酵母双杂交
酵母双杂交（筛库）
pGBK-gene 转化酵母
1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。
2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。
3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测
定OD600，直至OD600达到0.5左右。 4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm
离心5min。
5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。
6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 7. 弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。
8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮
2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。 9. 加入280μl
PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。 10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。
11. 室温下6000-8000rpm离心20~30s，去上清。
12. 重悬于500μl无菌水中，取100-200μl涂在SD-trp板上，30°C烘箱培养48-72h。
酵母大规模转化AD文库
1. 挑取上述SD-trp板上的pGBK连的基因转化子，YPDA培养基中培养至饱和。 2.
将上述转化子转接至200mlYPDA培养基中，30°C培养至OD600 0.5-0.6左右。 3. 离心收集菌体，20ml无菌水洗涤，3000rpm离心5min。
4. 去上清，重悬于20ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 5. 去上清，合并菌体于一管，1ml TE/LiAc溶液悬浮菌体。 6. 加入鲑鱼精DNA200μl, 20μl AD文库DNA（4μg左右），混匀后，再加入7ml PEG/LiAc 溶液，Vortex，分装，500μl/管。
亚细胞定位,酵母双杂交技术的原理流程
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亚细胞定位和酵母双杂交技术是生物技术领域中两项重要的实验方法，它们在研究细胞结构和功能以及蛋白质相互作用等方面发挥着重要作用。亚细胞定位是指通过显微镜观察，确定生物体内特定分子或结构的位置，从而揭示其在细胞内的功能和作用机制。而酵母双杂交技术则是一种用于检测蛋白质间相互作用的方法，通过该技术可以筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而揭示蛋白质网络中的关系。本文将介绍这两种方法的原理和流程，并探讨它们在生物研究中的应用。
酵母双杂交系统
1．原理
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2．试验流程
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:
2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。
2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。
2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。
3．特点
优点
蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。
缺点
尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA
Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认 通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
