高通量测序原理篇-IonTorrent测序原理篇3Ion T orrent测序芯片是一个半导体芯片，上面做了数以百万、千万计的小孔。
它每个小孔的即是测序微珠的容器，又同时是一个微型的PH计。
每个小孔正好可以容纳一个测序微珠。
在测序过程当中，就是通过测量、并记录每个小孔中所发生的PH 值的变化，来测出DNA序列的。
每个芯片都会有一个进口，还会有一个出口，是走液流用的。
在测序珠子上机的时候，就从进口把珠子的混悬液注入到芯片上，然后再把这个芯片离心一下。
离心的作用，是更好地把珠子卡到小孔中去。
Ion Torrent的测序原理是：每个dNTP分子都有3个磷酸基团，当dNTP被聚合酶结合到DNA链上时，会掉下来一个分子的焦磷酸，1个焦磷酸分子会被酶再进一步分解成2个磷酸分子。
这样在测序的微环境中，就会多出两个酸性分子。
一个珠子上有几千、几百条DNA链，每次发生聚合反应，就会多出几千、几百个酸分子。
这样，这个为缓解的PH值就会短暂地下降。
这时候，Ion Torrent芯片中，每一个小孔中的PH电极，就测量这个小孔中的PH值变化。
并且把测量到的值传给计算机。
把分别含有A、C、G、T四种dNTP的溶液，分别地、依次地流过芯片表面。
举例来说流入的是dCTP溶液，而模板上正好有一个G 碱基。
就会发生聚合反应，病产生电压变化，而且会被记录下来。
如果流入的溶液与模板上的碱基不匹配，就不会发生聚合反应。
也就没有电压变化，也就不会有碱基被记录下来。
如果正好有2个异样的碱基相邻，一次就正好有两个碱基被聚合到DNA链上，电压电压变化值也就会加倍。
序列中就会有2个新的碱基被记录下来。
在测序的序列安排上，最前面的4个碱基叫Keysequence，分别是A、C、G、T，因为每个珠子上长多少个DNA链，它的变化范围是很大的。
所以用Key Sequence的A、C、G、T四个碱基所测到的PH 值变化的强度来确定这个珠子的信号强度。
有了标准的信号强度之后，后面测到的信号后河这4个信号强度做对比。
Ion Torrent 技术Ion Torrent已经发布了一个商业化的仪器——1个新的半导体芯片——直接将化学信号转换成数字信号。
该仪器的第一个技术应用就是进行DNA测序。
该仪器充分利用了几十年的半导体研究成果，在短短几年内就给整个的工业设计、制造和供应链基础设施带引入——1万亿美元的投资空间——迎接测序的挑战。
该挑战带来的结果就是Ion半导体测序，第一个不需要光学系统的商业测序仪，且提供了一个前所未有的测序速度，扩增规模和低成本。
该技术在几个月内将测序规模从第一代含有一百多万个微传感器的Ion 314芯片扩展到七百多万个微传感器的二代Ion 316芯片——所有的运行时间都保持在1到2个小时之内（图1）。
该测序的化学反应非常简单。
一般地，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个质子，导致局部可被检测的pH值变化。
每个Ion Torrent半导体微孔测序芯片中含有将近一百多万个DNA分子拷贝。
Ion PGM测序仪按照一个核苷酸接一个核苷酸的微芯片流测序。
在一个特定的微孔中，如果模板DNA分子上的一个互补的核苷酸被合成，微孔就会释放出一个氢离子。
然后溶液的pH值改变并被离子传感器检测到，基本上直接将该化学信号转变为数字信号。
如果DNA链上有两个相同的碱基，检测到的电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。
如果模板上的下个核苷酸与微芯片流的核苷酸不匹配，则检测不到电压，也不会记录碱基。
因该法是直接检测DNA 合成，不需要扫描，摄像机，荧光等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。
工作流程Ion Torrent个人基因组测序仪的操作流程非常简单。
第一步是产生两端有Ion Torrent接头的测序DNA片段的文库。
这一步可以通过直接将接头固定在PCR产上或者在设计PCR引物的时候直接在引物的5’端加上Ion的接头序列来实现。
然后，文库的片段被克隆到专门的离子微球颗粒上，再通过微乳液PCR进行扩增。
