膜转运蛋白的功能性超表达和纯化

ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2007年12月23(12):1051～1058・技术与方法・膜转运蛋白的功能性超表达和纯化谢　浩3,　李其昌,　郭小明(武汉理工大学理学院生物科学与技术系,武汉　430070)摘要　膜转运蛋白结构和功能的研究是功能膜蛋白质组研究中的一个重要内容,而大量蛋白质的分离纯化是进行蛋白质的结构和功能研究的基础.目前,结构和功能膜蛋白质组学相关研究的瓶颈,在于不能有效地超量表达和纯化具有生物活性的膜转运蛋白.影响膜转运蛋白超量表达和纯化的关键因素,包括目标蛋白的拓扑学结构分析和去垢剂的选择.进行膜转运蛋白拓扑学结构的分析,对于构建用于活体表达的重组膜转运蛋白具有指导意义.去垢剂能够稳定去膜状态的膜蛋白,在膜转运蛋白的离体表达和亲和纯化以及包涵体的处理过程中具有重要的作用.本文就目前功能膜蛋白质组学研究中所涉及的有关膜转运蛋白功能性超表达和分离纯化策略及关键技术作一简述.关键词　膜转运蛋白;功能性超表达;蛋白质纯化;去垢剂;拓扑学结构中图分类号　Q51;Q78Overexpression and Purification of Membrane Transport Proteinwith N ative FunctionsXIE Hao3,LI Qi 2Chang ,G UO X iao 2Ming(Department o f Biological Science and Biotechnology ,Institute o f Science ,Wuhan Univer sity o f Technology ,Wuhan 430070,China )Abstract Structural and functional characterization of membrane transport protein is very im portant infunctional membrane proteomics ,which relies on the is olation and purification of large am ount of functional proteins.H owever ,effective overexpression and purification of biologically active membrane transport proteins are the primary bottleneck in contem porary functional and structural proteomics studies.Crucial factors influencing membrane protein overproductions include topological analysis of target proteins and selections of detergents.T opological analysis provides valuable in formation in constructing recombinant membrane transport proteins for in vivo expression.Detergents ,which used to maintain the native structure and function of lipid 2free membrane proteins ,play im portant roles in cell 2free expression ,affinity purification of membrane transport proteins ,and in vitro their refolding from inclusion bodies.In this article ,we reviewed the key strategies and crucial techniques for the overexpression and purification of membrane transport proteins in functional proteomics.K ey w ords membrane transport protein ;functional over 2expression ;protein purification ;detergent ;topological structure收稿日期:2007207209,接受日期:2007209220国家自然科学基金(N o.30600004)资助3联系人　T el :027*********,E 2mail :h.xie @Received :July 9,2007;Accepted :September 20,2007Supported by National Natural Science F oundation of China (N o.30600004)3C orresponding author T el :027*********,E 2mail :h.xie @ 能够同外界环境进行物质和信息交换是活细胞的基本特征之一.通过这种物质和信息交换的生理活动,细胞能感受环境变化,获取新陈代谢所必需的营养物质,并排出代谢产物和废物.细胞对溶质的选择性吸收和排放主要是通过细胞膜上以膜转运蛋白为基础的运输系统实现的.自从上个世纪40年代大肠杆菌乳糖转运蛋白被发现以来,生物学家对膜转运蛋白的生物化学和生理学特性进行了大量研究.随着现代分子生物学技术和生物信息学技术的发展,对膜转运蛋白的结构和功能机制的研究,逐渐成为当前功能膜蛋白质组学研究的重要内容[1～6].膜转运蛋白与膜受体蛋白和呼吸链蛋白复合体等都是典型的嵌膜蛋白.近年来,我国在膜蛋白领域取得了突破性进展,尤其是饶子和研究组对呼吸链蛋白复合体Ⅱ的结构解析更是添补了生物化学教科书的空白[7].与其它蛋白质相比,膜蛋白有以下一些特点:(1)种类多,在人类基因组中有15%～39%基因编码跨膜蛋白[8],而细菌基因组编码的基因中有3%～10%是膜转运蛋白基因[9];(2)数量少,多数膜蛋白表达量少于细胞蛋白总量的0.1%[10];(3)通过跨膜区或者共价键与磷脂双分子层相连,部分或全部嵌入膜内,有的则是跨膜分布,具有多个跨膜螺旋,需要脂膜的存在维持其结构和功能.功能膜蛋白质组学的一个重要研究领域,就是研究细胞中所有膜蛋白的功能以及实现其功能的结构基础.在功能膜蛋白质组学研究中,对于膜转运蛋白的结构和功能研究有重要的理论和应用意义.例如,对植物膜转运蛋白如离子通道蛋白的研究有助于理解农作物对养分的吸收机制和耐盐碱耐旱机制[11,12],从而在基因水平对农作物进行品种改良[13,14].很多疾病也同膜转运蛋白的异常有关,如Ⅱ型糖尿病同葡萄糖转运蛋白G lut4有关[15],对于此类膜转运蛋白的研究有助于进行新药设计和新治疗方法的研究.同时,一些细菌的抗药性也同细菌膜转运蛋白有关[16].大量蛋白质的分离纯化,是进行蛋白质的结构和功能研究的基础.通常情况下,多数膜蛋白的表达量极低,膜蛋白结构和功能研究的瓶颈在于缺少有效的对膜蛋白的超量表达和纯化的技术,以及进行结构研究的有效手段.与其他类型的膜蛋白相比,膜转运蛋白基本上都是单基因编码产物[17],能够独立行使生理功能,成为一个比较好的功能性表达和纯化的研究对象.目前常用的纯化策略是:(1)利用分子生物学技术构建含有融合亲和标签(fusion affinity tag)的重组膜蛋白;(2)优化重组膜蛋白的功能性表达;(3)分离纯化所表达的膜蛋白,并进行活性测试和结构研究.这种策略的优点在于:一方面,融合亲和标签的引入有利于检测重组膜蛋白的表达和纯化;另一方面,易于对目标蛋白进行修饰和操作,而这些修饰和操作例如定点突变等可以为蛋白结构和功能的研究提供重要的信息.应用这一策略,多种膜蛋白获得了表达和纯化[18,19],D obrovetsky等更是对来源于大肠杆菌和嗜热菌Thermotoga maritima的280种重组膜蛋白进行了表达和纯化研究,表达了其中1Π3的重组膜蛋白,并纯化了22种高表达的重组膜蛋白[20].在构建和表达重组膜蛋白时,需要综合考虑膜蛋白的基本生物学特征尤其是拓扑学结构;而在膜蛋白质的分离纯化过程中,需要考虑选择合适的去垢剂以维持膜蛋白在去膜状态下构像和功能的稳定性.以下,本文将介绍目前功能膜蛋白质组学研究中所涉及的有关膜转运蛋白表达和分离纯化策略以及关键技术所取得的进展.1　膜蛋白的拓扑学结构和构建重组膜蛋白膜蛋白的拓扑学结构主要指蛋白质序列中的跨膜片段在膜上的取向,一般遵循疏水性原则(蛋白质跨膜区域必定是高度疏水区域)和正电荷氨基酸向内原则(正电荷氨基酸倾向于位于胞质一侧)[21].受益于各项基因组计划的完成,可以很容易地获取膜蛋白的序列,并基于膜蛋白序列中氨基酸侧链的亲水和疏水特性,可以利用很多程序或网站服务预测其拓扑学结构[21,22].Fig.1显示了根据氨基酸序列,利用T oppred[23]所预测的大肠杆菌的2种核苷酸转运蛋白Nup G和NupC的拓扑学结构.虽然这2种蛋白质的功能比较相似,都是核苷酸的次级转运蛋白,其拓扑学结构却明显不同,例如Nup G的有12个跨膜螺旋,N端和C端位于胞质一侧,而NupC只有10个跨膜螺旋,N端和C端位于细胞外侧.在构建用于活体表达的重组膜蛋白时,必须考虑蛋白质的拓扑学结构,尤其是所表达膜蛋白的N 端和C端是位于胞质一侧还是细胞外侧.一方面,膜转运蛋白的异源超表达受其第1跨膜螺旋位于脂膜外侧的N端序列影响.M onne等[24]对来源于酵母线粒体的11种转运蛋白利用乳酸乳球菌Lactococcus lactis的超表达研究表明,如果去掉酵母转运蛋白第1跨膜螺旋位于膜外侧的N端序列,或将其改变为源于乳酸乳球菌的信号序列,可以将其表达水平提高10倍以上.而在构建重组膜转运蛋白时,判断是否需要引入信号序列以利于蛋白质表达的依据是膜蛋白N端的位置.以上述大肠杆菌核苷酸转运蛋白Nup G为例,Nup G属于主易化扩散载体超家族(major facilitator superfamily,MFS),其N端位置位于胞质一侧,在构建重组Nup G时,不需要考虑引入和包含信号序列[19].类似的蛋白质还有LacY、G lpF[5,6].而上述核苷酸转运蛋白NupC属于富集型核苷转运蛋白(concentrative nucleoside transporter,C NT)家族[25],其2501中国生物化学与分子生物学报23卷Fig.1　Topological prediction of nucleoside transporters NupG and NupC from Escherichia coli T opological prediction is based on the protein sequences of Nup G and NupC by using webware T oppred[23].(A)The predicted topological structure of Nup G;(B)The predicted topological structure of NupCN端位于细胞外侧.本研究表明,在构建其表达载体,尤其是需要在N端引入亲和标签如M BP蛋白质时,需要同时引入和包含信号序列,才能成功地表达目标蛋白质.另一方面,根据膜转运蛋白的拓扑学结构和氨基酸侧链的极性,可以选择需要引入的亲和标签种类和位置.亲和标签是一段氨基酸多肽或蛋白质,在重组蛋白质中引入亲和标签的目的在于判断目标蛋白是否表达以及亲和纯化目标蛋白.T able1列出了常用的亲和标签[26].这些亲和标签的共同特点是能与一定的亲和介质结合,从而有利于含融合了亲和标签的重组蛋白质的亲和纯化.在引入亲和标签时需要遵循正电荷氨基酸向内原则,否则含有亲和标签的目标蛋白质的表达将会受到影响.以上文中大肠杆菌核苷酸转运蛋白Nup G和NupC为例.组氨酸含正电荷侧链,而NupC的C端位于大肠杆菌的细胞外侧,多聚组氨酸亲和标签的引入影响了NupC 的表达.在实践中,选择了含中性氨基酸侧链较多的Strep亲和标签,所构建的含有Strep亲和标签的重组NupC的表达量远远大于含有多聚组氨酸亲和标签的重组NupC.而Nup G的C端位于胞质侧,可以在Nup G的C端引入多聚组氨酸亲和标签,符合正电荷氨基酸向内原则,所构建的重组Nup G的表达不受影响[19].其他的膜转运蛋白,如大肠杆菌乳糖转运蛋白LacY,大肠杆菌甘油232磷酸转运蛋白G lpT,大肠杆菌Na+ΠH+反向转运蛋白NhaA的研究也有类似的结果[4～6].M ohanty等[27]研究也表明,对于N端和C端都位于胞质侧的大肠杆菌水通道蛋白AqpZ 而言,对于在N端或C端分别含有6～10个组氨酸的重组AqpZ蛋白,其表达不会受多聚组氨酸的长度和位置的影响.3501第12期谢　浩等:膜转运蛋白的功能性超表达和纯化　T able1　Locations of several affinity tagsA ffinity tag LocationsHis2tag N2,C2,internal S2tag N2,C2,internal Thioredoxin N2,C2Strep2tag N2,C2S treptococcal protein G N2,C2G lutathione2S2trans ferase(G ST)N2Maltose binding protein(M BP)N2,C2Calm odulin binding protein(C BP)N2,C22　重组膜蛋白的功能性超表达根据膜蛋白的拓扑学特性构建了含有亲和标签的重组膜蛋白后,需要选择合适的表达策略并优化表达条件,以获取大量具有活性的膜蛋白,从而利于后续的分离纯化以及结构功能研究.限制膜蛋白表达的因素包括:表达宿主缺乏有效的膜蛋白折叠机制或稳定机制;;重组膜蛋白对宿主的毒性;密码子偏爱性导致的蛋白质翻译的低效率;蛋白质翻译后加工修饰的错误或缺失[28].根据所表达的膜蛋白来源,可以选择的高效表达系统包括:活体表达系统如原核表达系统和真核表达系统;以及离体表达系统[29～33].对于来源于原核生物的膜蛋白,利用大肠杆菌表达系统取得了良好的效果.大肠杆菌等革兰氏阳性菌大多数膜蛋白的表达和折叠与信号识别颗粒(signal recognition particle,SRP)有关[34].膜蛋白在翻译的同时,在SRP 的作用下插入到膜上完成折叠.对重组膜蛋白功能性表达的优化的目的在于控制翻译和折叠的相对速度以达到膜蛋白的最佳表达效果.SRP介导的膜蛋白折叠,也涉及到宿主细胞折叠机制对异源重组膜蛋白的识别和折叠效率.因此,需要优化影响膜蛋白翻译和折叠的因素,例如,表达宿主和异源膜蛋白来源的同源性、培养温度和培养基成分、共表达蛋白质的选择等.一些表达成功的例子包括:大肠杆菌乳糖转运蛋白LacY、大肠杆菌甘油232磷酸转运蛋白G lpT、大肠杆菌Na+ΠH+反向转运蛋白NhaA、大肠杆菌核苷酸转运蛋白Nup G和NupC[4～6,18～20].一些来源于真核细胞的膜转运蛋白也可以利用原核系统,如乳酸乳球菌表达系统.乳酸乳球菌表达系统有很多适于表达异源膜蛋白质的优点,例如生长速度快不需要曝气;具有很多氨基酸营养缺陷型菌株可用于标记选择;构建的质粒载体稳定性高同时转化效率高;启动子调控区域控制严谨,适于表达毒性基因产物;膜蛋白表达量高且重复性好;基因组相对较小而其它基因产物表达较少,因此易于纯化目标蛋白;表达的膜蛋白容易定位于细胞膜,因而包涵体产生的机率极低;具有较温和的蛋白质降解机制;由于具有单层细胞膜,易于测试表达的膜蛋白的活性如离子通道蛋白;所表达的膜蛋白容易增溶,易于纯化[35].利用乳酸乳球菌表达系统,多种来源于真核和原核的膜蛋白得到了活性表达,例如机械敏感性通道蛋白、人类K DE L受体蛋白、ABC转运蛋白家族的转运蛋白、上文中提到的MFS家族的转运蛋白、源于线粒体载体蛋白家族的蛋白、以及一些多肽转运蛋白[35].M onne等[24]在对源于酵母线粒体的11种膜转运蛋白N端进行了合适的加工和修饰后,利用乳酸乳球菌表达系统也取得了较好的表达效果.然而,来源于真核生物的膜蛋白的功能性表达往往涉及蛋白质加工和分选的一系列过程,利用原核表达系统通常不能取得满意的效果.T ate等[36]利用大肠杆菌、酵母、杆状病毒表达系统,和4株不同的哺乳动物培养细胞系对小鼠52羟色胺转运蛋白(rat serotonin transporter,rSERT)进行了功能性表达研究.研究表明,大肠杆菌和酵母能够表达rSERT,但是所表达的蛋白质没有活性;杆状病毒表达系统所表达的rSERT蛋白质大部分是没有糖基化因而无功能的蛋白质;只有哺乳动物培养细胞系能够表达完全糖基化具有功能的rSERT蛋白质.Higgins等[37]利用2种昆虫细胞表达系统,即稳定昆虫细胞系和杆状病毒表达系统,对来源于果蝇的1种钾离子通道蛋白进行了表达研究.结果表明,只有稳定昆虫细胞系能够表达大量正确组装的位于质膜上的糖基化的离子通道蛋白,而杆状病毒表达系统表达的离子通道蛋白大多位于细胞内部,不能正确组装.他们的研究还发现,如果利用弱的蛋白质启动子,同时表达分子伴侣,能够提高离子通道蛋白的表达效率.这些研究证实,膜蛋白在被核糖体合成后需要一定的时间和适当的机制完成加工和折叠,以及最终的定位,这对于膜蛋白的功能性表达有重要意义.在活体表达系统中,很多因素都能导致膜蛋白表达的低效率,例如所表达的膜转运蛋白对宿主细胞有毒性作用,这时可以考虑利用离体表达系统表达膜转运蛋白[38].离体表达系统还能经济有效地标记目标蛋白,满足一些特殊研究的需要如NMR研究.K lammt等[39]利用大肠杆菌离体表达系统成功地表达了多药转运蛋白EmrE、SugE、T ehA和半胱氨酸4501中国生物化学与分子生物学报23卷转运蛋白Y fiK.这些离体表达的膜蛋白以聚集状态存在,加入去垢剂后,大多数膜蛋白可以溶解,经C D 光谱检测显示其二级结构以α螺旋为主,而且溶解的EmrE 、SugE 和T ehA 能够被重组到人工脂膜上.对EmrE 重组膜蛋白脂质体的转运活性检测表明,离体表达的EmrE 具有转运活性.去垢剂具有两极性,能够稳定去膜状态下膜蛋白的稳定性,如果直接在离体表达系统加入合适的去垢剂,可以获得以溶解状态存在的膜转运蛋白,例如多药转运蛋白EmrE 和机械敏感性通道蛋白MscL [40,41].这些膜蛋白可以直接用于构建重组膜蛋白脂质体.对MscL 重组膜蛋白脂质体的研究表明,加入去垢剂后离体表达的MscL 具有同活体表达的MscL 相似的活性.因此,利用离体表达系统可以获得具有合适构像和功能活性的膜转运蛋白质.3　关于包涵体的形成和处理重组蛋白异源活体表达过程中经常遇到的2个问题是:(1)表达宿主蛋白酶系统对所表达异源目标蛋白的降解和(2)目标蛋白表达在包涵体中.对于膜蛋白而言,蛋白质大部分包埋在质膜中,避免了蛋白酶的降解.对于质膜外的膜蛋白肽链,可以在分析膜蛋白拓扑学结构后预测其蛋白酶切位点,如果怀疑表达过程中有降解发生,可以通过点突变来钝化酶切位点,避免蛋白酶降解.包涵体的形成与外源蛋白的一些主要理化特性有关,如电荷数、形成转角的氨基酸含量、半胱氨酸及脯氨酸的比例、亲水性以及氨基酸总数等均能影响形成包涵体[42].对于膜蛋白而言,由于表达宿主缺乏原宿主翻译后修饰以及协助蛋白折叠的系统,或者表达速率过快,导致所表达的膜蛋白不能正确折叠和插入质膜,也会形成包涵体.而处于还原环境的细菌胞质不能有效地完成二硫键的氧化折叠[43],也是包涵体形成的原因.当目标蛋白表达在包涵体中时,可以通过优化表达条件减少包涵体的形成.通常考虑的因素包括表达宿主和载体的选择,培养基的选择及优化,培养温度的优化,诱导条件调试,如诱导物的浓度、诱导时机、诱导时间的优化,以及对目标蛋白进行一定结构的改造[44].目前,对于如何彻底避免包涵体的形成还没有非常理想的解决办法,对于不同的膜蛋白,需要尝试不同的策略来改善和克服这一问题.另一方面,包涵体的形成有利于一些蛋白质的纯化.然而,在纯化后必须利用一定的技术使表达在包涵体中的蛋白质重新折叠恢复原有构象,此过程涉及多种影响蛋白质结构稳定的因素,如去垢剂和膜脂的成分和比例、缓冲液离子强度、温度、作用时间,关键在于用何种比例的去垢剂和膜脂分子去处理彻底变性的膜蛋白,使其重新折叠恢复构象并重组到脂膜中.包涵体中膜蛋白的复性步骤通常为:(1)用各种去垢剂将膜蛋白从包涵体中溶解;(2)加入一定比例的去垢剂Π脂质分子混合物以替换原有的去垢剂;(3)移出所有去垢剂,使膜蛋白重组到脂膜中并恢复构象[45].目前,这方面的研究已取得了一定的结果,多种膜蛋白已从大肠杆菌所表达的包涵体中纯化并重新折叠恢复原有构象.例如来源于HI V 病毒的嵌膜蛋白Vpu 蛋白质从包涵体中纯化后,重组到脂膜上能够显示离子通道活性[46];表达于包涵体的植物叶绿体的通道蛋白T oc75和光吸收复合体Ⅱ及流感病毒的质子通道M2蛋白质在不同去垢剂的作用下,也成功地重新折叠并恢复构像[47,48].此外,一些生物公司所开发的膜蛋白复性试剂盒能够被用来使表达于包涵体的膜蛋白在纯化后恢复构像,例如美国ProF oldin 公司开发的膜蛋白复性试剂盒,提供了2种方式(柱结合方式和稀释方式)和20种条件来帮助研究者选择膜蛋白最佳复性条件[49].4　去垢剂的选择和重组膜蛋白的纯化含有融合亲和标签的重组膜蛋白的纯化涉及3个主要步骤:用合适的去垢剂从质膜上释放膜蛋白;用亲和层析柱或亲和介质吸附游离的膜蛋白;洗去杂质,洗脱膜蛋白.在这一过程中对去垢剂的选择必须考虑以下2点:(1)去垢剂对目标膜蛋白的增溶效率;(2)纯化之后采取何种策略去除去垢剂以进行结构和功能研究.膜蛋白在自然状态时需要质膜支持其结构和功能,在分离纯化过程中如何维持去膜状态下膜蛋白结构和功能的稳定性致关重要,通常是用去垢剂的双极性来实现,即去垢剂同膜蛋白以及膜脂的疏水部位相互作用,削弱膜蛋白与膜脂质分子间的疏水性结合,使膜蛋白从膜脂中释放出来.游离膜蛋白的疏水部位在去垢剂的保护下,保持原有构象,因而能够维持其原有功能,如对底物或抑制物等的结合.去垢剂分为离子型和非离子型2类.离子型去垢剂如十二烷基硫酸钠(S DS ),能使蛋白质以单体的形式被分离,但蛋白质都发生了高度变性.非离子型去垢剂如十二烷基2β2D 2麦芽糖苷(n 2dodecyl 2β2D 25501第12期谢　浩等:膜转运蛋白的功能性超表达和纯化　maltoside,DDM),辛基2β2D2吡喃葡糖苷(n2octyl2β2D2 glucopyranoside,OG),T riton X2100(TX100);两性去垢剂如十二烷基二甲胺氧化物(lauryldimethylamine oxide,LDAO).非离子型去垢剂和两性去垢剂对膜蛋白质的变性作用较弱,常用于膜蛋白的离子交换和亲和层析[50].去垢剂对膜蛋白的增溶效率与去垢剂的结构和临界胶束浓度(critical micelle concentration, CMC)有关,可以通过对去垢剂的种类和浓度的改变来优化.例如,不同去垢剂在不同浓度下对大肠杆菌核苷酸转运蛋白NupC的增溶效率明显不同, DDM和LDAO对NupC有较高的溶解效率,因而,在对NupC的亲和纯化实验中,可以采用DDM和LDAO来溶解NupC.用合适的去垢剂将含有亲和标记的重组膜蛋白从质膜上溶解后,再用亲和层析柱或亲和介质吸附游离的膜蛋白来进行亲和纯化实验,纯化步骤同可溶蛋白质的亲和纯化步骤基本相似.但是,必须注意溶液中去垢剂的浓度必须保持在临界胶束浓度之上,同时溶液中需含有高浓度甘油(20%),以维持膜蛋白的疏水构像和功能的稳定性[10].Fig.2显示了作者对大肠杆菌葡糖苷酸转运蛋白G usB的亲和纯化[10].Fig.2　A ffinity purification of the glucuronide transporter G usB from Escherichia coli[10]All sam ples were incubated at37℃for30m inutes.The G usB was detected by S DS2PAGE stained with C oomassie brilliant blue.The gel was loaded as follows:lane M,m olecular weight markers;lane M m,m ixed membranes from E.coli expressing G usB;lane Pt,ins oluble materials from m ixed membranes after s olubilization in DDM;lane Sn,s olubilized proteins from m ixed membranes;lane Ub,s olubilized proteins that did not bind with Ni2NT A resin;lanes E1,E2,E3,elution fractions with im idaz ole bu ffer.Arrow points to G usB 在去膜状态下,即使有去垢剂和甘油的共同作用,大多数膜蛋白的稳定性也不强.因此,在纯化后必须根据需要很快将膜蛋白重组到人工脂膜上,构建膜蛋白脂质体,恢复膜蛋白在脂膜上的结构和功能.在这一过程中,去垢剂的浓度需降至低于其临界胶束浓度,使膜蛋白脱离去垢剂的作用,插入到脂膜上以形成人工膜蛋白脂质体.去除去垢剂或降低去垢剂浓度的方法有稀释法、凝胶过滤法、透析法、离子交换层析法、及特殊的介质吸收法例如Biobeads.采用凝胶过滤法和离子交换层析法时,不利于膜蛋白在移除去垢剂的同时与膜脂分子相互作用.透析法移除去垢剂的速率较慢,常用于膜蛋白的二维结晶实验.在构建用于功能活性研究的人工膜蛋白脂质体时,通常采用稀释法或Biobeads吸收法移除去垢剂[10,19].选用高临界胶束浓度的去垢剂有利于从系统中快速去除去垢剂,所以在膜蛋白亲和纯化的同时交换去垢剂,将低临界胶束浓度的去垢剂交换成高临界胶束浓度的去垢剂.T able2显示了几种去垢剂的临界胶束浓度[51].其中DDM的临界胶束浓度低于LDAO的临界胶束浓度,如果用DDM增溶的膜蛋白如核苷酸转运蛋白NupC,可以在纯化过程中交换成LDAO,以利于在后续膜重组实验中移去LDAO,使NupC插入到脂膜形成人工膜蛋白脂质体进行功能活性研究.T able2　CMC values of several detergents[51]Detergent CMC valueDDM(n2dodecyl2β2D2maltoside)01009%(0118mm olΠL)TX100(T riton X2100)01015%(0124mm olΠL)NP24001018%(0129mm olΠL)LDAO(lauryl dimethylamine oxide)01023%(1mm olΠL)S DS0123%(8mm olΠL)CH APS0162%(10mm olΠL)OG(n2octyl2β2D2glucopyranoside)0173%(25mm olΠL) 6501中国生物化学与分子生物学报23卷。