碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
一、实验目的
1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；
2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理
有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。有机溶剂能使许多溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。
这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。
用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式
计算：
V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；
V0－原溶液的体积；
S1－原溶液中有机溶剂的浓度；
S2－要求达到的有机溶剂浓度； 100－指加入的有机溶剂浓度为100％。如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式(100一S2)项应改为(95一 S2)。
在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交叉方法求出。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究
董静 201131301031
摘 要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。
关键字：碱性磷酸酶 分离纯化 热稳定性 酸碱稳定性
碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析
实验日期 2011年10月25号 实验地点 生化实验室
合作者 指导老师
总分 教师签名
批改日期
碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重
组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一 实验原理
1、碱性磷酸酶的分离纯化
AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg•pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚
在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化
引言：
碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：
材料：
1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；
2. DEAE-纤维素离子交换柱；
3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；
4. 透析膜。
方法：
1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；
2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；
3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；
4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：
样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：
本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：
本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
