纤维素分解菌分离 纯化与鉴定的研究进展

第３期（总第３４６期）　农产品加工（学刊）　２０１４年３月　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌ　ｏｆ　Ｆａｒｍ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｎｏ．３　

Ｍａｒ．　

文章编号：１６７１—９６４６（２０１４）０３ａ一００４８—０３　

纤维素分解菌分离纯化与鉴定的研究进展　

李美群，艾文胜，杨　明，孟　勇，涂佳，刘翔博，蒲湘云　（湖南省林业科学院，湖南长沙４１０００４）　

摘要：以竹基质、秸秆、堆肥、土壤等为对象，概述分离、筛选、纯化、鉴定纤维素分解菌的研究进展，为菌种的研　究、保存和利用纤维素分解菌从事农林牧业生产提供参考。　关键词：纤维素分解菌；酶活；基质；降解　中图分类号：ＴＱ３５２．１　文献标志码：Ａ　ｃｌｏｉ：１０．３９６９／ｊｉｓｓｎ．１６７１—９６４６（Ｘ）．２０１４．０３．０１６　

Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ＬＩ　Ｍｅｉ—ｑｕｎ，ＡＩ　Ｗｅｎ－ｓｈｅｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｍｉｎｇ，Ｍｅｎｇ　Ｙｏｎｇ，ＴＵ　Ｊｉａ，ＬＩＵ　Ｘｉａｎｇ－ｂｏ，ＰＵ　Ｘｉａｎｇ－ｙｕｎ　（Ｈｕ’ｎａｎ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ－Ａｃａｄｅｍｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕ’ｎａｎ　４１Ｏ００４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ—　ｉｓｍｓ　ａｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ，ｕｓｉｎｇ　ｂａｍｂｏｏ　ｍａｔｒｉｘ，ｓｔｒａｗ，ｃｏｍｐｏｓｔ，ｓｏｉｌ　ｍａｔｒｉｘ，ａｎｄ　ＳＯ　ｏｎ，ａｓ　ｔｈｅ　ｏｂｊｅｃｔ，ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ，ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｆｏｒｅｓｔｒｙ，ａｎｉｍａｌ　ｈｕｓ－　ｂａｎｄｒｙ　ｉｎｄｕｓｔｒｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ；ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ；ｍａｔｒｉｘ；ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　

０引言　纤维素是地球上数量最大的可再生资源，占植　物干质量的３５％～５０％Ⅲ。据测算，地球每年光合作　用合成的物质中，纤维素约占６％，达２２０×１０。ｔ［２１。　针对目前存在的农林业固体废弃物大量纤维素成分　复杂，难以被大多数微生物直接作为碳源物质转化　利用；纤维素酶活力较低、生产周期长、纤维素酶　复合物分子量十分庞大、单个酶组分没有水解纤维　素的能力等问题。本文旨在为纤维素分解菌种的分　离、筛选、鉴定、纯化、保存以及充分利用多种微　生物之间的协同效应，提供高效的微生物菌剂来指　导农林牧业的生产。　１　竹基质分解菌的分离纯化与鉴定　中国是世界上竹类资源最为丰富、竹林面积最　大、开发利用竹资源最早的国家之一，素有“竹子　王国”之称。但在竹笋加工中有大量笋壳和剩余物　被丢弃；在竹林经营中每年或隔年都必须砍伐一批　竹子，大量的竹蔸很难腐烂，造成竹林内竹蔸占林　地面积比例大；竹基质生物制浆时木质纤维素较难　分解。　张有珍『３＿利用微生物发酵菌剂可以大大加速笋壳　堆肥腐熟的进程，添加发酵助剂有利于发酵菌剂作　用的进一步发挥，实现笋壳快速腐熟。高海有等人　以竹园采集土样分离出的根际微生物为主要研究对　象，采用１６Ｓ　ｒＤＮＡ分子生物学手段和常规生理生化　分析方法，对笋用竹正常生长植株及病害植株进行　分析研究。马星霞等人『５Ｊ采用扫描电镜技术（ＳＥＭ），　观察研究各种不同真菌败坏竹材的宏观和微观变化。　周德明等人同对所筛选的降解竹材木质素降解菌进行　发酵条件的优化，得到最佳培养条件为培养温度　３５℃，初始ｐＨ值５．５，摇瓶装量４０　ｍＬ，摇床转速　１６０　ｒ／ｍｉｎ，此时该菌株具有较高的酶活力。徐春燕等　人为探索竹生物制浆的适宜条件，研究了５种碳源　对白腐菌降解竹基质中木质纤维素的影响。李超等　人以不同腐朽程度的毛竹伐桩为样品，对其中具有　降解纤维素或木质素的竹腐微生物进行富集、分离、　纯化。朱军莉等人利用透明圈法，从袋装降解的笋　干中分离到１株分解纤维素的细菌菌株。可晓等人　为人工促进雷竹有机覆盖物高效腐解，从雷竹林地　覆盖有机材料和雷竹林土壤中，初选￡｝｛具有较强纤　

收稿日期：２０１３—１１—１２　基金项目：湖南省林业科学院青年创新基金（２０１３２ＱＪ０９）。　作者简介：李美群（１９８５一），女，硕士，助理研究员，研究方向为农产品深加工原理与新技术。　２０１４年第３期　李美群，等：纤维素分解菌分离纯化鉴定的研究进展　・４９・　维素酶活力的菌株７株，其中真菌４株、放线菌　３株，复选出有机覆盖物高效降解菌株１株。李振红　等人固比较研究了刚果红脱色、滤纸崩解等几种纤维　素分解菌筛选方法，并从腐木、腐竹、腐叶等样品　中筛选获得４株高效纤维素降解菌，其中细菌１株、　真菌３株。　２秸秆纤维素分解菌的分离纯化与鉴定　全国范围内都适宜栽种水稻，稻区辽阔，面积　大；小麦、玉米、薯类、油料、棉花、甘蔗和其他　农作物在收获果实后的剩余部分数量也很大，将这　些纤维素高的秸秆利用好，可以提供大量的能源、　肥料、饲料等。　冯健玲等人　以刚果红纤维素琼脂和滤纸条培　养基为初筛培养基，从稻草、秸秆等分离获得的　１２４株真菌中筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤　纸条分解能力较强的１１个菌株。种玉婷等人［１删以稻　秆为碳源，从富含纤维素的土壤中筛选出一组中温　稻秆降解复合系，命名为ＬＺＦ一１２。电子显微镜和光　学显微镜的观察结果表明，复合菌系ＬＺＦ一１２的菌群　构成复杂，微生物形态各异，结合其生长曲线和溶　解氧变化趋势分析，降解木质纤维素ＬＺＦ一１２的优势　菌群为兼性厌氧菌。顾挺［１１从种稻红壤中分离微生物　菌株，经紫外诱变后得到了３株高效的稻秆纤维素　降解菌株，分别为细菌ＹＢ２０、真菌Ｆ９和ＹＦ１５。经　鉴定，菌株ＹＢ２０为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ｓｐ．），菌株Ｆ９－和ＹＦ１５均为绿色木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｎｄｅ　ｓｐ．）。马怀良等人从长期堆放稻草的土壤中分　离出１２株常温纤维素分解菌，采用Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ液体　培养基，对１２株纤维素分解菌进行发酵产酶试验，　结果表明通过纤维素酶活力测定，最终筛选出对纤　维素分解能力较强的霉菌菌株ＮＭ５，其ｃ１酶活力、　羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力分别为０．０１７　０，　０．７１７　４，１．３４３　５　ＩＵ／ｍＬ。田慧等人为了研制１种用　于早稻秸秆还田的生物助腐剂，通过稀释平板法分　离到了１株好气性纤维素分解细菌，ＣＭＣ—Ｎａ酶活　为３．２　ｕ，０．１％的尿素最适合该菌产纤维素酶，１４　ｄ　左右能够基本完成稻草的腐解过程，在１９　ｄ内对　早稻秸秆的腐解失质量率为５６．９７％，比对照提高了　４．４４％。　岳思君等人【　２１以含菌秸秆、腐叶和玉米地土壤为　材料，经富集培养后，根据水解圈直径进行纤维素　分解菌初筛分离培养和复筛培养，制取粗酶液，测　定ＣＭＣ酶活力和滤纸酶活。吕育财等人【ｎ］从小麦秸　秆堆肥中筛选到一组高效的小麦秸秆分解菌复合系　ＷＤＣ２，研究表明ＷＤＣ２在ＰＣＳ培养基中以小麦秸　秆作为唯一碳源，６０℃培养１５　ｄ，对小麦秸秆的分　解率达到６４．４７％，其中纤维素分解４４．７％，半纤维　素分解１３．６１％，木质素减少３．８５％，ｐＨ值由初始的　８－３迅速下降，６０　ｈ下降到６．６，而后逐渐回升接近　初始值。张珊基于获得高效秸秆分解菌的目的，分　别以纤维素、木质素、半纤维素为碳源，配制不同　的选择培养基，设计不同的筛选方案，从自然界中　筛选分离获得具有分解这些物质功能的一组混合菌　株，经分离纯化得到９株菌株，选择酶活力比较高、　生长旺盛的菌株３株，分别对其进行形态学观察、　革兰氏染色、生理生化测定等一系列试验，并提取　所筛选的这３株菌株的基因组ＤＮＡ，对１６Ｓ　ｒＤＮＡ　进行测序，然后与Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已知的菌株序列相比　较，鉴定其菌属，经鉴定分别为小单孢菌属、匍枝　根霉属、短小芽抱杆菌属。　

３堆肥纤维素分解茵的分离纯化与鉴定　堆肥原料广泛，成本低廉，肥效显著，农田、　菜地、林地等都大量需要。但由于堆肥的发酵时间　长，原料利用率低，因此研究堆肥快速分解、提高　降解率具有实用价值。　３．１高温堆肥纤维素分解菌的分离、纯化、鉴定　牛俊玲等人【　谴以高温期的堆肥样品为材料，经　过多代淘汰及不同系之间的组配，最终筛选构建了　

一组木质纤维素分解菌复合系，在分别以滤纸、脱　脂棉、稻秸和锯末为碳源时，该复合系对天然纤维　素含量高的滤纸和脱脂棉分解活性强，对纤维素含　量较低、木质素含量相对高的锯末分解率最低。宫　玉胜等人［　从高温阶段堆肥样品、腐熟肥料、牛粪和　土壤等含有纤维素降解菌的样品中筛选出１４５株能　较好降解纤维素的菌株，对它们进行了单独与混合　发酵培养，经过初筛、复筛，选出降解纤维素能力　较强的８株菌株，包括细菌３株、霉菌３株、放线　菌２株。　３．２中温堆肥纤维素分解菌的分离、纯化、鉴定　晋昕等人［　叼从堆肥、马粪、枯树叶、柏树根土、　蘑菇渣等样品中，分离得到１４株能分解纤维素的菌　株，对此进行了透明圈直径、酶相对活性、滤纸酶　活力（ＦＰＡ）、羧甲基纤维素酶活力（ＣＭＣ）和对蔬　菜杆的分解效果测定比较，筛选出２株对蔬菜有较　强分解能力的菌株。邱成书等人［－　】从温泉、堆肥等环　境采集样品，以滤纸条为唯一碳源，用微晶纤维素　粉和羧甲基纤维素钠（ｃＭＣ—Ｎａ）一刚果红培养基进　行分离和筛选出几株高温纤维素分解菌。席北斗等　人【　８１从堆肥、马粪、果园土、污泥等２Ｏ个样品中，　分离筛选出３株对滤纸分解旺盛的纤维素分解菌即　ｃ１，ｃ２，ｃ３，并外购康氏木霉、白腐菌、变色栓菌　一起作为出发株，经紫外诱变处理后，在含葡萄糖　的产酶培养基平板上筛选到能形成较大透明圈的突　变株，并进行ＣＭＣ酶活、微晶纤维素酶活及天然粗