].大多数患鸭出栏体重较健康鸭降低２０％~３０％,严重者仅为正常体重的５０％.患鸭在抓捕㊁屠宰过程中胫骨等易发生骨折.根据其临床表现,该病又被称为 鸭短喙Ｇ侏儒综合征.目前已经确定该病的病原为新型鸭细小病毒(N o v e l d u c k p a r v o v i r u s ,N D P V )[１Ｇ２].N D P V 与鹅细小病毒的亲缘关系较近,具有相似的基因组组成与结构.全基因组中包含２个主要的开放阅读框(O R F ),左侧O R F 编码非结构蛋白N S １和N S ２,右侧O R F 编码结构蛋白V P １㊁V P ２和V P ３[３].其中,V P ３蛋白是N D P V 的主要衣壳蛋白,含有病毒主要的抗原表位成分,是主要的保护性抗原,能诱导机体产生具有中和作用的抗体[４].本研究对新型鸭细小病毒S D 株的V P ３基因进行了克隆,对其原核表达条件进行了探索和优化,为进一步研究N D P V 抗体检测方法和新型疫苗奠定基础.１㊀材料与方法１．１㊀材料N D P V ＧS D 株由本实验室分离并保存;２ˑT r a n s T a qH i F iP C RS u p e r M i x Ⅰ㊁E x n a s e T M Ⅱ和５ˑC EⅡb u f f e r 购自武汉品生科技有限公司;E a s yP u r eV i r a lD N A /R N A K i t 购自北京全式金生物技术有限公司;R o s e t t a ２(D E ３)p L y S s ㊁T o p １０感受态和琼脂糖凝胶D N A 回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;６ˑH i s ,H i s ＧT a q M o n o c l o n a l A n t i b o d y 购自P r o t e i n t e c h 公司;N i ＧA g a r o s eH i s 标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司.１．２㊀方法１．２．１㊀引物设计㊀根据G e n B a n k 上登录的S D L C ０１株基因序列(G e n B a n k :K T ００１２０３),应用P r i m e r ５．０软件设计１对特异性引物,在引物序列中引入５ᶄl i n k e r 和３ᶄl i n k e r,便于后续与表达载体的重组反应.引物序列如下:上游引物P １:５ᶄＧG G G T C CA G CG G CG C T G G A T C CA T G G C A G A G G G AG G A G G CG G Ｇ３ᶄ;下游引物P ２:５ᶄＧC G C T C C A C TG C CT C CT G C A G CC T A C A G A T T T T G A G T T A G A T A Ｇ３ᶄ.预期扩增的片段大小约为１６５３b p,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.１．２．２㊀V P ３基因的扩增㊀利用E a s yP u r e V i r a l D N A /R N A K i t 提取鸭胚分离毒S D 株的总D N A ,以此D N A 为模板进行V P ３基因扩增.P C R 扩增体系为:上㊁下游引物(１０μm o l /L )各１μL ,P r i m e r ＧS T A R M a x (２ˑ)２５μL ,模板１μL ,加d d H ２O 补充至５０μL .P C R 反应条件:９８ħ１m i n ;９８ħ１０s,６０ħ１０s ,７２ħ５０s ,共３５个循环;７２ħ延伸２m i n .扩增产物经２０g /L 琼脂糖凝胶电泳后,利用琼脂糖凝胶D N A 回收试剂盒回收纯化目的基因.１．２．３㊀重组质粒p Q E １ＧV P ３的构建与原核表达㊀将V P ３目的基因与p Q E １载体按一定比例进行重组,测序正确的质粒被命名为p Q E １ＧV P ３.将阳性重组质粒p Q E １ＧV P ３转化至感受态细胞中,将重组菌于３７ħ培养至O D ６００n m 值约为０．６,加入I P T G ,使其终浓度分别为０㊁０．２㊁０．４㊁０．６㊁０．８㊁１．０㊁１．２㊁１．４mm o l /L ,诱导表达５h ,确定最适的I P T G 诱导浓度;在最适I P T G 诱导浓度下,分别诱导表达０㊁１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８h ,确定最佳的诱导时间;在最适I P T G 浓度和最佳诱导时间下,分别在２０ħ㊁２５ħ㊁３０ħ㊁３７ħ诱导,确定最佳诱导温度.菌液经超声波破碎后,收集上清和沉淀进行S D S ＧP A G E 检测.１．２．４㊀V P ３蛋白的纯化㊁复性及W e s t e r nb l o t 鉴定㊀用N i ＧA g a r o s e H i s 标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,将纯化蛋白在含G S H ＧG S S G 的P B S 复性缓冲液中按１ʒ１稀释装入透析袋中,将透析袋放入复性缓冲液中按透析袋内外液体１ʒ２０的比例透析复性２４h ,用N a n o d r o p 测定复性蛋白的浓度和纯度.将纯化的蛋白经１２０g /LS D S ＧP A G E 电泳后转膜,用５０g/L 脱脂牛奶过夜封闭后,以１ʒ１００００稀释H i s 标签抗体室温孵育１h ,洗膜后D A B 避光显色.２㊀结果２．１㊀目的基因P C R 扩增结果经P C R 扩增的V P ３基因在大约１６００b p 处出现明显的目的条带,与预期的大小(１６５３b p )相符(图１).表达载体p Q E １在大约５４００b p 处有明显条带,与预期的大小(５４０７b p )相符(图２).M．D N A 标准;１．新型鸭细小病毒V P ３基因M．D N A M a r k e r ;１．N D P V V P ３g e n e图１㊀V P ３基因的P C R 扩增F i g ．１㊀P C Ra m pl i f i c a t i o no fV P ３g e ne M．D N A 标准;１．线性化载体p Q E １M．D N A M a r k e r ;１．l i n e a r i z e dv e c t o r p Q E １图２㊀表达载体p Q E １的P C R 扩增F i g ．２㊀P C Ra m p l i f i c a t i o no f e x pr e s s i o nv e c t o r p Q E １２．２㊀重组质粒p Q E １ＧV P ３的菌液P C R 鉴定重组质粒p Q E １ＧV P ３转入T o p １０菌株后,经菌液P C R 鉴定,在大约１６００b p 处有明显条带,大小与预期的１６５３b p 相符(图３).M．D N A 标准;１~８．pQ E １ＧV P ３基因M．D N A M a r k e r ;１Ｇ８:pQ E １ＧV P ３g e n e 图３㊀重组质粒p Q E １ＧV P ３的菌液P C R 鉴定F i g．３㊀M i c r o b i a l P C R i d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t pl a s m i d p Q E １ＧV P ３２．３㊀表达产物的S D S ＧP A G E 分析S D S ＧP A G E 分析表明V P ３基因可得到表达,蛋白分子质量约为６０k u .V P ３蛋白在２５ħ㊁１．０mm o l /LI P T G 条件下诱导５h 获得最大表达量,而未诱导的菌样未出现条带(图４~图６).可溶性分析表明,重组蛋白以不溶性的包涵体形式存在于菌体中(图７).２．４㊀重组V P ３蛋白的纯化复性及W e s t e r nb l o t 鉴定分析㊀㊀经N i ＧA g a r o s e H i s 标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,纯化的蛋白经含G S H ＧG S S G 的P B S 复性缓冲液透析复性,复性条带大小与预期目的条带相符(图８),用N a n o d r o p 测定复性蛋白的浓度为５．１６５m g/m L 和纯度为９７％.纯化后的目的蛋白经S D S ＧP A G E 后转移至硝酸纤维素膜上,进行W e s t e r nb l o t 检测(图９),约６０k u 处可见有一条明显的蛋白印迹带,由此说明表达的重组蛋白具有良好的反应原性.１２经㊀美等:新型鸭细小病毒V P ３基因克隆与原核表达M．蛋白分子质量标准;１．p E Q １ＧV P ３空质粒;２~９．p E Q １ＧV P ３质粒经１㊁２㊁３㊁４㊁５㊁６㊁７㊁８h 诱导M．P r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t M a r k e r ;１．pE Q １ＧV P ３p l a s m i d ;２Ｇ９．pE Q １ＧV P ３i n d u c e d i n１,２,３,４,５,６,７,８h 图４㊀不同时间p E Q １ＧV P ３诱导表达S D S ＧP A G E 检测F i g．４㊀S D S ＧP A G Ed e t e c t i o no f P E Q １ＧV P ３i n d u c e d i nd i f f e r e n t t i me M．蛋白分子质量标准;１~８．I P T G 浓度分别为０㊁０．２㊁０．４㊁０．６㊁０．８㊁１．０㊁１．２㊁１．４mm o lM．P r o t e i n m o l e c u l a r w e i gh t M a r k e r ;１Ｇ８．I P T G c o n c e n t r a t i o n s０,０．２,０．４,０．６,０．８,１．０,１．２,１．４mm o l r e s p e c t i v e l y图５㊀不同I P T G 浓度p E Q １ＧV P ３诱导表达S D S ＧP A G E 检测F i g．５㊀S D S ＧP A G Ed e t e c t i o no f P E Q １ＧV P ３i n d u c e d i n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f I P TGM．蛋白分子质量标准;１．２０ħ,２．２５ħ,３．３０ħ,４．３７ħM．P r o t e i nm o l e c u l a rw e i gh tM a r k e r ;１．２０ħ,２．２５ħ,３．３０ħ,４．３７ħ图６㊀不同温度p E Q １ＧV P ３诱导表达S D S ＧP A G E 检测F i g．６㊀S D S ＧP A G Ed e t e c t i o no f P E Q １ＧV P ３i n d u c e d i n d i f f e r e n t t e m pe r a t u re M．蛋白分子质量标准;１．诱导５h 的沉淀,２．诱导５h 的上清M．P r o t e i n m o l e c u l a rw e i gh t M a r k e r ;１．S e d i m e n t ai n d u c e di n５h ;２．S u pe m a t a n t i n d u c e d i n５h 图７㊀p E Q １ＧV P ３可溶性分析F i g ．７㊀S o l u b i l i t y a n a l ys i s o f p E Q １ＧV P３M．蛋白分子质量标准;１．目的蛋白M．P r o t e i nm o l e c u l a rw e i gh tM a r k e r ;１．I n t e r e s t p r o t e i n 图８㊀蛋白复性的结果F i g．８㊀T h e r e s u l t s o f p r o t e i n r e n a t u r a t i on M．蛋白分子质量标准;１．纯化蛋白M．P r o t e i nm o l e c u l a rw e i gh tM a r k e r ;１．P u r i f i e d p r o t e i n 图９㊀融合蛋白H i s 标签的W e s t e r nb l o t 鉴定F i g ．９㊀I d n t i f i c a t i o no f f u s i o n p r o t e i nH i s Ｇt a g b yW e s t e r nb l o t３㊀讨论水禽类细小病毒主要包括鹅细小病毒(G o o s ep a r v o v i r u s ,G P V )和番鸭细小病毒(M u s c o v y d u c k pa r v o v i r u s ,M D P V ),该病毒属于细小病毒科(P a r Ｇv o v i r i d a e )㊁细小病毒亚科(P a r v o v i r i n a e )㊁依赖细小病毒属成员[５].为单股线性D N A 病毒,全基因组长５０５０n t.其基因组主要包含左右２个开放性２２动物医学进展㊀２０１８年㊀第３９卷㊀第６期(总第３００期)阅读框,分别为N S 基因和V P 基因,阅读框两侧均有末端反向重复序列.细小病毒编码蛋白共５种,分别为V P １㊁V P ２和V P ３结构蛋白及非结构蛋白N S １和N S ２[６].V P ３蛋白在３种结构蛋白中数量最多,约占衣壳蛋白总量的８０％[７],其分子质量约为５８k u ,编码基因长度为１６０５n t .V P ３蛋白为抗原决定簇的主要成分,构成细小病毒的保护性抗原,说明V P ３蛋白具有良好的免疫原性.因此,V P ３蛋白是G P V 和M D P V 基因工程疫苗的首选靶基因[８].曾将本实验室分离的S D 株与M D P V 和G P V进行同源性分析,发现与G P V 有较近的亲缘性,核苷酸序列进行同源性比对结果可达９２．７％~９９．８％,而与M D P V 的同源性相对较低,在７９．８％~８４．４％之间.该分离株为鸭源G P V ,通过基因进化分析表明该分离株为G P V 的变异株[９].与G P V 比较,该毒株变异主要发生在３ᶄＧU T R 端,１６０Ｇ１７６与３０６Ｇ３２２n t 发生缺失(未发表).鉴于N D P V 所致疫病是一种新发现的鸭类传染病,本研究采用q R e x 重组酶体系方法,将V P ３基因克隆至原核表达载体p E Q １中,构建一种可高效表达蛋白的重组菌p Q E １ＧV P ３,并对其诱导表达条件进行优化,获得了在温度为２５ħ㊁１mm o l /L 的I P T G 浓度下诱导５h 的最大诱导表达量的方法.同时,本研究也对重组蛋白的可溶性进行了分析,发现重组的V P ３蛋白以不溶性包涵体的形式表达蛋白.经过纯化和复性可得到浓度为５．１６５m g /m L 的V P ３蛋白,其纯度可达９７％.在W e s t e r nb l o t 鉴定下,可见６０k u 处有明显的蛋白印迹条带.表明V P ３蛋白在原核表达系统中可高效表达,并且复性的蛋白具有良好的反应原性.获得的重组菌p Q E １ＧV P ３以及高纯度的V P ３蛋白,可用于建立N D P VE L I S A 检测方法以及开发新型疫苗.参考文献:[１]㊀宁㊀康,王㊀丹,王府民,等．樱桃谷北京鸭短喙和侏儒综合征的初步研究[J ]．中国兽医杂志,２０１５(１０):１０Ｇ１３,５０．[２]㊀袁万哲,崔㊀元,经㊀美,等．鸭短喙Ｇ侏儒综合征研究初报[J ]．中国动物保健,２０１６,１８(５):７３Ｇ７４[３]㊀Z a d o r i Z ,E r d e J ,N a g y J ,e t a l ．C h a r a c t e r i s t i c so f t h e g e n o m eo f go o s e p a r v o v i r u s [J ]．A v i a nP a t h o l ,１９９４,２３(２):３５９Ｇ３６４．[４]㊀Y i nX ,Z h a n g S,G a oY ,e t a l ．C h a r a c t e r i z a t i o n o fm o n o c l o n a l a n Ｇt i b o d i e s a ga i n s tw a t e r f o w lV P ３p a r v o v i r u s e s p r o t e i n [J ]．V i r o l J ,２０１２,(９):２８８．[５]㊀李㊀琦,李传峰,唐井玉,等．新型鸭细小病毒V P ３基因的原核表达及多克隆抗体的制备[J ]．中国兽医科学,２０１６,４６(６):７１７Ｇ７２２．[６]㊀黄㊀瑜,朱于敏,董世娟,等．雏番鸭细小病毒V P ３基因的原核表达及增殖病毒的检测[J ]．生物工程学报,２０１５,３１(１):６５Ｇ７４．[７]㊀W a n g C Y ,S h i e n H K ,S h i e nJ H ,e ta l ．E x p r e s s i o no f c a ps i d p r o t e i n a n dn o n Ｇs t r u c t u r a l p r o t e i n s o fw a t e r f o w l p a r o v i r u s e s i n E s c h e r i c h i a c o l i a n dt h e i ru s e i ns e r o l o g i c a la s s a y s [J ]．A v i a n P a t h o l ,２００５,３４(５):３７６Ｇ３８２．[８]㊀张㊀云,耿宏伟,郭东春,等．鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析[J ]．中国预防兽医学报,２００８,３０(６):４１５Ｇ４１８．[９]㊀崔㊀元,王建昌,李玉保,等．鸭短喙Ｇ侏儒综合征及其病原的初步研究[J ]．中国预防兽医学报,２０１６,３８(５):３４８Ｇ３５１．C l o n i n g a n dP r o k a r y o t i cE x pr e s s i o n o fV P ３G e n e o fN o v e l D u c kP a r v o v i r u s J I N G M e i １,WA N GJ i a n Ｇc h a n g ２,C U IY u a n １,L IX i a o Ｇx u a n １,C H E NP i n g １,WA N GJ i n Ｇf e n g ２,HO US h a o Ｇh u a ３,S U NJ i Ｇgu o １,４,Y U A N W a n Ｇz h e １,４(１．C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,A g r i c u l t u r eU n i v e r s i t y o f H e b e i ,B a o d i n g ,H e b e i ,０７１００１,C h i n a ;２．I n s p e c t i o na n dQ u a r a n t i n eT e c h n i c a lC e n t e r o f H e b e iE n t r y ＧE x i t I n s p e c t i o na n dQ u a r a n t i n eB u r e a u ,S h i j i a z h u a n g ,H e b e i ,０５００５１,C h i n a ;３．B e i j i n g I n s t i t u t e o f A n i m a lH u s b a n d r y a n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,C h i n e s eA c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,B e i j i n g ,１００１９３,C h i n a ;４．H e b e iE n g i n e e r i n g a n dT e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r o f V e t e r i n a r y B i o t e c h n o l o g y ,B a o d i n g ,H e b e i ,０７１００１,C h i n a )A b s t r a c t :I n t h i s r e s e a r c h ,V P ３g e n eo fn o v e l d u c k p a r v o v i r u s (N D P V )w a sa m p l i f i e db y PC Ra n dc l o n e d i n t o t h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p Q E １．T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p Q E １ＧV P ３w a s o pt i m i z e d i n i n d u c e d e x p r e s s i o n c o n d i t i o n s ．T h e e x p r e s s e d p r o d u c t sw e r e a n a l y z e db y SD S ＧP A GE ．R e s u l t s s h o w e d t h a tV P ３p r o Ｇt e i no fN D P V w a s e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y i n p r o k a r y o t i c c e l l s ．T h e p r o t e i nc o u l do b t a i n m a x i m u me x pr e s Ｇs i o na t ２５ħa n d ６h o u rw h e n t h e c o n c e n t r a t i o no f I P T G w a s １．０mm o l /L ．T h em o l e c u l a rw e i gh t o f t h e e x Ｇp r e s s e d p r o t e i nw a s a b o u t ６０k u ,m a i n l y e x i s t e d i n t h e f o r mo f i n s o l u b l e i n c l u s i o nb o d y．A f t e r p u r i f i c a t i o n ,t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d p u r i t y w e r e r e s p e c t i v e l y ５．１６５m g /m La n d ９７％．I n c o n c l u s i o n ,V P ３p r o t e i n o f N D P V w a s e f f i c i e n t l y e x p r e s s e d i n p r o k a r y o t i c c e l l s a n dw h i c h l a i d t h e f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r s t u d y onN D ＧP Vd e t e c t i o nm e t h o d s a n dn e wv a c c i n e ．K e y wo r d s :D u c k p a r v o v i r u s ;V P ３;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ３２经㊀美等:新型鸭细小病毒V P ３基因克隆与原核表达。
鹅细小病毒长春分离株主要结构蛋白(VP2-VP3)基因的原核表达李雪梅;章金刚;向华;陈晓月;金宁一;费恩阁【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2002(013)005【摘要】根据国外已发表的鹅细小病毒(GPV)A株基因组核苷酸序列,设计并合成了一对用于GPV主要结构蛋白(VP2-VP3)基因表达的引物.利用合成的引物,扩增并鉴定了GPV中国长春株(GPV CC株)的VP2-VP3基因.将扩增的目的基因插入到原核表达载体pET28(a)的多克隆位点,构建了表达GPV VP2-VP3基因的原核载体pEGVP1.重组表达载体质粒转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测到大小分别为75 000和58000的表达蛋白带.Westem blot分析表明,表达产物具有很好的特异性.【总页数】3页(P331-333)【作者】李雪梅;章金刚;向华;陈晓月;金宁一;费恩阁【作者单位】解放军军需大学,动物科技系,长春,130062;清华大学,结构生物学实验室,北京,100084;解放军军需大学,动物科技系,长春,130062;军事医学科学院,输血医学研究所,北京,100850;解放军军需大学,动物科技系,长春,130062;解放军军需大学,动物科技系,长春,130062;解放军军需大学,军事兽医研究所,长春,130062;解放军军需大学,动物科技系,长春,130062【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.鹅细小病毒辽宁株主要结构蛋白基因的克隆及遗传进化分析 [J], 陈晓月;梁华;刘明春;王建民;于立辉;范宏发;赵玉军2.2株鹅细小病毒的主要结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析 [J], 胡晓静;潘杰;陈进喜;付薇;徐贤坤;何丹;刘棋;熊毅3.鹅细小病毒国内分离株主要结构蛋白（VP2-VP3）基因的克隆和序列分析 [J], 李雪梅;章金刚;向华;马君;陈晓月4.鹅细小病毒JLDA株主要结构蛋白VP3基因的克隆及序列分析比较 [J], 李琳;王楠;邵洪泽;辛英;姚新华;毛文智5.鹅细小病毒主要结构蛋白基因的扩增、克隆与原核表达载体的构建 [J], 马君;章金钢;李雪梅;向华;马凤龙;赵玉军;殷震因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
新型鸭细小病毒VP3基因克隆与原核表达经美;王建昌;崔元;李晓轩;陈萍;王金凤;侯绍华;孙继国;袁万哲【摘要】In this research ,VP3 gene of novel duck parvovirus (NDPV ) was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vectorpQE1 .The recombinant plasmid pQE1-VP3 was optimized in in-duced expression conditions .The expressed products were analyzed by SDS-PAGE .Results showed that VP3 protein of NDPV was expressed successfully in prokaryotic cells .The protein could obtain maximum expression at 25℃ and 6 hour when the concentration of IPTG w as 1 .0 mmol/L .The molecular weight of the expressed protein was about 60ku ,mainly existed in the form of insoluble inclusion body .After purifi-cation ,the protein concentration and purity were respectively5 .165mg/mL and 97% .In conclusion ,VP3 protein of NDPV was efficiently expressed in prokaryotic cells and which laid the foundation for further study on NDPV detection methods and new vaccine .%应用PCR方法扩增新型鸭细小病毒(NDPV )VP3基因,将其克隆至原核表达载体pQE1中,获得重组质粒pQE1-VP3 .重组质粒pQE1-VP3经优化诱导表达后,通过SDS-PAGE对表达产物进行分析并利用His标签抗体对表达的蛋白进行Western blot鉴定.结果表明,NDPV VP3蛋白在25℃、IPTG浓度为1 .0 mmol/L经诱导5 h ,可获得最大诱导表达量,表达蛋白的分子质量约为60 ku ,主要以不溶性包涵体形式存在.纯化复性后,可获得浓度为5 .165 mg/mL 及纯度为97% 的VP3蛋白.获得的重组菌pQE1-VP3以及高纯度的VP3蛋白,为进一步研究NDPV检测方法和新型疫苗奠定了基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)006【总页数】4页(P20-23)【关键词】鸭细小病毒;VP3;原核表达【作者】经美;王建昌;崔元;李晓轩;陈萍;王金凤;侯绍华;孙继国;袁万哲【作者单位】河北农业大学动物医学院,河北保定071001 ;河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心,河北石家庄050051 ;河北农业大学动物医学院,河北保定071001 ;河北农业大学动物医学院,河北保定071001 ;河北农业大学动物医学院,河北保定071001 ;河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心,河北石家庄050051 ;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193 ;河北农业大学动物医学院,河北保定071001 ;河北省兽医生物技术工程技术研究中心,河北保定071001;河北农业大学动物医学院,河北保定071001 ;河北省兽医生物技术工程技术研究中心,河北保定071001【正文语种】中文【中图分类】S852.652014年11月以来，我国山东、河北和安徽等地商品肉鸭群发生了以雏鸭发育迟缓、上下喙萎缩、舌头外伸为特征的疾病，养殖户俗称为“鸭长舌病”或“鸭大舌病”。
猪细小病毒YL株序列分析及其VP2基因原核表达时乐;黄勇;许信刚;童德文【摘要】In order to study the molecular biology of PPV, the complete genome of porcine parvovirus (PPV) was amplified using polymerase chain reaction (PCR) method and cloned. The DNA fragment was sequenced and compared with reference porcine parvovirus. In addition, the major eptiope domain of porcine parvovirus structural gene VP2 was amplifiedby polymerase chain reaction (PCR) and inserted into the expression plasmid, pET-32a, then the recombination was induced by IPTG in Esche-richia coli BL21. The NS1 gene between PPV YI- strain and other porcine parvovirus strains showed 97. 8%-99. A% and 96. 7%- 99. 5% identities at nucleotide and amino acid levels respectively. The VP2 genes showed 98. 7% - 99. 7% and 97. 4% - 99. 8% homologies at nucleotide and amino acid levels respectively. The genetic relationship of PPV YL strain with BQ strain was the closest. SDS-PAGE and Western blotting analysis revealed that the recombinant protein was 56 ku. Biological activity of the recombinant protein was detected by Western blotting. The results can be applied inthe genetic variation and differential diagnosis of PPV.%为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列.另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达.序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NSI基因核苷酸同源性为97.8％～99.4％,氨基酸同源性为96.7％～99.5％,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸司源性为98.7％～99.7％,氨基酸同源性为97.4％～99.8％.进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近.SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56 ku,经Western blotting检测具有生物学活性.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2012(021)006【总页数】7页(P6-12)【关键词】猪细小病毒;NSI基因;VP2基因;序列分析;原核表达【作者】时乐;黄勇;许信刚;童德文【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S813.3猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是一种自主型细小病毒，属于DNA病毒，无囊膜，球形或六角形，病毒粒子22nm左右，二十面体对称［1－2］，是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一，可导致母猪流产，产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪，而母猪本身并不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状，此外PPV还与非化脓性心肌炎、皮炎、肠炎及病毒血症等有关［1，3］。
