实验目的】（1 ）学习并掌握动物组织总DNA 的提取方法及其原理。
（2 ）从肝脏组织中提取到一定量的纯净的DNA 样品。
【实验原理】
DNA 是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS 作用破碎细胞；苯酚和氯仿可使蛋白质变性，用其混合液（酚：氯仿：异戊醇）重复抽提，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质；RNase 降解RNA ，从而得到纯净的DNA 分子。【仪器、材料、试剂】
（一）仪器1．高速离心机
2．烘箱
3．冰箱
4．水浴锅
5．微量移液器
6．高压灭菌锅
（二）材料
1．生理盐水
2．十二烷基硫酸钠（SDS ）
3．三羟甲基氨基甲烷（Tris ）4．乙二胺四乙酸（EDTA ）
5．饱和酚
6．氯仿
7．异戊醇
8．无水乙醇
9．75% 乙醇
10．蛋白酶K
11．RNase 酶
12．手术剪刀、镊子、吸水纸
13．微量取液器
14 ．研钵、1.5mL 离心管、一次性手套、1.5mL 离心管架、记号笔
三）试剂配制
1.Tris -HCL 1mol/L PH8.0 50ml
配制方法：
40ml 双蒸水，6.057g 固体Tris 放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH 值到8 . 0 ，转移到50ml
容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 C保存备用。
2.生理盐水: 0.85%NaCL 100ml
配制方法：
在20ml 双蒸水中溶解0.85g 固体NaCL ，加水定容至100ml ，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4C保存备用。
3.EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml
配制方法：
将9.08g的EDTA Na2・2H2O 溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）
调PH 值到8.0，用50ml 容量瓶定容，如果EDTA 难溶，先加NaOH 溶解，然后逐步加
EDTA- Na2-2H2O。
4.TES 缓冲液（释放DNA ）100ml
配制方法：
将0.5844g 的5 mol/lNaCl 溶解于80ml 双蒸水，在分别加入1ml 的0.5 mol/l EDTA 、
0.2ml 的Tris-HCl （pH=8.0），加定容至100ml, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 C保存备用。
5.10% SDS （变性剂破细胞壁）100ml
配制方法：
将10g的十二烷基硫酸钠（SDS ）溶解于80ml双蒸水于68 C加热溶解，用浓HCI调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签， 4 C保存备用。
6.蛋白酶K （降解蛋白质）：20mg/mL 无菌三蒸水溶解。
7.RNA 酶（降解RNA）
配制方法：
将胰RNA 酶（RNA 酶A）溶于10mmol/L 的Tris CL （PH7.5 ）、15mmol/LNaCL 中，配成
10mg/ml的浓度，于100 C加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于£0 C。
8.氯仿：异戊醇=24：1 100ml
按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4C保存备用。9．TE 缓冲液（溶解DNA）PH8.0 50ml
配制方法：
将0.5ml 的10mmol Tris-HCl（PH8.0）、0.1ml 的0.5mol/l EDTA（PH8.0）加入到50ml 的容
量瓶中，调PH8.0 定容至50ml 摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 C保存备用。
【实验步骤】
1 ．组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g 组织，放入1.5ml 离心管中，剪碎。
2.加入0.45ml TES 混匀，再加入50ul SDS （10%）, 5.0ul 蛋白酶K （20mg/ml ），充分混匀后，于56° C保温4-6h，每2h摇1次。
3 .放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul ），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的 1.5ml 离心管。
4.加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m ，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml 离心管中。
5.加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m ，离心10 分钟，取上层清液到一个新的1.5ml 离心管。
6.加入2.5 倍体积的-20°C 预冷的无水乙醇沉淀DNA ，观察现象。
7.12000 r/m ，离心10 分钟，弃乙醇。
8.-20 °C 保存的75% 乙醇洗涤，10000 r/m ，离心5 分钟，去乙醇，55°C 干燥DNA 。
9 .加入适量TE溶解DNA （具体依DNA的多少而定），-20 °C保存备用。
【注意事项】
1 .抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA 的损伤。
2.取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。
3.乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。
4.离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。
