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高效液相色谱法同时检测荔枝果肉中甲基硫菌灵及其代谢物残留量王思威;刘艳萍;王潇楠;徐能莉;孙海滨【摘要】[目的]建立甲基硫菌灵和多菌灵在荔枝果肉中的高效液相色谱(HPLC)检测分析方法.[方法]样品采用甲酸-乙腈作为提取溶剂、乙二胺N-丙基硅烷吸附剂(PSA)进行净化,高效液相色谱检测分析荔枝果肉基质中的甲基硫菌灵和多菌灵残留量.[结果]甲基硫菌灵和多菌灵在为0.01～1.00 mg/kg添加水平下的添加回收率分别为78.9％～97.6％、79.8％～94.6％,相对标准偏差分别为2.08％～3.95％、3.04％～5.27％;最低检出量均为0.1 ng,最小检出浓度均为0.01 mg/kg.[结论]该前处理方法简便、有机溶剂用量少,准确度、精密度等均符合农药残留检测分析要求.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)035【总页数】3页(P174-176)【关键词】甲基硫菌灵;多菌灵;荔枝果肉;高效液相色谱法;代谢物;残留量【作者】王思威;刘艳萍;王潇楠;徐能莉;孙海滨【作者单位】广东省农业科学院植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点试验室,广东广州510640;广东省农业科学院植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点试验室,广东广州510640;广东省农业科学院植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点试验室,广东广州510640;广东省农业科学院植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点试验室,广东广州510640;广东省农业科学院植物保护研究所,广东省植物保护新技术重点试验室,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】TS207.5+3甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)是具有高效低毒的广谱性内吸杀菌剂，具有保护和治疗作用，广泛用于粮食、棉花、蔬菜、果树等多种作物上的病害防治，甲基硫菌灵在作物和土壤中使用后易转化为多菌灵[1-3]，我国规定甲基硫菌灵残留定义为甲基硫菌灵和多菌灵之和，以多菌灵表示。
多菌灵原药标准
一、外观
多菌灵原药的外观应为白色至灰黄色的结晶粉末，无可见杂质，无异味。
二、含量
多菌灵原药的含量应符合以下要求：
1.多菌灵含量不少于95.0%；
2.其他有机杂质的含量不超过5.0%。
三、熔点
多菌灵原药的熔点应不低于140℃。
四、溶解度
多菌灵原药易溶于有机溶剂，如甲醇、乙醇等，但在水中溶解度较小。
在常温下，多菌灵原药在水中最大溶解度不超过4.0%。
五、密度
多菌灵原药的密度应不低于1.20g/cm³。
六、稳定性
多菌灵原药应稳定，在常温下不易氧化变质，在正常贮存条件下，其贮存期应不少于两年。
七、无菌
多菌灵原药应无菌，在无菌条件下，多菌灵原药应无微生物生长。
八、酸碱度
多菌灵原药的酸碱度应用pH试纸或pH计测定，pH值应在5.0～7.5之间。
九、水分
多菌灵原药的水分应不超过0.5%。
十、重金属
多菌灵原药中的重金属应符合相关标准，如汞、铅、砷等重金属的含量均应不超过0.001%。
高效液相色谱法测定食用菌中福美双残留量摘要：建立食用菌中福美双残留量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。
新鲜食用菌子实体样品粉碎后经二氯甲烷超声（53 Hz）提取20 min，离心（3320 g、5 min）, 二氯甲烷经氮气吹干，甲醇定容后用HPLC测定。
以等体积甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相，1 mL/min等度洗脱，在0.05～10 μg/mL范围内，福美双的峰面积与其浓度呈线性相关，R≥0.999，方法检出限为0.02 mg/kg，添加回收率为79.4%～90.2%，变异系数为1.15% ～7.51%%。
关键词：福美双；食用菌；子实体; 高效液相色谱福美双（Thiram）是一种脊椎动物趋避剂、杀菌剂,对葡萄孢菌、黑星病菌、疫霉菌等都有活性，在我国是在蔬菜和食用菌中登记使用的农药。
福美双防治食用菌病害效果显著，因此被广大菇农使用［1］。
福美双对水生物和野生鸟类及哺乳动物存在危险，因此其残留危害不容忽视。
对于福美双的测定，主要有液相色谱法［2-7］，气相色谱法［8］，紫外分光光度法［9］。
气相色谱法的分析原理是将福美双经过酸分解产生二硫化碳，然后通过测定二硫化碳来计算福美双的含量，该测定方法的检出限能达到0.01 mg/kg ，但是有机硫杀菌剂，例如代森锌、代森锰、福美锌等均可被无机酸分解生成二硫化碳，无法区分实际使用的是哪种农药; 紫外分光光度法，其仪器测定的灵敏度和定性的准确度较差,较难满足目前对于农产品检测的苛刻要求; 本研究旨在建立食用菌中福美双残留量的高效液相色谱测定方法，给相关部门对于福美双残留量的监测提供参考。
1 材料与方法1.1材料香菇(Lentinus edodes)、柱状田头菇(Agrocybe cylindracea)、金针菇(Flammulina velutipes)、草菇(V olvariella volvacea)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)和刺芹侧耳(Pleurotus eryngii), 来源于上海市农业科学院食用菌研究所。
桃果实中多菌灵残留量的高效液相色谱-串联质谱结合QuEchERS检测方法李晓辉;程卫【摘要】为分析桃果实中多菌灵残留量,采用QuEchERS方法对样品进行前处理,建立了快速检测桃果实中多菌灵残留量的高效液相-串联质谱法.样品经乙腈提取、QuEchERS方法脱水盐析和萃取净化,采用Inertsil ODS-2(5mm,150mm×2.1mm)色谱柱进行分离,梯度洗脱,在多反应检测模式下测定.经方法学验证,在添加不同浓度的标准溶液时,多菌灵残留量的平均回收率为89.5％～94.4％,RSD为1.95％.该方法简单、快速,准确度高,能够满足多菌灵残留分析的要求.【期刊名称】《河北林业科技》【年(卷),期】2017(000)003【总页数】3页(P18-20)【关键词】桃果实;多菌灵残留量;QuEchERS【作者】李晓辉;程卫【作者单位】河北省林果桑花质量监督检验管理中心,河北石家庄050081;河北省林果桑花质量监督检验管理中心,河北石家庄050081【正文语种】中文【中图分类】TS272.7桃果实味道鲜美，营养丰富，是人们最喜爱的鲜果之一。
我国的桃产量位居世界第一位，但桃的出口额仅占世界出口额的1.38%，出口贸易不容乐观，最主要的原因是部分农残超标[1]。
苯并咪唑类药物作为广谱性内吸杀菌剂被广泛用于水果生产，而多菌灵是苯并咪唑类农药的主要种类之一[2]，因此桃病害的防治会使用大量的多菌灵。
由于多菌灵化学性质稳定，在自然环境中降解较慢，并对人体有一定的毒性[3-4]，因此，农产品中多菌灵残留量的测定越来越受到重视[5]。
目前，国内外多为关于多菌灵在苹果、柑桔、油菜等果蔬上残留的研究，而对于桃果实上多菌灵残留的研究则鲜有报道。
高效液相色谱-串联质谱技术具有检测灵敏度高、选择性好、适用范围广等优点而广泛应用于农药残留分析中。
QuEchERS方法具有快速、简单、便宜、有效、可靠和安全等优势，因此本研究利用高效液相色谱-串联质谱结合QuEchERS方法对桃果实中的多菌灵残留量进行测定，旨在为更好地研究桃果实中多菌灵的残留水平提供检测依据。
UHPLC与AxION 2TOF质谱联用快速定量分析橙汁中多菌灵进口橙汁中杀菌剂残留一直受到广泛关注，需要建立简单快速的分析方法。
一家私人公司向FDA报警称，从巴西进口的橙汁中含有杀菌剂即多菌灵。
在美国果汁中含有该物质是违法的，故该机构扩大了对进口产品中残留物的检测。
为了应对日益增加的关注，我们已经建立了一种快速的、简单的定量分析方法，该方法可以测定多菌灵浓度低至10ppb。
我们建立的方法既能够检测目标分析物如多菌灵，同时也可以检测非目标的化合物，该方法依靠带有UltrasprayTM 2离子源的AxION？2时间飞行（TOF）质谱仪（MS）提供全范围，高质量精度的数据，该离子源在飞行校准过程中具有质量锁定功能。
与三重四级杆仪器需要预先设定目标物不同，TOF可以通过不降低分析灵敏度的全范围扫描方式采集精确质量和高分辨率的数据，该数据可鉴定无限制数量化合物的结构。
任何感兴趣的目标化合物可以通过简单检索该分析物的精确质量而被检测到，且通过保留时间的匹配度进行快速确认。
利用一根表面多孔颗粒（SPP）的色谱柱，使得稀释-上样的样品前处理方式成为可能同时可以保证分离度且缩短传统UHPLC色谱柱的分析时间。
试验目标分析物：多灵菌；液相色谱条件：泵类柱：FlexarTM FX-15；色谱柱：PerkinElmer BrownleeTM SPP，C-18（2.1mm*100mm，2.7μm）流动相：A：含有5mM甲酸和5mM甲酸铵的水溶液；B：含有5mM甲酸和5mM甲酸铵的甲醇溶液；流速：0.3mL/min；梯度条件：进样体积：10μLMS条件：PERKINELMER AxION 2 TOF MS；离子源：UltraysprayTM 2 Dual ESI源；扫描范围捕及脉冲模式：100～400mz（D7：66，D8：80）；毛细管出口电压：+90V；干燥器温度和流速：350℃，12L/min；锁定质量校准流速和离子：35μL/min，利用m/z 322.04812和622.02896。
高效液相色谱法同时测定果蔬中多菌灵、麦穗宁、 甲基硫菌灵和硫菌灵的残留
摘要 采用高效液相色谱法测定黄瓜、苹果和西红柿中四种杀虫剂——多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵的残留量。样品经过乙腈提取，PSA净化后过滤膜，高效液相色谱分析，以乙腈/水（45/55, v/v）为流动相，在230 nm波长下检测。多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵在0.05～10 mg/L范围内的峰面积与其浓度均呈现良好的线性关系，最低检出限分别为5.35、9.85、7.62和13.5 µg/kg。保留时间的日内精密度和日间精密度分别低于0.89%和2.59%，峰面积的日内精密度和日间精密度分别低于2.59%和7.03%。样品的加标回收率在74.85%～102.3%之间，相对标准偏差在0.47%～6.40%之间。该方法操作简单、快速、灵敏，可用于果蔬中多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵的同时检测。 关键字： 高效液相色谱；多菌灵；麦穗宁；甲基硫菌灵；硫菌灵 1 引言 苯并咪唑类杀菌剂是以有杀菌活性的苯并咪唑环为母体的一类高效低毒、广谱、内吸性杀菌剂。多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵都属于苯并咪唑类杀菌剂[1]，它们广泛应用于果蔬等多种作物的生长期和储存期病害的防治，兼具预防和治疗的作用，与此同时也造成了其在农产品及食品中的残留, 影响了产品的质量和人们的饮食安全。它们能通过叶片、种子渗入农作物体内，也可进入土壤、地表水等人类生存环境，对人、畜产生一定的毒副作用。 联合国粮食及农业组织(FAO) 规定了多菌灵等杀菌剂在农产品中所允许的最高含量: 多菌灵0. 1 mg/kg(花生、甜菜、油菜籽等)、苯菌灵5 mg/kg(西红柿、甘蓝类蔬菜、芥菜等)、甲基硫菌灵2 mg/kg(香豌豆、芹菜、卷心菜)等。中国对农副产品中的多菌灵杀菌剂最终残留限量标准(MRLs)也作出了相应的规定:多菌灵3 mg/kg(梨、葡萄类水果等)、0. 5 mg/kg(黄瓜、西红柿等)[2]。 近年来，随着苯并咪唑类杀菌剂在无公害水果生产中的日益推广，又由于国外严格的农药残留限量标准，因此高效、灵敏、快速的检测方法的研发迫在眉睫。目前，对多菌灵等农药残留的测定主要有薄层色谱法[3]、荧光分光光度法[4]、高效液相色谱法(HPLC)[5-9]、气相色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、免疫学方法和生物法等。在已有的文献等的报道中，对多菌灵和甲基硫菌灵的检测以及这两种农药的同时检测的报道比较多[12]，对麦穗宁的残留检测的报道比较少，麦穗宁和多菌灵一样，也属于苯并咪唑类杀菌剂，如果使用不当，在杀菌杀虫的同时，在农产品中会造成一定的残留，因此，对麦穗宁的残留检测也具有一定的现实意义。另外，对多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵四种农药残留的同时检测还未见报道。 本文用高效液相色谱法对多菌灵等四种农药在黄瓜、西红柿和苹果中的残留进行了检测，样品经过乙腈提取，PSA净化后过滤膜，HPLC分析。本文为多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵在果蔬中的残留检测提供了一种简单、快速、高效的方法。 2 实验部分
2.1 仪器与试剂 LC310高效液相色谱仪（江苏天瑞仪器股份有限公司)；TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HY-4调速多用振荡器（金坛市科析仪器有限公司）；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。 多菌灵、麦穗宁、硫菌灵和甲基硫菌灵(结构式如图1)的标准品均购自Sigma-Aldrich公司(中国上海)；N-丙基乙二胺（PSA）和二甲基亚砜（DMSO）购自阿拉丁试剂公司(中国上海)；甲醇和乙腈（色谱纯）购自北京百灵威化学技术有限公司；无水硫酸镁(分析纯)；实验用水均为Milli-Q（美国Millipore公司）。 2.2 溶液的配制
分别精密称取多菌灵、麦穗宁、硫菌灵和甲基硫菌灵标准品10.0 g，溶解在
10 mL DMSO溶液中，制成1.0 mg/mL的标准储备液。标准工作溶液用甲醇/水（45/55，v/v）稀释。溶液放于4℃的冰箱中保存备用。 2.3 色谱条件 Waters C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 m），每一次实验结束，色谱柱要用100%有机相彻底冲洗；流动相为乙腈/水（45/55，v/v），流速为1.0 mL/min；紫外检测波长为230 nm；进样量为20 L；实验采用外标法定量。所有试剂在使用前都要过0.45 m的滤膜。 2.4 样品前处理[13,14] 2.4.1 试样的制备 分别取黄瓜、西红柿和苹果样品，取可食用部分，将样品用打浆机粉碎匀浆，制成试样备用，剩余试样于-18℃下保存。 2.4.2 样品的提取 分别称取2.5 g三种果蔬试样于10 mL具塞离心管中，加入2.5 mL乙腈，振荡使其混合均匀，然后加入1.5 g无水硫酸镁，剧烈振荡2 min，静置30 min，然后离心，在2500 r/min的转速下离心5 min，使乙腈相和水相分离。 2.4.3 样品的净化 移取1.0 mL上层乙腈溶液，加入200 mg无水硫酸镁和50 mg PSA吸附剂，在2500 r/min的转速下离心5 min，吸取上层乙腈溶液，过0.2 m的有机滤膜，进高效液相色谱仪检测。 NNHNHOOONHN
NHNHOSOHNHNSO
O
NHNHO
SOHNHNSO
O
CarbendazimFuberidazole
Thiophanate-methylThiophanate
图1 分析物的结构式 多菌灵（Carbendazim)；麦穗宁（Fuberidazole）；甲基硫菌灵（Thiophanate-methyl）和硫菌灵（Thiophanate） Fig. 1 Structure of analytes 3 结果与讨论
3.1 色谱条件的选择 高效液相色谱进行分离检测主要的影响因素有流动相的选择及其比例和检测波长的选择等。在流动相选择时，分别选择了常用的乙腈/水和甲醇/水作为流动相进行了分离检测。实验表明，乙腈的分离效果要比甲醇好，峰形也比较好。流动相的比例对分离效果有很大影响，乙腈的比例为50%时，多菌灵的出峰时间提前，和溶剂峰无法达到基线分离，且麦穗宁和甲基硫菌灵也不能达到基线分离；当乙腈的比例为40%时，多菌灵和溶剂峰达到基线分离，麦穗宁和甲基硫菌灵也完全达到基线分离，但是四种标准品完全分离所需要的时间过长；调节乙腈的比例为45%时，四种标准品的分离效果好，且完全分离所需要的时间有所提前，故选择乙腈/水的比例为45/55（v/v）。流动相的流速对四种农药的分离影响不大，故选择了1.0mL/min。 在选择检测波长时，为了兼顾四种农药的灵敏度，分别选择了230 nm和286 nm进行考察，结果表明，在230 nm的检测波长下，四种分析物的灵敏度较高，所以检测波长选择230 nm。 3.2 标准曲线和检出限 配制多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵质量浓度均为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/L的系列混合标准溶液，在最佳色谱条件下进样，测定其峰高和峰面积，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制混合标准溶液的工作曲线，得到多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵的标准曲线回归方程分别为y = 6534.0 x + 746.21（R2 = 0.9992）、y = 4058.3 x + 347.55（R2 = 0.9995）、y = 7447.2 x + 128.14（R2 = 0.9998）和y = 8171.7 x - 207.90（R2 = 0.9997）。结果表明，在0.05~ 10.0 mg/L范围内，各标准品质量浓度与峰面积值具有良好的线性关系。 以空白样品的3倍信噪比（3S/N）确定各物质的最低检出限分别为：多菌灵5.35 µg/kg；麦穗宁9.85 µg/kg；甲基硫菌灵7.62 µg/kg和硫菌灵13.49 µg/kg。 3.3 重现性和精密度
配制多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵质量浓度均为1.0 mg/L的混合标
准溶液，日内连续进样6次和日间累计进样6次，得到各物质的保留时间和峰面积值，计算其日内精密度和日间精密度。结果见表1，4种多菌灵农药的日内保留时间和峰面积的相对标准偏差值分别低于0.89%和5.65%，而日间保留时间和峰面积的相对标准偏差值分别低于2.59%和7.03%。由此可见，该方法重现性行良好，对多菌灵等农药的检测具有良好的精密度。 表1 重现性和精密度实验 Table 1 Results of reproducibility and precision tests
相对标准偏差（RSD，%） 日内精密度 (n = 6) 日间精密度 (n = 6) 保留时间 峰面积 保留时间 峰面积 多菌灵 0.71 2.08 0.77 3.96 麦穗宁 0.89 4.24 1.41 3.74 甲基硫菌灵 0.58 5.65 1.34 4.53 硫菌灵 0.86 3.16 2.59 7.03
3.4 样品测定及回收率实验 分别取三种空白果蔬样品和分别添加0.2、0.5和1.0 mg/L 3个水平的4种农药标准品的果蔬样品，按照上述样品的提取和净化方法进行处理，HPLC检测，平行测定6次，进行加标回收率测定，其结果见表2。多菌灵、麦穗宁、甲基硫菌灵和硫菌灵在三种样品中的平均回收率数值分别为74.85%~97.19%、75.41%~96.27%、78.38%~95.96%和83.81%~102.3%，相对标准偏差值分别为0.47%~6.40%、0.98%~3.02%、1.01%~4.24%和0.87%~3.6%。实验得到空白样品和加标样品（1.0 mg/kg）的谱图（图2、图3、图4），从中可以看出，三种空白果蔬样品中都没有多菌灵等农药残留。
表2 回收率和精密度实验 Table 2 Results of recovery and precision tests
