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水产品中西加毒素的测定

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食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定1范围本标准规定了水产品中西加毒素的测定方法㊂本标准适用于水产品可食部分中西加毒素的测定㊂第一法小鼠生物法2原理用丙酮提取水产品中西加毒素,提取物经减压蒸干后,再以1%吐温-60生理盐水为分散介质,制备西加毒素-1%吐温-60生理盐水混悬液,将该混悬液注射入小鼠腹腔,观察小鼠存活情况,根据西加毒素致小鼠死亡时间和鼠单位的关系表查出对应的鼠单位,并按小鼠体重校正鼠单位,计算确定西加毒素含量(鼠单位毒力)㊂3试剂和材料除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂3.1试剂3.1.1吐温60(C64H126O26)㊂3.1.2苦味酸[HO-C6H2(N O2)3]㊂3.1.3丙酮(C H3C O C H3)㊂3.1.4甲醇(C H3O H)㊂3.1.5正己烷(C6H14)㊂3.1.6乙醇(C H3C H2O H)㊂3.1.7乙醚(C H3O C H3)㊂3.1.8氯仿(C H C l3)㊂3.1.9次氯酸钠(N a C l O)㊂3.1.10生理盐水㊂3.2试剂配制3.2.1次氯酸钠溶液(5%):称取次氯酸钠50g,用9950m L水溶解,搅拌使次氯酸钠充分溶解㊂3.2.2甲醇溶液(90%):量取100m L甲醇,加入900m L水,混匀㊂3.2.3乙醇溶液(25%):量取250m L甲醇,加入750m L水,混匀㊂3.2.4氯仿-甲醇溶液(3+97):将氯仿与甲醇按体积比为3ʒ97混合均匀㊂3.2.51%吐温60-生理盐水:用生理盐水将吐温60稀释为吐温60含量为1%的溶液㊂3.3标准品太平洋西加毒素-1(P-C T X-1,C60H88O19):纯度ȡ90%㊂3.4材料小鼠:昆明系封闭群清洁级(C L)或无特定病原菌级(S P F),且体重为18g~22g的健康雄性小鼠㊂4仪器和设备4.1电子天平:感量为0.001g㊂4.2均质器㊂4.3恒温水浴箱㊂4.4旋转蒸发仪㊂4.5氮气浓缩仪㊂5分析步骤5.1试样制备水产品取其可食部分(去骨),切成小块,制成肉糜㊂于-18ħ以下保存㊂5.2试样提取取试样200g置于塑料袋内,于70ħ水浴15m i n㊂取出冷却后,加丙酮400m L,均质10m i n,用布氏漏斗抽滤并收集滤液㊂肉渣再重复萃取两次㊂合并滤液,于55ħ旋转蒸发浓缩至近干㊂加入100m L甲醇溶液(90%)溶解,转移至500m L分液漏斗中,再加入100m L正己烷,充分振荡萃取,静置约30m i n以上,待分层完全,弃去上层正己烷层,收集下层甲醇溶液层㊂再加入100m L正己烷重复萃取一次㊂将下层的甲醇溶液于55ħ旋转蒸发至干,以100m L乙醇溶液(25%)溶解,并转移至分液漏斗中,加入100m L乙醚充分振荡萃取,静置10m i n以上,待分层完全,收集上层乙醚层㊂下层溶液再用乙醚萃取两次㊂合并乙醚萃取液,于40ħ旋转蒸发至近干㊂浓缩物用5m L氯仿-甲醇溶液(3+97)溶解并转移至刻度试管中,于45ħ用氮气浓缩至干,用1%吐温60-生理盐水定容至2m L,充分振荡,制成均匀西加毒素-1%吐温60-生理盐水混悬液㊂0.5m L该混悬液相当于50g试样㊂以此混悬液进行小鼠实验㊂注:为避免毒素的危害,应戴手套进行操作,用过的器材应在次氯酸钠溶液(5%)中浸泡1h以上,以使毒素分解㊂5.3小鼠试验5.3.1实验动物的饲养小鼠在通风㊁透光㊁清洁的室内环境饲养,实验期间正常供给标准啮齿类动物食物和饮水㊂5.3.2小鼠试验将小鼠随机分为试验组㊁溶剂对照组㊁空白对照组3组,每组3只小鼠,每只小鼠称重(精确至0.5g),并记录体重㊂用染色法(如3%~5%苦味酸溶液或其他染色剂)做好编号㊂5.3.2.1试验组每只试验组小鼠腹腔注射0.5m L试样提取液㊂若注射时注射液溢出,须将该只小鼠弃去,并重新注射一只小鼠㊂5.3.2.2溶剂对照组每只溶剂对照组小鼠腹腔注射0.5m L1%吐温60-生理盐水,以排除吐温60-生理盐水可能产生的影响㊂5.3.2.3空白对照组每只空白对照组小鼠不进行腹腔注射,与实验组和溶剂对照组的小鼠在相同的环境和条件下饲养㊂5.3.3小鼠体征观察记录注射开始和完毕时间,仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间(到小鼠呼出最后一口气止)㊂小鼠中毒死亡症状:活动能力异常(减少至不活动)㊁步态异常(正常:慢走或快走,异常:兴奋的㊁不稳的)㊁腹泻㊁呼吸困难(急促浅的或喘息)㊁肤色青紫(主要在阴茎㊁耳㊁鼻㊁口㊁尾部)㊁竖毛(轻至显著)㊁颤抖(阵发性或持续)㊁麻痹(阵发至后腿麻痹)㊁多涎(可能浸湿脸部和胸前毛)㊁直至挣扎跳跃最后死亡㊂小鼠在注射2h内要仔细观察,连续观察400m i n,当小鼠接近死亡时更要密切观察,准确记录死亡时间(直至小鼠呼出最后一口气止)㊂6分析结果的表述6.1试样中西加毒素毒力的计算观察从注射开始至400m i n小鼠的毒效应体征和存活情况,计算出一组3只小鼠中死亡2只以上的中位数死亡时间㊂根据中位数死亡时间,在表A.1中查出对应的MU㊂若小鼠体重小于或大于20g,则根据附录B查出重量校正系数C㊂试样中西加毒素的毒力按式(1)计算:X=MUˑCˑf (1)式中:X 试样中西加毒素的毒力,单位为鼠单位毎五十克(MU/50g);MU 0.5m L小鼠腹腔注射液中所含的西加毒素的鼠单位数,单位为鼠单位毎五十克(M U/50g);C 小鼠体重校正系数;f 试样提取液的稀释倍数㊂1MU的定义为使体重为20.0g的无特定病原体级(S P F)昆明系雄性小鼠400m i n死亡的毒力,相当于9.10n g西加毒素㊂6.2结果判断若实验组所有小鼠死亡时间大于400m i n,则该报告样品中西加毒素毒力小于0.98MU/50g㊂若实验组中位数死亡时间50m i n~400m i n,则按式(1)计算,并报告样品中西加毒素毒力为:ˑˑˑMU/50g㊂若实验组中位数死亡时间小于50m i n,则应对试样取液进行稀释,再选取3只小鼠进行实验,直到得到中位数死亡时间为50m i n~400m i n为止,根据式(1)计算,并报告样品中西加毒素毒力为:ˑˑˑMU/50g㊂7其他方法的检出限为0.98MU/50g㊂第二法液相色谱-串联质谱法8原理试样中的西加毒素经甲醇提取,C18固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量㊂9试剂和材料除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂9.1试剂9.1.1甲醇(C H4O):色谱纯㊂9.1.2甲酸(C2H4O2):色谱纯㊂9.1.3乙酸铵(C3H8C O2N):色谱纯㊂9.2试剂配制9.2.1乙酸铵溶液(10mm o l/L):准确称取0.077g乙酸铵于烧杯中,用适量水溶解,转移至100m L容量瓶中,用水定容至刻度,混匀㊂9.2.2甲醇-乙酸铵溶液(10m m o l/L)(95+5):准确量取5m L乙酸铵溶液(10m m o l/L),转移至100m L 容量瓶中,用甲醇容至刻度,混匀㊂9.2.3甲醇溶液(50%):将甲醇和水等体积混合㊂9.3标准品西加毒素标准品[(P-C T X-1,C60H88O19)㊁(P-C T X-2,C60H88O18)㊁(P-C T X-3,C60H88O18)]:纯度ȡ90%㊂9.4标准溶液配制9.4.1标准储备液(1m g/L):分别准确称取各适量(精确至0.1m g)的西加毒素(P-C T X-1,P-C T X-2, P-C T X-3)标准品,分别用甲醇配制成浓度为1m g/L标准储备液,于-18ħ避光可保存6个月㊂9.4.2混合标准中间液(0.01m g/L):分别吸取适量西加毒素(P-C T X-1㊁P-C T X-2㊁P-C T X-3)标准储备液(1m g/L),用甲醇稀释成西加毒素(P-C T X-1㊁P-C T X-2㊁P-C T X-3)浓度均为0.01m g/L的混合标准工作液,于-18ħ避光可保存3个月㊂9.4.3基质匹配的标准系列工作液:吸取适量的混合标准中间溶液(0.01m g/L),用空白溶液配制成浓度为0μg/L㊁0.1μg/L㊁0.25μg/L㊁0.5μg/L㊁1.0μg/L㊁10.0μg/L的基质匹配的标准系列工作液㊂现用现配㊂9.5材料9.5.1 C18固相萃取柱:200m g/3m L㊂使用前依次用6m L甲醇和6m L水活化,保持柱体湿润㊂9.5.2微孔滤膜:0.22μm,有机相型㊂10仪器和设备10.1液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源(E S I)㊂10.2分析天平:感量0.1m g和0.01g㊂10.3氮气浓缩仪㊂10.4冻干机㊂10.5粉碎机㊂10.6离心机:转速ȡ5000r/m i n㊂10.7均质器:3400r/m i n~24000r/m i n㊂10.8涡旋振荡器㊂10.9超声波发生器㊂11分析步骤11.1试样制备水产品取其可食部分,切成小块,制成肉糜㊂于-18ħ储存㊂11.2试样提取称取5g(精确至0.01g)试样,经冻干后充分碾碎置于50m L具塞离心管中,加入10m L甲醇和5m L正己烷,以5000r/m i n均质提取1m i n,涡旋混匀后超声提取15m i n,于5000r/m i n离心3m i n,弃去上层正己烷相,将甲醇转移至试管中㊂残渣再用10m L甲醇重复提取一次,合并提取液,于45ħ以氮气浓缩至约5m L,加5m L水,混匀后待净化㊂11.3试样净化将上述待净化液转入活化过的C18固相萃取柱中,以约1m L/m i n的流速使净化液全部通过,用6m L甲醇溶液(50%)淋洗并抽干㊂用4m L甲醇洗脱,收集全部流出液于20m L离心管中,于40ħ以氮气浓缩至干㊂残渣用甲醇-乙酸铵溶液(10mm o l/L)定容至1m L,旋涡混合后过微孔滤膜,供液相色谱-串联质谱测定㊂11.4仪器参考条件11.4.1液相色谱参考条件a)色谱柱:C18柱,柱长50mm,内径2.1mm,粒径2.5μm,或同等性能的色谱柱;b)柱温:30ħ;c)进样量:20μL;d)流动相㊁流速及梯度洗脱条件参见表1㊂表1流动相梯度洗脱程序时间m i n流速m L/m i n含0.1%甲酸的乙酸铵溶液(10mm o l/L)%甲醇-含0.1%甲酸的10mm o l/L乙酸铵溶液(10mm o l/L)(95+5)00.2550501.00.255050表1(续)时间m i n流速m L/m i n含0.1%甲酸的乙酸铵溶液(10mm o l/L)%甲醇-含0.1%甲酸的10mm o l/L乙酸铵溶液(10mm o l/L)(95+5)1.10.2520802.00.2520802.10.2501004.00.2501004.10.2550508.00.25505011.4.2质谱参考条件a)电离模式:E S I;b)扫描方式:正离子扫描;c)监测方式:多反应监测;d)电离电压:2.8k V;e)源温:120ħ;f)雾化温度:350ħ;g)锥孔气流速:50L/h;h)雾化气流速:450L/h;i)数据采集窗口:8m i n;j)驻留时间:0.3s;k)定性㊁定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压:见表2㊂表2西加毒素定性㊁定量离子对和锥孔电压及碰撞电压化合物名称参考保留时间m i n定性离子对m/z锥孔电压V碰撞电压VP-C T X-12.911058.0>1129.03018 1040.0>1129.03015 1076.0>1129.0*3013P-C T X-23.201042.0>1113.02818 1060.0>1113.02815 1078.0>1113.0*2813P-C T X-33.501042.0>1113.02818 1060.0>1113.02815 1078.0>1113.0*2813*为定量离子对,对于不同质谱仪器,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳㊂11.5 标准曲线的制作将基质匹配的混合标准系列工作液注入液相色谱-串联质谱仪测定,得到西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的峰面积㊂以基质匹配的混合标准工作溶液浓度为横坐标,西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线㊂西加毒素标准的多反应监测色谱图参见附录C ㊂11.6 测定将空白溶液和试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪测定,得到待测物的峰面积㊂由标准曲线得到试样溶液中西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的浓度㊂试样溶液中的西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的色谱峰的保留时间与西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)标准的色谱峰的保留时间的偏差在ʃ2.5%之内;定性离子的相对丰度与对应标准品的相对丰度一致,且相对丰度允许偏差不超过表3规定的范围㊂表3 定性离子的相对丰度比的最大允许偏差相对离子丰度%>50>20~50>10~20ɤ10允许的最大偏差%ʃ20ʃ25ʃ30ʃ5011.7 空白试验除不加试样外,采用与试样完全相同的步骤同时操作㊂12 分析结果的表述试样中西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的含量按式(2)计算:X =(ρ-ρ0)ˑV m ˑ1000(2)式中:X 试样中西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的含量,单位为微克每千克(μg /k g );ρ从标准工作曲线得到的试样溶液中西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的浓度,单位为微克每升(μg /L );ρ0 从标准工作曲线得到的空白溶液中的西加毒素(P -C T X -1,P -C T X -2,P -C T X -3)的浓度,单位为微克每升(μg /L );V 试样溶液的体积,单位为毫升(m L );m试样质量,单位为克(g)㊂1000换算系数㊂结果保留两位有效数字㊂13 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的30%㊂14其他本方法西加毒素(P-C T X-1,P-C T X-2,P-C T X-3)的检出限均为0.02μg/k g,定量限均为0.05μg/k g㊂。

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食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定(编制说明)

食品安全国家标准 水产品中河豚毒素的测定(编制说明)

《食品安全国家标准水产品中河豚毒素的测定》（征求意见稿）编制说明一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等）1、任务来源与项目编号：根据《食品安全法》和国务院部署，国家卫生和计划生育委员会食品安全标准与监测评估司下达的2014年食品安全国家标准制整合工作计划，项目编号为ZHENGHE-2014-356和ZHENGHE-2015-356。

2、标准起草单位、起草人标准起草单位为：国家食品安全风险评估中心、中国水产科学研究院黄海水产研究所、威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国福清出入境检验检疫局、农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（舟山）、深圳市罗湖区疾控中心。

标准起草人为：李凤琴、江涛、郭萌萌、计融、李楠、韩春卉、张宏元、赵熙、李兆新、谭志军、翟毓秀、张靖、王静、郑香平、杨方、张小军、岳亚军、赖少阳。

3、简要的起草过程根据2014年食品安全国家标准整合工作安排，由国家食品安全风险评估中心和中国水产科学研究院黄海水产研究所共同承担完成《水产品中河豚毒素的测定》标准的修订与整合工作，项目编号为ZHENGHE-2014-356。

项目承担及参与单位对GB/T 5009.206-2007《鲜河豚鱼中河豚毒素的测定》、SN/T 1569.2-2013《出口河豚鱼中河豚毒素检测方法第二部分：小鼠生物法》和GB/T 23217-2008《水产品中河豚毒素的测定液相色谱-荧光检测法》进行了修订与整合。

标准的整合工作以河豚毒素的检测方法为基础，对相同的检测方法的进行整合。

在整合的同时，根据前期专家对《水产品中河豚毒素的测定》标准提出的意见与建议，项目的参与单位在对检测方法进行实验室验证的基础上，将其中存在的问题进行了修订，现整合制定《食品安全国家标准水产品中河豚毒素的测定》。

标准的整合过程主要分为标准方法整合、实验室验证、技术内容确定、标准编写等阶段，最终形成标准征求意见稿。

水产品检测 范围及项目

水产品检测 范围及项目

水产品是海洋和淡水渔业生产的水产动植物产品及其加工产品的总称。

检测范围：
1、捕捞和养殖生产的鱼、虾、蟹、贝、藻类、海兽等鲜活品；
2、经过冷冻、腌制、干制、熏制、熟制、罐装和综合利用的加工产品。

检测项目：
1、重金属检测指标：铅、铜、镉、铬、汞、锌、锰、无机砷等。

2、农残检测指标：五酚及其钠盐、敌敌畏、磷、六六六、滴滴涕等。

3、有机污染检测指标：多氯联苯、苯并芘等。

4、兽残检测指标：呋喃代谢物、四环素类、磺胺类、噁喹酸、喹诺酮类、氯霉素类、类、结晶紫和无色结晶紫、孔雀石绿和无色孔雀石绿等。

5、毒素检测指标：失忆性贝类毒素、麻痹性贝类毒素、腹泻性贝类毒素、河豚毒素等。

6、微生物检测指标：菌落总数、副溶血性弧菌、粪大肠菌群计数、大肠埃希氏菌计数等。

7、病毒检测指标：白板综合征病毒、对虾传染性皮下组织坏死病毒、桃拉综合征病毒、对虾肝胰腺细小病毒、虾黄头病毒、斑节对虾杆状病毒等。

水产品中抗生素残留测定,实验报告

水产品中抗生素残留测定,实验报告

水产品中抗生素残留测定,实验报告液相色谱法测定水产品中的抗生素残留液相色谱法测定水产品中的抗生素残留随着我国养殖业的发展，越来越多的被应用于渔业生产中，这些药物的使用几乎贯穿养殖的全过程，由于养殖户不遵守休药期规定及未正确使用药物，造成在水产品中的高水平残留。

人长期摄入含抗生素残留的水产品后，药物不断在体内蓄积，当浓度达到一定量后，就会对人体产生毒性作用，四环素类药物的毒性反应主要表现为对胃、肠、肝脏的损害及牙齿的染色等。

还会造成过敏反应，二重感染，致畸胎作用。

而氯霉素有严重的副作用，它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病，对人类的健康构成潜在的危害。

因此，水产品中抗生素残留量的检测技术，日益受到国内外学者的关注。

本文研究了用全自动固相萃取(AUTOSPE)-高效液相色谱法进行4种抗生素的同时固相萃取和测定的最佳条件，结果令人满意。

现将研究结果总结如下：一、实验部分1、仪器与试剂LC7000型高效液相色谱仪，LC7060 二极管阵列检测器，LC7050自动进样器;SUPELCODISCOVERY C185μm 250×4.6mm色谱柱。

固相萃取小柱为ZORBAX SPE C18Cart。

12头固相萃取真空富集装置(AlltechScientific Limited)。

超声波清洗器KS—500D，超速离心机LD4 —2，搅肉机，涡旋混合器。

甲醇(色谱纯)，磷酸二氢钠(分析纯)，EDTA(分析纯)，高氯酸溶液(优级纯)、硝酸(优级纯)。

土霉素、四环素、金霉素、氯霉素标准品(SIGMA公司)。

2、高效液相色谱分析条件色谱柱为SUPELCO DISCOVERY C185μm 250×4.6mm，流动相为0.O1mol/L磷酸二氢钠+0.001 mol/L EDTA:甲醇=60:40(V/V，pH=2.0)，流速为0.8ml/min，检测波长为268nm柱温为25℃，进样量为20μl。

无药可解，最常见的海鲜毒素

无药可解，最常见的海鲜毒素

无药可解，最常见的海鲜毒素作者：七君来源：《电脑报》2021年第22期你是否有这样的经历：吃了一顿海鲜大餐后，回到家里头晕眼花、手脚发麻、上吐下泻。

如果你曾经出现这样的症状，那么你很有可能中了世界上最常见的海鲜毒素的招。

这种海鲜毒素叫作西加鱼毒素（Ciguatera，也叫雪卡毒素），它没有解药，人体也不会对它产生免疫力。

不过别担心，西加鱼毒素通常不致命。

然而，这种毒素会让你在短时期内无法再次享受海鲜，也不能碰酒精、咖啡和坚果。

西加鱼毒素听起来像是针对鱼的毒素，但实际上它主要是浮游生物鞭毛藻制造的，并通过食物链向上累积。

这种毒素对鱼没有毒性，鱼吃了没事儿，但人吃了却受不了。

由于能够制造西加鱼毒素的冈比甲藻属和福冈属的鞭毛藻需要阳光，西加鱼毒素通常在敞亮的珊瑚礁附近富集，那里的海鲜体内的西加鱼毒素含量更高。

据世界卫生组织介绍，超过400种珊瑚礁鱼类含有西加鱼毒素，其中包括超受欢迎的商业鱼种，如石斑鱼、海鲈鱼和红鲷。

除了珊瑚礁鱼类，在珊瑚礁出没的螃蟹、龙虾、海胆和贝类也都有可能携带西加鱼毒素。

历史上，荷马和亚历山大大帝都曾提到西加鱼毒素中毒的问题。

首批登陆澳大利亚东岸的欧洲人之一库克船长，在1773年的日志中也记载了西加鱼毒素中毒的情况。

一般在吃了含有西加鱼毒素的海鲜3～6小时后，人就会不太对劲。

患者会感到恶心、眩晕、眼睛模糊、嘴巴发麻，有时中毒的人的冷热感颠倒，比如觉得热的东西摸起来是冷的。

这是因为，西加鱼毒素主要作用于细胞膜上的钠离子通道，它会让本来关闭的钠离子通道开启，让细胞里一下子冲进来一大堆钠离子，最终让感觉运动神经的传输速度变慢。

一些研究还发现，西加鱼毒素可以穿越血脑屏障进入大脑，影响中枢神经系统。

西加鱼毒素引发的症状有时持续几天，有时可持续数月甚至数年。

在症状消失后，医生一般会建议患者在6个月里不要碰鱼类、坚果、酒精和咖啡。

欧洲食品安全局（EFSA）表示，西加鱼毒素中毒是全球最常见的海鲜中毒，每年有5万～20万人中招。