四川理工学院制药分离工程实验指导
第一版
制药工程系编
二○一二年
目录
实验一细胞SOD的提取和分离.............................................................................................. - 1 - 实验二大枣中多糖的提取分离.. (3)
实验三有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶 (5)
实验四柱层析法对色素的提取与分离 (7)
实验五质粒的提取及电泳分离 (9)
实验六八角茴香油的提取与检识 (11)
实验七秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离与鉴定 (14)
实验八大孔吸附树脂分离纯化白头翁皂苷 (16)
实验九重结晶及过滤 (18)
实验十简单蒸馏及分馏 (3)
实验一细胞SOD的提取和分离
一、实验目的
1．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。
2．掌握SOD酶提取分离的一般步骤。
二、实验原理
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。
三、试剂与仪器
1.试剂与材料
新鲜蒜瓣、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 、丙酮：用前需预冷至4-10℃、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）、0.1mol/LEDTA溶液、2mmol/L肾上腺素溶液
2. 仪器
恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒
四、实验步骤
1. 组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2. SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3. 除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4. SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。
5. SOD活力测定
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度。对照管和样品管的光密度值分别为A和B。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：
酶活力（单位）=2（A-B）N/A
式中，N——样品稀释倍数；2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数。
五、实验结果
根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。
六、注意事项
1. 酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。
2. 肾上腺素容易被氧化，故操作时要尽量快。
以对单糖混合液进行分离。以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系
七、思考题
1.计算出每500g大蒜蒜瓣所制备出的SOD酶的克数。
2.讨论有机溶剂沉淀法与盐析法相比的优缺点。
实验二大枣中多糖的提取分离
一、实验目的
1、学习多糖的提取分离方法及工艺
2、熟悉萃取、离心、蒸发、干燥等单元操作
3、掌握苯酚硫酸法鉴定多糖的方法。
二、实验原理
多糖化合物作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞．提高机体的免疫功能，对正常的细胞没有毒副作用，在临床上用来治疗恶性肿瘤、肝炎等疾病。大分子植物多糖如淀粉、纤维素等多不溶于水，且在医药制剂中仅用作辅料成分，无特异的生物活性。而目前所研究的多糖，因其分子量较小，多可溶于水，因其极性基团较多，故难溶于有机溶剂。
多糖的提取方法通常有以下三种。
(1)直接溶剂浸提法：这也是传统的方法，在我国已有几千年历史，如中药的煎煮、中草药有效成分的提取。该方法具有设备简单、操作方便、适用面广等优点。但具有操作时间长、对不同成分的浸提速率分辨率不高、能耗较高等缺点。
(2)索氏提取法：在有效成分提取方面曾经有过较为广泛的应用，其提取原理：在索氏提取中，基质总是浸泡在相对比较纯的溶剂中，目标成分在基质内、外的浓度梯度比较大；在回流提取中．溶液处于沸腾状态，溶液与基质间的扰动加强，减少了基质表面流体膜的扩散阻力，根据费克扩散定律，由于固体颗粒内外浓度相差比较大，扩散速率较高，达到相同浓度所需时间较短，且由于每次提取液为新鲜溶剂，能提供较大的溶解能力，所以提取率较高。但索氏提取法溶剂每循环一次所需时间较长，不适合于高沸点溶剂。
(3)新型提取方法：随着科学技术的发展，近年出现了一些新的提取方法和新的设备，如超声波提取、微波提取以及与膜分离集成技术，极大地丰富了中草药药用成分提取理论。此外还有透析法、柱色谱法、分子筛分离法及中空纤维超滤法等。
可根据原料及多糖的特点，设计不同的提取工艺。本实验采用直接溶剂浸提法提取大枣多糖。
三、试剂与仪器
试剂：大枣，无水乙醇，浓硫酸，苯酚（常压蒸馏，收集182℃馏分），蒸馏水。
仪器：电热恒温水浴锅，磁力搅拌器，电子天平，真空干燥箱，低速离心机，旋转蒸发仪，家用多功能粉碎机；锥形瓶，量筒，容量瓶，试管，移液管，玻璃棒，烧杯、蒸馏头。
四、实验步骤
(1)大枣多糖的提取
