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酵母双杂交系统

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酵母双杂交

酵母双杂交

酵母转录因子（Gal 4）
与BD-fusion ---诱饵蛋白（bait protein ） 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein）
报告基因（reporter gene）
---Lac Z（编码β -半乳糖苷酶）
报道株
经改造的、含报告基因的重组质粒的宿 主细胞。 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有 许多优点:
酵母双杂交系统
一、酵母双杂交系统的简介
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system) 是由Fields和song等在1989年提出的一种在真 核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋 白质相互作用的遗传系统。 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细 胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许 多真核生物的转录因子都是由两个可以分开 的、功能上相互独立的结构域组成的。
DNA结合结构域(BD)
(DNA binding domain)
转录激活因子
转录激活结构域(AD) (activation domain)
•这两个结构域各具功能，互不影响,
•单独存在时都没有转录激活的功能，
•只有二者在空间上充分接近时，才表现出一个完整的
激活特定基因表达的激活因子的功能。
二、酵母双杂交系统的建立
五、酵母双杂交的应用
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的， 研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检 测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间 关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用 来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也 可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互 作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。

酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交

酵母双杂交体系Yeasttwo-hybridsystem酵母双杂交
产生的GAL4 DNA-BD和AD多肽 不直接发生相互作用，不能激活相关的效 应基因进行转录

同时用上述两种载体转化改造后的酵
母，这种改造后的酵母细胞的基因组 中不能产生GAL4结合形成杂种 蛋白，与GAL1的UAS序列结合，但由于无 AD的参与，报告基因不转录。 蛋白质X DNA-BD
基本原理
DNA结合域（DNA-BD）：N端1-147 氨基酸 转录激活域（AD）：C端786-881氨基 酸




DNA-BD：识别GAL4效应基因上游的 激活序列（UAS） ，并与之结合 AD：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启 动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。

用DNA重组技术，将DNA-BD和AD分 开，并放在同一宿主细胞中表达。

将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质 Bait protein的基因构建在同一个表达 载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白 BD-Bait proteiRARY表达载体上。
上游更远处 增强子 统称顺式作用元件
转录因子




能直接或间接辨认和结合上游区段DNA 的蛋白质----反式作用因子. 其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的 称为转录因子(TF). 相应于RNA聚合酶ⅠⅡⅢ的转录因子为 TF Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 真核生物的TFⅡ又分为TFⅡ A与TFⅡ B
真核生物转录起始前复合物
（ADH1:醇脱氢酶1）
实验程序



1 2 3 4 5
分别重组两种穿梭质粒载体。 分别导入E.coli培养。 分别提取两种质粒。 转化酵母菌 筛选阳性克隆
应用---蛋白质相互作用

酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件

酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
结合后的复合物可以激活或抑制报告基因的表达，从而判断待研究的蛋 白质是否与DNA相互作用。
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂交系统原理(一)

酵母双杂交系统原理(一)

酵母双杂交系统原理(一)酵母双杂交系统1. 什么是酵母双杂交系统？•酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，用于测试两个蛋白质是否相互作用，并进一步研究其相互作用的特点和机制。

•这个系统基于酵母菌（酿酒酵母或拟南芥酵母）的特性，当两个蛋白质相互作用时，可以触发酵母的生长或表达特定的报告基因。

2. 酵母双杂交系统的原理•酵母双杂交系统基于两个重要的分子域：DNA结合域（DBD）和激活域（AD）。

•DBD通常来自于一个转录因子，可以与DNA结合并调节基因的转录水平。

•AD则是一个激活域，可以与其他蛋白质相互作用并激活报告基因的表达。

•在酵母双杂交系统中，将待测蛋白的DBD与一个对照蛋白的AD 融合，构建成DBD-融合蛋白，而待测蛋白的AD与一个对照蛋白的DBD融合，构建成AD-融合蛋白。

•当两个融合蛋白相互作用时，DBD和AD相互结合，激活报告基因的表达，从而观察到酵母生长或报告基因的表达。

3. 酵母双杂交系统的应用•酵母双杂交系统广泛应用于蛋白质相互作用和功能研究领域。

•可以用于筛选蛋白质相互作用的伙伴，发现新的蛋白质复合物。

•可以用于研究蛋白质的亚细胞定位和功能等特性。

•可以用于研究蛋白质结构和功能的变异。

•可以用于研究蛋白质与其他生物分子（如DNA、RNA、小分子化合物等）的相互作用。

•可以用于研究蛋白质的信号传导途径和调控机制。

4. 酵母双杂交系统的优缺点优点：•酵母双杂交系统是一种简单、快速、高通量的方法，可以同时测试多个蛋白质相互作用。

•可以研究蛋白质相互作用的强度和特异性。

•可以在活细胞环境下进行研究，更接近生物体内的情况。

缺点：•酵母双杂交系统可能存在假阳性和假阴性的问题，需要进行进一步的验证。

•酵母双杂交系统对蛋白质的折叠状态和局部结构要求较高，对于某些复杂蛋白质可能不适用。

•酵母双杂交系统无法直接观察蛋白质相互作用的动力学过程，只能得到静态的结果。

总结酵母双杂交系统是一种重要的蛋白质相互作用研究方法，基于酵母菌的特性，通过构建融合蛋白实现对蛋白质相互作用的测试。

酵母双杂交系统名词解释

酵母双杂交系统名词解释

酵母双杂交系统名词解释
嘿，你知道啥是酵母双杂交系统不？这可不是一般的东西啊！就好像是一把神奇的钥匙，能打开好多未知的大门。

酵母双杂交系统呢，简单来说，就是一种用来研究蛋白质相互作用的技术。

比如说吧，蛋白质 A 和蛋白质 B，它们之间有没有啥特别的关系呢？酵母双杂交系统就能帮我们搞清楚。

想象一下，酵母就像是一个小小的实验室，在里面各种蛋白质跑来跑去。

如果蛋白质 A 和蛋白质 B 能相互结合，那就像两个小伙伴手牵手一样，会产生一些特别的信号。

这就好比在黑暗中突然亮起了一盏灯，告诉你：嘿，它们俩有关系呢！
咱再具体点说，它是通过巧妙的设计，把要研究的蛋白质分别和特定的结构融合在一起。

然后把这些融合体放到酵母细胞里。

如果这时候出现了特定的反应，那就说明这两个蛋白质之间有互动。

这就好像是一场精心设计的游戏，只有符合条件的才能通关。

“哎呀，那这有啥用啊？”你可能会这么问。

用处可大啦！它能帮助我们理解细胞里各种复杂的过程，像是基因表达调控啊，信号转导啊等等。

就好像是在拼图，一块一块地拼凑出生命的奥秘。

而且哦，这个酵母双杂交系统就像一个超级侦探，能找出那些隐藏在细胞深处的蛋白质之间的秘密关系。

它让我们对生命的运行机制有了更深入的了解。

总之，酵母双杂交系统是生物学研究中非常重要的工具，它就像一
把开启生命奥秘之门的钥匙，让我们能更深入地探索生命的神奇世界。

怎么样，是不是很厉害？。

大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用

大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用

大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用生命科学研究中，基因互作是一个重要的研究领域，对了解基因的功能，及其在生物学中的重要性具有关键性意义。

近年来，越来越多的研究者运用酵母双杂交系统来研究基因互作。

其中，大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用越来越广泛。

1. 大肠杆菌酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）最早是由Fields与Song在1989年提出的，它是一种通过互补形成基因蛋白质互作物的方法。

大肠杆菌酵母双杂交系统（E. coli yeast two-hybrid system）是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的。

它是通过将酵母双杂交系统中的酵母菌GAL4基因融合到大肠杆菌中的一种表达载体，并在其上构建相应的表达基因来实现的。

通过这种方法，大肠杆菌系能够鉴定出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，并通过一些方法进行确认和鉴定。

2. 大肠杆菌酵母双杂交系统的优点（1）鉴定简单：大肠杆菌酵母双杂交系统只需要一些特定的基因表达载体，而不需要其他繁琐的操作，使其鉴定基因互作关系的过程变得更加简单。

（2）兼容成熟技术：大肠杆菌酵母双杂交系统是在酵母双杂交系统技术的基础上发展起来的，因此，其技术兼容性是酵母双杂交系统的一个很好的特点。

大肠杆菌酵母双杂交系统可以通过一定的改变来应对不同的研究需求。

（3）识别特异性高：大肠杆菌酵母双杂交系统的识别特异性非常高，能够鉴定出相互作用蛋白的特异性差异。

3. 大肠杆菌酵母双杂交系统的应用大肠杆菌酵母双杂交系统的主要应用是用于了解蛋白质之间的定向互作关系。

例如，研究一个特定的基因是如何参与一个生物功能的，就需要找到与之相关的其他基因，以了解它们之间是否发生了相互作用。

在研究基因调控的过程中也能使用它进行分析。

此外，大肠杆菌酵母双杂交系统还能运用于感染病毒的分析。

例如：通过大肠杆菌酵母双杂交系统的研究，有学者发现存在于整个病毒基因组中、并参与了其复制的两个产生蛋白质。

酵母双杂交.三杂交

酵母双杂交.三杂交
由于三杂交筛选是在细胞核中进行，而细胞核并非许多反应 发生的最佳场所，如有些蛋白质需要胞质酶的修饰，或在其定位 到核时的错误折叠及不稳定性，常不能检测到相互作用。有些哺 乳动物蛋白在酵母菌中不能正确折叠表达，以细菌、哺乳动物细 胞为宿主的杂交系统现已建立，能更真实的模拟相互作用发生的 自然细胞环境。对不能被转运到细胞核的蛋白质，如跨膜蛋白和 分泌型蛋白，酵母三杂交系统则不能应用。目前，酵母三杂交系 统仍是研究蛋白质与配体相互作用的有力手段，以后还可能发展 出研究RNA-RNA，多蛋白相互作用及功能更加强大的杂交系统。
其中第一个融合蛋白由两部分组成，一部分为能 结合lexA启动子的DNA结合结构域，另一部分为噬菌 体衣壳蛋白MS2。第二个融合蛋白也由两部分组成， 一部分为能激活lexA启动子的转录激活结构域，另一 部分为有待研究的RNA结合蛋白“Y”。
这两个融合蛋白通过第三个融合的RNA分子相连，其一 端为含有噬菌体衣壳蛋白MS2结合位点的MS2RNA，另 一端为有待研究的RNA“X”。一旦“X”和“Y”能有相互 作用就使得这个复合物形成一个功能性的转录激活因 子，从而使得下游的LacZ基因和His3基因得以表达。 LacZ基因的表达水平能够通过在体外检测β半乳糖苷酶 的活性来确定,His3基因的表达赋予了酵母细胞在缺乏 组氨酸的培养基上生存的能力。通过缺陷培养基及β半 乳糖苷酶的活性的测定就能判断在酵母菌内是否发生 了RNA“X”和蛋白质“Y”的相互作用。
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酵母双杂交操作主要流程
1. 分别构建BD和AD融合蛋白载体
BD
2. 分别将重组载体转化酵母菌细胞
BD
3. 对酵母转化子进行自激活检测
AD AD

酵母双杂交检测（Yeast

酵母双杂交检测（Yeast

酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。

某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。

BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。

单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。

酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。

酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。

两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。

结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。

在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。

酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。

第18章酵母双杂交系统 83页

第18章酵母双杂交系统 83页
酵母转化效率较细菌低4个数量级，转 化成为双杂交技术的瓶颈。 办法：引进酵母接合型
a接合型和接合型（两者之间可，但自 身不能形成二倍体）
多克隆位点
DNA-BD
转化
a接合型酵母细胞
转化
接合型酵母细胞
筛选平板
筛选平板
生长菌苔
生长菌苔
同一个三重筛选平板
利用酵母双杂交技术，将因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。 对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途 径等有重要意义。
五、酵母双杂交系统中常见问题的解决和 改进措施
（一） 假阳性较多 （二） 转化效率偏低 （三） 阴性干扰
可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。
三、酵母双杂交系统的优点
1. 高敏感性。 2. 真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力
无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。 3. 简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和
纯化蛋白质的繁琐步骤。 4. 广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的
研究蛋白质相互作用的常用方法
•酵母双杂交（yeast two hybridization） •亲和层析 •免疫共沉淀 •蛋白质交联 •基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法 •噬菌体显示系统筛选
第一节 酵母双杂交系统简介
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母 中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用， 对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过 报告基因的表达产物敏感地检测得到。
克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）
β-半乳糖苷酶
鉴定
（三）阴性干扰
两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表 达程度甚低以至于检测不出来。
原因：
融合蛋白的表达对细胞有毒性，该怎么办？

酵母双杂交自激活

酵母双杂交自激活

蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向

酵母双杂交系统原理

酵母双杂交系统原理

酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，它通过酵母细胞内两个蛋白质的相互作用来筛选出蛋白质间的相互作用关系，从而揭示细胞内蛋白质相互作用的网络。

酵母双杂交系统的原理主要包括构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用。

下面将详细介绍酵母双杂交系统的原理。

首先，构建酵母表达载体。

在酵母双杂交系统中，需要构建两个不同的表达载体，一个用于携带“诱饵”基因，另一个用于携带“靶标”基因。

诱饵基因编码的蛋白质与靶标基因编码的蛋白质是我们想要研究的两个相互作用蛋白。

这两个基因分别被插入到酵母表达载体的多个位点上，以便在酵母细胞内进行表达。

其次，转化酵母细胞。

构建好的酵母表达载体需要通过转化的方式导入到酵母细胞内。

在酵母细胞内，这两个载体会分别表达诱饵蛋白和靶标蛋白，从而在细胞内形成一种相互作用的条件。

接着，筛选阳性克隆。

经过转化后的酵母细胞需要进行筛选，以筛选出表达了诱饵蛋白和靶标蛋白的阳性克隆。

这一步通常通过对酵母细胞进行培养和筛选培养基来实现，只有表达了两个蛋白质的酵母细胞才能生长并形成克隆。

最后，验证蛋白质相互作用。

经过筛选得到的阳性克隆需要进行蛋白质相互作用的验证。

这一步通常通过蛋白质相互作用实验来进行，例如酵母双杂交实验、共免疫沉淀实验等。

通过这些实验，可以验证诱饵蛋白和靶标蛋白之间是否存在相互作用关系。

总的来说，酵母双杂交系统的原理是通过构建酵母表达载体、转化酵母细胞、筛选阳性克隆和验证蛋白质相互作用来揭示蛋白质间的相互作用关系。

这一方法在蛋白质相互作用研究中具有重要的应用价值，可以帮助科研人员更好地理解细胞内蛋白质相互作用的网络，从而为疾病治疗和药物开发提供重要的理论基础。

LexA酵母双杂交系统简介

LexA酵母双杂交系统简介

LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。

分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成1.载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3.大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4.对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用)假阳性检测质粒5.引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

酵母双杂交系统原理

酵母双杂交系统原理

酵母双杂交系统原理
酵母双杂交系统是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法。

该系统利用酵母细胞中转录因子的功能来分析蛋白质与蛋白质之间的相互作用。

该系统的基本原理如下：
首先，选择一个酵母菌株，该菌株的基因组中包含了人类感兴趣的蛋白质的编码基因。

同时，构建两个酵母菌株的转录因子的变体，这两个转录因子变体分别包含感兴趣的蛋白质的结构域。

其中一个转录因子变体被命名为“BD融合蛋白”，另一个
转录因子变体被命名为“AD融合蛋白”。

然后，将这两个酵母菌株进行双杂交，使其杂交在一起。

如果感兴趣的蛋白质与其他蛋白质发生相互作用，那么这些蛋白质就能够重新组合形成一个完整的功能性转录因子。

这个功能性的转录因子可以结合到酵母细胞中的报告基因的启动子上，从而激活报告基因的表达。

通过检测和测量报告基因的表达水平，就可以确定感兴趣的蛋白质是否与其他蛋白质发生了相互作用。

需要注意的是，酵母双杂交系统虽然是一种有效的检测蛋白质相互作用的方法，但仍然有一些限制。

首先，该系统的结果并不能直接转化为体内或人体中的相互作用情况，因为在酵母细胞中的条件下进行的双杂交实验可能与真实情况存在差异。

其次，该方法可能存在假阳性或假阴性的情况，即可能会出现误判。

综上所述，酵母双杂交系统是一种通过利用酵母中的转录因子功能来检测蛋白质相互作用的实验方法。

通过对报告基因的表达水平进行测量，可以确定感兴趣的蛋白质是否与其他蛋白质发生了相互作用。

然而，该方法存在一些限制，需要谨慎分析和解释结果。

酵母双杂交

酵母双杂交

The End
Thanks For Your Attention
①高效:酵母转化方法简单，转化效率高达其具有较高的敏感度，可检测蛋白质之
间结合常数低至1 mmol/L 。
③真实:检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上
代表细胞内的真实情况。
②非普遍适用性：蛋白质必须定位于核内,
才能激活报告基因的表达， 因此，不能被转运到细胞核内的蛋白质不适用这种方法。
③假阴性：某些表达的融合蛋白通常在酵母菌株中产生毒性，从而抑制
报告基因的表达和酵母的生长，或者蛋白间的相互作用较弱，报告基因不表 达或表达程度甚低以至于检测不出来，使得酵母双杂呈现“假阴性”的结果。
④简捷:只需要构建诱饵表达载体，可以省略蛋白质抽提纯化或抗体制备的
繁琐步骤。
⑤广泛:可采用不同组织器官细适用于部分细胞质、细胞核及膜结合阳性，
即通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真 实情况下不一定发生。 Ⅰ型，AD-Y 单独表达的融合蛋白即可激活转录； Ⅱ型，AD-Y 表达的融合蛋白和空BD 载体即可激活转录； Ⅲ型，AD-Y 表达的融合蛋白与任意的BD 载体表达的融合蛋白即可激活转录。 （双筛选系统等可以基本消除假阳性。）
3
应用实例
广泛地应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA 、蛋白质与RNA 以及蛋白与其他小 分子间相互作用的研究, 如今也开始运用该系统进行高通量筛选相互作用蛋白及 其他相关分子。 其应用进展主要而研究蛋白间相互 作用的传递途径。目前已经利用该系统对HBV 、HCV 以及HIV 等多种病毒蛋白基 因的相互作用蛋白进行了研究。 (2)非常灵敏地检测或验证蛋白—蛋白的相互作用。 (3)可利用酵母双杂交筛选药物的作用位点, 寻找基因治疗中的多肽类药物。 (4)研究蛋白—蛋白间发生相互作用所必需的重要活性位点。在确定两蛋白存在相 互作用后, 要对所研究的蛋白做一系列缺失突变处理, 通过缺失掉不同片段来对 蛋白中起关键作用的功能域进行精确的定位。

酵母双杂交体系

酵母双杂交体系

酵母双杂交系统
技术步骤
应用
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：
①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。

同时，酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。

酵母双杂交系统(参考资料)

酵母双杂交系统(参考资料)

GENBANK序号 序号
NM_003282
P1 P5 P6 P1
16
800.000 700.000 β-G al Ac tivi ty ( Unit) 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0.000 E1 E4 E8 E9 E11 E15 E17 E21 E22
10
11
以粒pGBT9-ERRα1/LBD的准备
DBD
LBD
PCR
ERRα1/LBD
13
14
2. 结果 2.1 酵母双杂交试验结果
A
A：在SD/-Leu/-Trp平板上接种的24个His+阳性克隆
B
15
B：菌落滤膜影印后X-gal/Z 缓冲液显色法共有17个克隆在8h之内变蓝
克隆序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
克隆编号 E1-3* E2-2 E2-5 * E4-1 * E8-1 * E9-3 * E10-2* E11-3 * E11-4 E12 -1 * E13-1 * E13-2 E14-1 * E15-3* E17-2* E17-3 E18-1* E18-2 E18-3 E20-5 * E21-3 E21-10 * E22-5 * E23-2 *
2
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
transcription activator

酵母双杂交系统的原理

酵母双杂交系统的原理

酵母双杂交系统的原理酵母双杂交(systems)系统是一种基于酵母(yeast)细胞的生物技术，该技术用于研究蛋白质相互影响及其在蛋白质互作网络中的作用。

该技术采用重组DNA 技术将目标基因插入酵母细胞的基因组内，在酵母细胞内表达融合蛋白，通过检测融合蛋白的相互作用来分析蛋白质间的相互作用关系。

酵母双杂交系统的原理：酵母双杂交系统(principle of yeast two-hybrid system)基于蛋白质间的相互作用原理，其中包括：转录调控、信号传递及代谢途径等方面。

首先需要构建两个载体，一个是酵母转录因子的DNA结合结构域（BD）融合载体，另一个则是酵母活化装置的活化结构域（AD）融合载体。

在BD载体中含有一个目标基因的蛋白质结构域，该载体专门用于识别具有相互作用能力的肽链。

这个肽链是作为目标基因的蛋白质结构域插入到BD载体的后端，从而形成一个融合蛋白(BD-Target)。

在AD载体则含有另一目标基因的蛋白质结构域，该结构域是作为另一个相互作用配体的蛋白质结构域插入到AD载体的后端，并形成一个融合蛋白(AD-Target)。

当两个融合蛋白(BD-Target和AD-Target)进入同一个酵母细胞时，它们会自行相互结合。

这种相互结合会使BD域融合物释放出其与DNA结合的传输活性。

该生物技术利用此原理，通过分离酵母细胞中的mRNA，并对其进行筛查确定其结合后的特异性。

同时，酵母细胞也会检测信息的转移，并以此促进由两个融合蛋白之间的相互作用而激活的报告基因的表达。

这些报告基因可以编码酵母细胞中可见性较高的荧光蛋白，从而方便检测生物体中的酵母如何解释信号。

酵母双杂交系统的优势：酵母双杂交系统是一种非常有用的方法，可以在操作简单的情况下，高效地分析蛋白质间的相互作用及其生物学意义。

酵母双杂交系统的优点如下：1.可高效筛选蛋白质相互作用：酵母双杂交系统在高通量筛选系统中表现出良好的性能表现；这表明可以将其用于大规模筛选目标蛋白质相互作用蛋白。

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酵母双杂交技术的研究与应用摘要：酵母双杂交系统是在20世纪90年代初发展起来的利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的一种高度灵敏的分子生物学技术，它可以有效分离新基因或新的能与一种已知蛋白相互作用的蛋白质及其编码基因，被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一，获得了许多有价值的重要发现。

关键词：酵母双杂交系统；蛋白质组学；功能基因组学Abstract:Yeast two-hybrid system is a highly sensitive molecular biology technique,which uses genetic methods to study protein-protein interaction in eukaryotic yeast cells,developed in the early 1990s.It can effectively separate new genes or new protein which has interaction with a known protein and protein-coding genes, is widely used in the field of proteomics, cellular signal transduction and functional genomics, has become one of the important experimental methods in the molecular biology areas, gained a lot of valuable important discovery.Key words:Yeast two-hybrid system;Proteomics;Functional Genomics.随着分子生物学研究的迅猛发展与人类基因组计划的完成,基因工程领域的研究已从结构基因组时代走进了功能基因组时代。

功能基因组学的主要任务就是对生物基因组中包含的全部基因及其所翻译的蛋白质的功能加以分析，尤其是大量未知基因的功能及其相应蛋白质产物的功能。

酵母双杂交是目前研究蛋白-蛋白相互作用的所有方法中较为简便、灵敏和高效的一种方法。

它是利用酵母遗传学方法在真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的分子生物学技术，可有效地用来分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质的编码基因。

酵母双杂交技术的可行性和有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的诱饵蛋白的研究中已被广泛的得到证实。

1 酵母双杂交系统的基本原理酵母双杂交体系简称双杂交体系(Two-hybrid system)，是1989年由Fields[1]等在研究真核基因转录调控中提出并初步建立的。

该系统是建立在人们对酵母转录因子GAL4的认识基础之上，完整的酵母转录因子GAl4分为结构上可以分开的、功能上又相互独立的2个结构域，一个是位于N端l～174位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain，DNA-BD)，另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain，AD)。

DNA-BD能够识别GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)，并与之结合，而AD则通过与转录机器(Transcription machinery)中的其他成分之间的作用，启动UAS下游的基因进行转录。

这2个结构域通过共价或非共价连接是转录因子发挥转录功能的关键，两者单独存在的时候并不能激活下游基因的转录反应，只有两者在空间上较为接近时，才能表现完整的GAL4转录因子活性并激活UAS下游启动子，使其下游报告基因得到转录。

基于酵母转录因子GAL4的原理，Fields等建立了酵母双杂交系统，将可能存在相互作用的2种蛋白质，即已知蛋白X和待研究蛋白Y，分别作为诱饵(bait)和猎物(prey)，并分别和BD/AD在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列(UAS)结合，如果X和Y之间可以形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4的2个结构域AD和BD相互接近，表现出转录因子的活性从而启动转录，使UAS下游启动子调控的报告基因组氨酸基因(HIS)、腺嘌呤基因（ADE）、β-半乳糖苷酶基因（LACZ）、酵母半乳糖苷酶基因（MEL1）得以表达。

反之，如果诱饵和猎物之间不存在相互作用，BD与AD就不能结合，报告基因则不能被启动表达。

通过对报告基因表达进行检测，即可实现对蛋白质之间相互作用的研究。

在目前通用的酵母双杂交系统中，根据BD来源不同可分为真核细胞中的GAL4系统和原核细胞中的LexA系统[2]。

2 酵母双杂交系统的应用2.1 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，获得与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质案例1：酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与鼠巨细胞病毒即刻早期蛋白M122相互作用蛋白的研究[3]目的：巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是胎儿脑发育异常和免疫低下病人脑损伤最常见的感染性病因，但其致病机制至今尚未阐明。

鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)感染的神经系统病变特征与HCMV(human cytomegalovirus，HCMV)感染极其相似，故成为模拟HCMV感染导致脑发育异常机制研究的理想模型。

研究发现，MCMV即刻早期基因M122是病毒复制的必需基因。

这种嗜神经蛋白还可与宿主细胞蛋白相互作用并反式调节细胞特定基因表达，进而影响与细胞增殖、分化和细胞周期调控等相关信号通路。

推测M122蛋白可能在巨细胞病毒导致脑损伤的致病机制中起一定的作用[4,5]。

在本研究中，利用酵母双杂交技术筛选小鼠脑cDNA文库中与M122相互作用的蛋白，以期获得与其相互作用的蛋白分子，为进一步研究巨细胞病毒的致病机制奠定实验基础。

方法：①诱饵质粒在酵母菌AHl09感受态细胞中的表达：对诱饵质粒pGBKT7-M122进行毒性和自激活检测，再用醋酸锂法将诱饵质粒pGBKT7-M122、阳性对照pGBKT7-53分别转化酵母菌株AHl09，转化的酵母菌涂于SD/-Trp平板，30度培养3—5d。

挑取直径为2～3 mm大小菌落于SD/-Trp培养基中过夜培养，提取酵母蛋白,用c-myc单克隆抗体进行免疫印迹检测融合蛋白的表达。

②诱饵与鼠脑cDNA文库的酵母配合:将已证实可表达M122融合蛋白的单个酵母菌落经培养、离心后与血鼠脑cDNA文库混匀，加入完全培养基(YPDA)，30℃摇床中轻摇20—24 h后于相差显微镜下观察有―米奇‖样或―三叶草‖样的二倍体细胞出现后，将其离心并重悬于YPDA培养基中，将菌液铺板于缺少色氨酸，亮氨酸，组氨酸，腺嘌呤的SD培养基(SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade)平板上培养。

③阳性质粒的分析：挑取SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade平板上生长的直径为2～3 mm的菌落，重新划线于铺有酵母半乳糖苷酶(MEL1) 的显色底物（X-α-gal）的SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade平板上，30℃重复培养以得到单个的蓝色酵母菌落。

挑选单个的蓝色酵母菌落，酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。

提取质粒进行序列测定。

测序结果在GenBank数据库中进行同源性分析。

④一对一回返验证试验：按醋酸锂法将筛选出的阳性文库质粒与诱饵质粒pGBKT7-M122一对一共同转化酵母茵AHl09感受态细胞，转化菌液分别涂于SD／-Trp／-Leu和铺有X-α-gal的SD／-Trp／一leu／-His／一Ade平板上培养。

同时，筛选出的阳性文库质粒与空载体pGBKT7用同样的方法亦被共同转入AHl09感受态细胞，以检测筛选出的文库质粒是否有自激活作用。

同时设立AHl09(pGBKT7-53+pGADT7一T)为阳性对照，AHl09(pGBKT7／-53+pGADT7-lam)为阴性对照。

本研究筛选出与M122蛋白相互作用的21种已知基因编码的蛋白质和3种未知基因编码的蛋白，通过回返验证实验Ap1g1和Cul1蛋白被证实具有自激活作用，筛选到的其中19种已知基因编码的蛋白可能与巨细胞病毒的致病机制相关，仍需进一步的验证,为明确CMV感染引起脑发育异常和神经系统损伤的致病机制建立基础。

案例2：酵母双杂交筛选与禽流感核蛋白NP相互作用的蛋白[6]目的：禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染病。

禽流感核蛋白(nucleoprotein，NP)是流感病毒的结构蛋白，不仅在流感病毒的复制及感染方面起重要作用，还是决定病毒的宿主特异性的一个重要蛋白。

NP对病毒在宿主细胞的穿梭过程也起到了决定性作用，它可以同细胞多肽如肌动蛋白相互作用，对与禽流感病毒核衣壳蛋白复合体以及相关蛋白的出核运输有较为重要的功能[7]。

为了了解禽流感核蛋白NP对病毒的转录，复制和包装的作用，以及它能和细胞内哪些蛋白相互作用，本实验应用了酵母双杂交技术筛选对禽流感核蛋白NP相互作用的蛋白。

方法：①以禽流感核蛋白NP为诱饵，构建诱饵质粒pGBKT7-NP，并对这个质粒进行对酵母菌的毒性的检测，以及进行了自身能否激活报告基因的检测。

结果表明该诱饵质粒并没有影响酵母的正常生长，同时也没有发现自激活现象，能够应用于筛选。

②将此诱饵质粒转入酵母菌AHl09和携带人脑cDNA文库的Y187酵母菌进行交配，使得两种不同的质粒转入同一酵母菌株中，筛选出与诱饵蛋白发生作用的人脑cDNA文库中的靶蛋白。

③筛选出阳性的酵母文库质粒，并将这些质粒用同样的酵母转化的方法各自与pGBKT7质粒共转入酵母感受态AHl09中，在用缺少色氨酸和亮氨酸的SD培养基(SD／-Trp／-Leu)和用缺少色氨酸，亮氨酸，组氨酸，腺嘌呤的SD培养基(SD／-Trp／-Leu ／-His／-Ade)平板上培养。

在SD／-Trp／-Leu能长出1～2mm 的克隆，而SD／-Trp／-Leu／-His／-Ade平板上却没有，表明筛选到的单一文库质粒不能自发激活报告基因。

④将诱饵质粒和各个阳性质粒共转到酵母菌AHl09中进行回复验证，并用X-gal进行显色，排除假阳性。

通过酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与禽流感病毒蛋白NP相互作用的蛋白质，通过NCBI中BLAST分析，得到了明确的蛋白序列，并从中挑选了与NP相互作用的12种融合蛋白质，可以进一步了解禽流感病毒核蛋白NP在病毒的感染周期中的作用，并为理解病毒复制的分子机理以及在蛋白质水平上的与宿主蛋白相互作用关系提供线索。