实验方案
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实验方案
陈捷
1.材料与方法
1.1 植物栽培方案
1.2植株处理方案
1.2.1仪器及试剂
差速离心法：
原子吸收分光光度计（岛津 AA-6300C） 台式高速冷冻离心机
匀浆液【
组成为: 0. 25 mmol·L-1蔗糖、50mmol·L-1Tris-HCl 缓冲液( pH 7. 8) 、1 mmol ·L-1MgCl2和 10
mmol·L-1半胱氨酸。
】
TEM/EDAX联用技术：
超薄切片机(UC6) 透射式电子显微镜(JEM-100SX) 显微能谱分析仪（NOVA NANOSEM
430） 2.5%戊二醇固定液 磷酸缓冲液【
甲液：取：取 Na2HPO4·2H2O 35.61 g，加蒸馏水 1 000mL,
配制成 0.2mol/L 的磷酸氢二钠溶液为甲液；②乙液：取 Na2HPO4·2H2O 27.6 g，加蒸馏水 1 000mL,配制
成 0.2mol/L 的磷酸氢二钠溶液为乙液。然后按表 2 将甲、乙两种溶液混合即得到所需要的 pH 的缓冲液
】
1%四氧化锇（OsO4）乙醇（50%、70%、90%）丙酮（90%） 包埋剂（国产环氧树脂618）=
3∶1 、1∶1、和 1∶3 构椽酸铅、2%醋酸铀
表 2磷酸盐缓冲液的混合(0.2mol/L)
pH 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0
甲液/mL4.0 6.2 9.3 13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5 43.5 45.8 47.4
乙液/mL46.0 43.8 40.7 36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5 6.5 4.2
1.2.2差速离心法实验方案
（i）小飞扬草植株亚细胞组分的分离
1.植株收获后，先用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗一遍，将植株分为根、茎、叶
3部分。
2. 每部分分别称取 1 g 鲜样，至于研磨钵中，加入预冷的匀浆液，进行研磨。
3.匀浆后的组织转入 15 mL 的离心管中，将组织匀浆液在高速冷冻离心机中于 2000
r·min-1离心 10 min，沉淀部分为细胞壁部分，分离出上清液。
4.上清液部分在 12000 r·min-1离心 45min，底层碎片为细胞器组分上层清液为胞液组
分，包括细胞质及液泡内大分子有机物及无机离子。分离出上清液。
5.亚细胞结构分离完成，各部分依次为细胞壁、细胞器、胞液。
（ii） 重金属 Cd 含量测定
1.称取粉碎后的植物干样 0. 50 g 于消煮管中，加入 10 mL HNO3和 1 mL HClO4，摇匀过夜。
2.在游浴锅中先90 ℃缓慢加热消煮，待黄烟冒尽，提高温度，180 ℃ 消煮至清亮，用超纯
水定容至 10mL。经亚细胞组分分离后的细胞壁、胞液和细胞器组分也采用同样方法消煮后
待测。Cd 含量采用原子吸收分光光度仪测定。
1.2.3 TEM/EDAX联用技术实验方案
（i）取样与固定 取小飞扬草成熟植株，及时剪成根、茎、叶三部分，迅速放在 2.5%的戊
二醛固定液中固定。戊二醛必须在 0℃～4℃条件下保存，一般固定 12～48 h。
（ii）预处理 首先，从戊二醛固定液中取出植物物料，用磷酸缓冲液洗涤 4 次，每次
15min，目的是把剩余的戊二醛冲洗干净。本次实验取pH 值 6.6。接着，用 1%的四氧化锇
（OsO4）作后固定液，固定 12 h，固定温度为 - 4℃，然后用蒸馏水冲洗 2 次，每次 15min，
在常温下进行。最后，进行逐步、渐进的乙醇或丙酮脱水。分别进行 50%→70%→90%的乙
醇脱水，每次 15min。接着用 90%乙醇和90%丙酮的等体积比例混合液脱水 15min。再用
90%丙酮脱水 15min。最后用 100%的丙酮脱水 2 次，每次 15min。脱水温度均为 0℃～
4℃，即每次换好脱水剂之后立即放进符合温度要求的冰箱。
（iii）包埋 首先是渗透，即分别用丙酮 ：包埋剂（国产环氧树脂618）= 3∶1 、1∶1、
和 1∶3 的渗透剂进行渗透，每种比例渗透 24 h，共计渗透 72 h，处理温度均为 32℃～
35℃。（先将样品放在青霉素瓶中，然后再加渗透剂进行渗透）。最后，加纯包埋剂（环氧丙
烷包埋剂 618）渗透 24 h。接着是聚合，把包埋剂注入包埋块板孔中，从青霉素瓶中取出
样品（这时样品有些粘稠，动作要迅速），摆放在包埋板孔中（注意不要遮挡编号）。接着又
用60℃聚合 48 h（放在恒温箱）。最后取出进行修块、光镜定位。
（iv）切片 用超薄切片机对样品进行切片，厚度约为 50～70nm。捞出后用构椽酸铅、2%
醋酸铀双染色，在透射显微镜下观察、拍摄。
（v）X射线能谱分析 自然风干的试样切成薄片后直接上机采谱,加速电压均为25kv,样品倾
角35°,能谱采集时间为300ms;每个试样采3次谱,数据取其平均值。
1.3数据处理
1.3.1差速离心法数据记录
表一 亚细胞水平镉的分布
细胞质 根 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10
茎 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10
叶 z1 z2 z3 z4 z5 z6 z7 z8 z9 z10
细胞器 根 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10
茎 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10
叶 z1 z2 z3 z4 z5 z6 z7 z8 z9 z10
细胞壁 根 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10
茎 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10
叶 z1 z2 z3 z4 z5 z6 z7 z8 z9 z10
利用SPSS软件对所得试验数据进行方差分析。
图一 亚细胞水平镉的分布（仿照下图）
1.3.2 X射线能谱分析数据处理
图二小飞扬草X射线能谱图（参考）
表二 镉在小飞扬草体内镉的质量分数Wt/（%）
细胞质 根 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10
茎 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10
叶 z1 z2 z3 z4 z5 z6 z7 z8 z9 z10
细胞器 根 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10
茎 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10
叶 z1 z2 z3 z4 z5 z6 z7 z8 z9 z10
细胞壁 根 x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 x10
茎 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10
叶 z1 z2 z3 z4 z5 z6 z7 z8 z9 z10
表三 镉在小飞扬草体内组织水平上各部分质量分数Wt/（%）
部位 质量分数（%）
筛管
内皮层
皮层
表皮
说明：通过差速离心法与TEM/EDAX联用技术，可以分析出小飞扬草体内各部分亚细胞水平
镉的分布情况，利用所得数据，可以通过分析得出以下三个方面的数据：1.将各部分亚细胞
测的数据加和，得出镉在小飞扬草体内亚细胞水平上的分布规律；2.将各器官镉的总量加和
可得镉在小飞扬草体内器官水平上的分布规律。
