微生物限度-平皿法

控制菌检查 检查法 供试品的控制菌应按已验证的方法进行控制菌检 查，增菌培养基的实际用量同“方法的验证”。 阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。 阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，方法同供试 品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制 菌。 阴性对照试验 取稀释剂10 ml加入100 ml（或200 ml）相应控制 菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。
沙门菌 修订 取供试品10g或10ml加至200ml的营养肉汤培养基 中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，为试验组。取 10ml稀释液加至200ml营养肉汤培养基中，为阴性对 照组。培养18-24h，阴性对照应无菌生长。 • 取上述培养物1ml，接种四硫磺酸钠亮绿培养基， 培 养 后 ， 划 线 分 离 胆 盐 硫 乳 琼 脂 （ 或 SS ） 或 MacC(或EMB)培养基平板，培养18～24小时（必要 时延长至40～48小时）。若平板上无菌落生长，或 生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出 沙门菌。
取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入1：10供试液1ml(供 试 品 量 0.1g 或 0.1ml) ， 1 ： 100 供 试 液 1ml( 供 试 品 0.01g或0.01ml)，1：1000供试液1ml(供试品0.001g 或0.001ml)。另取1支乳糖胆盐发酵管，加1ml稀释 剂，作阴性对照。各管置36±1℃培养18-24h，阴性 对照应无菌生长。 乳糖胆盐发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产 酸产气（或产酸不产气），报告供试品未检出大肠 菌群；如有产酸产气者，应将产酸产气的发酵管分 别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上， 培养18～24h，。如平板上无菌落生长，或有菌落 生长但不发酵乳糖、非革兰阴性无芽孢杆菌的菌落， 判该管未检出大肠菌群；如平板上生长的菌落与表 3所列的菌落形态特征相符或疑似，为革兰阴性无 芽孢杆菌的菌落，应做确证试验。

10ml；膜剂为100cm²；贵重药品、微量包
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml

微生物限度检查法1范围本标准适用于非规定灭菌制剂及其原料、辅料检查项目包括细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查及活螨的检查。

2依据标准《中华人民共和国药典》《药品微生物学检验手册》YBB00132002药品包装用复合膜、袋通则3人员资质及培训3.1从事药品微生物检验工作的负责人应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。

3.2检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认可以承担某一试验前，不能独立从事该项微生物试验。

应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划。

3.3检验人员必须熟悉相关检验方法、程序、检测目的和结果评价。

3.4实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评价检验人员的能力，必要时对其进行再培训并重新评估。

当使用一种非经常使用的方法或技术时，有必要在检测前确认微生物检测人员的操作技能。

4培养基4.1培养基的制备4.1.1培养基可按处方配制。

也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。

4.1.2在制备培养基时，应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。

脱水培养基应附有处方和使用说明，配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求，不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。

4.1.3脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下贮藏，如低温、干燥和避光，所有的容器应密闭，尤其是盛放脱水培养基的容器。

商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外，还应注明有效期、贮藏条件、适用性检查试验的质控菌和用途。

4.1.4为保证培养基质量的稳定可靠，各脱水培养基或各配方组分应准确称量，并要求有一定的精确度。

配制培养基最常用的溶剂是纯化水，特殊情况下，可能需要去离子水和蒸馏水。

应记录各称量物的重量和水的使用量。

4.1.5配制培养基所用容器和配套器具应洁净，可用纯化水冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留。

微生物限度检测方法验证操作指导书1.0目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。

2.0适用范围适用于公司所有需进行微生物限度检测的产品。

3.0职责化验室负责人：对本规程的实施负责。

检验人员：严格按照本规程执行检验操作。

4.0参考文件4.1 验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。

4.2 验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。

5.0程序5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。

5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。

6.0内容6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。

根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]黑曲霉[CMCC（F）98 003]白色念珠菌[CMCC（F）98 001]6.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。

取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。