DC-CIK治疗缓解后急性白血病6例报告

DC-CIK治疗缓解后急性白血病6例报告

刘清池 吴维海 牛景月 武大勇 冯新旺 梁春耕 李建英 马传宝 庞宇慧 张慧敏

李刚荣 胡晓东 张玉娜

2000年在美国举行的“国际肿瘤生物治疗及基因治疗年会”会议总结报告曾指出：“生物治疗是目前知道的唯一一种有望完全消灭癌细胞的治疗手段，21世纪是肿瘤生物治疗的世纪。”

细胞免疫治疗是近年来肿瘤生物治疗中的研究热点之一。近年来随着细胞免疫学和分子生物学的发展, 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells , 简称CIK) 是一种高效、新型免疫活性细胞,CIK 细胞用于治疗白血病已经成为白血病过继免疫治疗的重要手段之一。树突状细胞(dendritic cells, DC) 是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞,它通过处理、呈递抗原而介导机体免疫应答。由于许多白血病患者缺乏功能性DC 而不能诱发抗原特异性T 细胞应答,故在体外诱导功能性DC 用于主动免疫治疗具有重要的临床应用价值。DC-CIK是分别培养DC与CIK,然后再共同培养，使DC诱导CIK特异性应答，较单纯CIK更完善。现今白血病的缓解率已达70%以上，但多数患者最终因为残留白血病（MRL）的存在会复发而死亡。清除MRL是治愈白血病的关键。我们采用树突状细胞调节联合细胞因子诱导的杀伤细胞(简称DC-CIK) 治疗血液学缓解后白血病6例，取得较好临床疗效，特报告如下。

1资料与方法

1. 1研究对象

2004年12月至2006年3月期间,选择6例急性白血病患者(本组病例不含PML/RARα阳性急性髓系白血病),均为血液学缓解期，血象、骨髓象正常，但未达分子生物学缓解。年龄20～24岁,平均20.2岁。包括急性B 淋巴细胞白血病(ALL) 1例, 化疗4年后仍持续IgH基因重排阳性，自体造血干细胞移植后IgH基因重排阳性B细胞型ALL1例，AML/ETO阳性急性髓性白血病2例，BCFβ/MYH11基因阳性急性髓系白血病1例。诊断标准按照WHO急性白血病诊断分型标准[1]。

表1：6例患者临床资料

病例 性别 年龄(岁) 诊断 病程（月）

例1 男 24 AML/ETO阳性急性髓性白血病 8

例2 男 23 BCFβ/MYH11基因阳性急性髓系白血病 11

例3 男 15 IgH阳性急性B淋巴细胞白血病 10

例4 男 19 IgH阳性急性B淋巴细胞白血病 48

例5 男 20 AML/ETO阳性急性髓系白血病 25

例6 女 27 AML/ETO阳性急性髓系白血病 30

1.2 DC-CIK培养、扩增

1.2.1 DC、CIK 细胞的体外分离: 在平安医院细胞培养室完成用COBE SPECTRA 机按Auto-PBSC程序行血细胞分离,采集外周血单个核细胞(MNC)。并用淋巴细胞分离液( Ficoll )

再次分离出MNC ,用AIM-V无血清培养基调细胞浓度为(4～6)×106个/ ml ,置于37℃、5 %CO2 培养箱中培养2h。收集非贴壁细胞用于诱导培养CIK 细胞, 贴壁细胞诱导分化出成熟

DC。

作者单位：050021 石家庄平安医院血液科（刘清池 吴维海 牛景月 武大勇 冯新旺 梁春耕 李建英 马传宝 庞宇慧

张慧敏）；石家庄平安医院分子生物学实验室（李刚荣 胡晓东 张玉娜 ）

通讯作者：刘清池，Emai:liuqingchi@

1.2.2CIK细胞培养、扩增: 用含10%人AB 血清的IMDM，将收集的菲贴壁细胞调细胞浓度为(1～2)×106个/ml ,并加入1000U/ml 的IFN-α悬浮培养,24h后加入1μg/ml 的CD3 单抗

和1000U/ml 的rh IL-2 ,每隔3 天半量换液1次,补充rh IL-2 ,调整细胞浓度始终为(1～2)×106个/ ml 。

1.2.3 DC 的体外培养、扩增: MNC 培养2 h 后的贴壁细胞中,加入含1000 U/ml 的GM-CSF

和1000U/ ml 的IL-4 的AIM2V 培养液,37℃、5 %CO2 培养箱培养。每3天换液1 次并补充细胞因子,第6天加入上述细胞因子的同时还加入IL-1β、TNF-α、PGE-2 等细胞因子诱导DC 成熟,共培养8～9天。

1.2.4 DC 与CIK细胞共培养：:收获的DC计数后和CIK, 按1∶5混合培养,共培养3天。

DC/CIK 细胞群表型检测

在DC培养的第9天应用流式细胞仪进行免疫表型分析,在CIK细胞培养的第9、14、21天分别取少量细胞应用流式细胞仪测细胞表型,DC-CIK培养物共培养3 天后测细胞表型。由平安医院分子生物学实验室完成，采用荧光标记的单抗(International Immunotech 公司) 进行染色,

用COULTER EPICS XL型四色流式细胞仪检测，用Cell Quest 软件分析数据。

1.3 DC-CIK 细胞回输

每次采集的细胞分3次培养后回输。做细菌、霉菌培养均阴性,活性细胞占95 %,淋巴细胞比例>70 % ,则准备回输DC-CIK细胞。将37 ℃恒温箱中的DC-CIK 回输液(约250 mL) 运至病房,立即快速静脉回输。回输前,地塞米松5 mg 静脉注射(防止过敏) ,生理盐水250 mL 回输时前后冲。当天回输后4～6 h 再输入生理盐水100 mL+白细胞介素Ⅱ20万U , 次日起输入生理盐水100 mL+白细胞介素Ⅱ20万U , 1次/ d共4 d。每15天~20天回输一次，输注3~4次后判断疗效。

1.4 临床监测

1.5.1临床监测指标:所有临床观察及监测均在平安医院的门诊或病房进行,血液生化指标、尿常规检测由平安医院检验科完成。

1.4.2白血病标志基因的检测: CBFβ/MYH11、及AML/ ETO融合基因、IgH 和/ 或TCRδ基因重排的检测由平安医院分子生物学实验室完成, 基因检测采用PCR方法。

1.4.3疗效监测:回输DC-CIK 前、后观察患者异常症状体征,肝大, 脾大,以及血白细胞分类、免疫学标志、骨髓细胞形态、白血病标志基因等指标。白血病标志基因如连续2 次均为阴性,每3～6 个月再检测1 次; 持续阴性1 年以上,每6～12 个月检测1 次，再检测2次。

1.4.4不良反应监测: 在回输DC-CIK过程中及回输后每天观察出现的毒性反应。观察项目及分级参照世界卫生组织规定的急性及亚急性毒性反应标准。

2疗效判断

血液学缓解标准采用1987 年全国白血病化疗讨论会制定的标准[2],分子生物学缓解标准为标志基因阴转。

2.1 白血病标志基因 AML1/ETO, CBFβ/MYH11, IgH、TCRδ基因重排、bcr/abl。

2结果

6例共接受26 次DC-CIK 治疗，其中3 例接受3 次治疗，2 例接受4次治疗，1例接受9次治疗。每次回输的DC-CIK 总数为1×109～26.5×109，平均12.6×109。

6例均达分子生物学缓解，标志基因阴转。 例1例输注DC-CIK1次后阴转，例2输注2次后阴转，其余病例均在输注3次后转阴。全部6例患者随访至今仍保持分子生物学缓解，随访期12~20个月。 不良反应发生情况：回输后4例（4/20）发热,T37. 5℃～40. 2℃。多发生于细胞输注后0. 5～2h ,持续1～3h 消退。可伴有全身乏力、肌肉酸痛，用地塞米松能很快缓解。未见导致外周血红细胞、白细胞及血小板的明显降低。无肝功、肾功、心肌酶、血糖及电解质的异常变化。

3讨论

目前,化疗可使70%～80 %的急性白血病获得CR。CR 后如继续化疗或自体造血干细胞移植治疗, 除M3 型及儿童标危组B2ALL 外,其它患者的长期CCR 率<50 % ,多数单位<30%。自体造血干细胞移植治疗ALL 1年内复发率为50%以上,甚至可高达70%。异基因造血干细胞移植治疗的复发率虽然低,但大多数患者不能找到HLA 配型相合的供者,且并发症较多,费用高。因此急性白血病CR后微小残留白血病的清除仍是治疗的难点。本组化疗或/和自体造血干细胞移植治疗后血液学缓解者6例, 经用DC-CIK细胞输注，患者标志基因消失，均达到分子生物学缓解。例1AML1/ETO基因阳性急性髓系白血病患者，化疗取得缓解后，只巩固1个疗程，即采用DC-CIK治疗，DC-CIK细胞输注1次后AML1/ETO基因阴转，至今保持阴性达20个月。例4缓解后巩固治疗的B细胞急性淋巴细胞白血病患者，坚持间断化疗4年，IgH基因持续阳性，停用化疗，DC-CIK治疗3次，IgH基因阴转，保持阴性至今达20个月。本组病例既有急性髓系白血病，也有急性淋巴细胞白血病，说明DC-CIK对急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病，均有清除微小残留白血病细胞,防止复发的作用。

新近研究证实，DC与CIK共培养过程中, CIK 细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例较单纯CIK 细胞有不同程度的增高,说明大量成熟DC 进一步促进了CIK细胞的成熟[3，4]。DC-CIK细胞抗白血病机理①CIK细胞对白血病细胞的直接杀伤：在体内受某些淋巴因子作用后，CIK细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外，这些颗粒直接破坏瘤细胞。②进入体内活化的DC-CIK细胞分泌多种细胞因子如干扰素r、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-2(IL-2)等，不仅对白血病细胞有直接抑制作用，而且还可通过调节免疫系统间接杀伤白血病细胞。③CIK细胞通过表达Fasl可诱导白血病细胞凋亡，CIK细胞由于有抗凋亡基因表达，因此在体内能抵抗Fasl阳性白血病细胞对CIK的反作用，故CIK能对白血病细胞能持久的发挥作用。

自体DC-CIK细胞免疫治疗血液学缓解期白血病有较好的临床疗效，能够提高白血病分子生物学缓解率，有很好的清除残留白血病,防止白血病复发的作用。其作用机制不同于化疗，可以清除微小残留白血病，是继造血干细胞移植之后，又一肿可以治愈白血病的方法，但无造血干细胞移植的风险，无明显毒副反应，医疗费用低，有很好的应用前景。

参考文献

[1] Bennett JM. World Health Organization classification of the acute.leukemias and myelodysp

lastic syndrome [ J ]. Int J Hematol, 2000,72: 131~133.

[2]张之南,沈悌. 血液病诊断及疗效标准[M]. 2版.北京:科学出版社,1998: 214~218.

[3] 岳玲玲, 张连生, 张玉芳,等.树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养对白血病耐药细胞杀伤作用的实验研究. 中国实用内科杂志2006, 26(17):1340~1342.