纤维素分解菌的分离和鉴定

纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。

3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。

4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。

二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。

应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。

由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。

将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。

用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。

三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。

：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。

无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。

把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。

浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。

NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。

纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验一、实验背景纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。

如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。

由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。

从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。

迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。

主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。

以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。

与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。

纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。

随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。

利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。

因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。

二、实验目的从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。

三、实验材料：1、样品的采集1）风干土样E4-1、E2-6、E2-6试样。

2）潮湿土样E4-1、E2-6、E2-6试样。

3）牛粪样品2份以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；2、培养基1）CMC培养基2）LB培养基3）高氏1号培养基4）PDA培养基3、其他物品天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液管。

纤维素分解菌的筛选方法
纤维素是一种重要的营养物质，是细菌中含量最丰富的有机物质，具有重要的生物学
功能，常被用于制备肥料和饲料等。

研究纤维素分解菌种类及其分解的反应特性，是研究
纤维素降解机理的重要基础。

纤维素分解菌的筛选方法主要有几种，包括淀粉膜电泳筛选，扩增隔离法，等电点筛选，微量培养筛选，补液筛选，微量测定等。

1. 淀粉膜电泳筛选：采用放大型电泳仪，用淀粉溶液构成膜，将单细胞菌悬浮液流
过该膜，其中纤维素分解菌可形成淀粉膜电泳状态，能在该膜中形成一定的结构，从而被
检测到。

2. 扩增隔离法：将一定浓度的纤维素溶液，与培养基或植物提取物按比例混合，在
适宜的条件下，加入适量的细菌，构成纤维素溶液底物，配制培养基，进行培养，根据培
养结果来筛选出对纤维素感兴趣的菌株。

3. 等电点筛选：利用膜膜过滤，在纤维素分解反应的同时，膜膜滤过的细菌会因等
电点变化而被选择。

4. 微量培养筛选：在不同营养条件和温度条件下，采用微量的纤维素细胞悬液，进
行培养，根据形态生长变化、颜色变化等特征，来判断哪些细菌对纤维素有分解能力。

5. 补液筛选：在细胞处理步骤中，常常采用补液筛选方法，利用纤维素溶液作为营
养基底，进行补液筛选，通过补液来影响纤维素分解速度，筛选具有良好分解能力的菌株。

6. 微量测定：取液量较小的细菌悬液，进行分离、培养，在相应的条件下，采用固
体纤维素的含量来微量测定纤维素分解菌的数量，从而筛选出纤维素分解菌菌株。

通过以上各种方法，可以有效筛选出纤维素分解菌的种类，从而更好的研究纤维素降
解的机理和分解效率。

分离纤维素分解菌实验操作步骤实验的具体操作步骤如下1.土样的采集土壤中的微生物，大约70%～90%是细菌。

细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3～8cm的土壤层。

因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。

另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。

2.选择培养3.富集培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。

选择培养基的制备比例见下：纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉 5gNaNO31gNa2HPO4•7H2OKH2PO4MgSO4•7H2OKCl酵母膏水解酪素将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml按上表比例配制50ml选择培养基。

在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放5～6颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

称取土样20g，在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。

将瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养3～4d，至培养基变浑浊。

4．梯度稀释所需仪器：试管（7支）、移液器、枪头。

需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头（黄色、蓝色）。

用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。

然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。

5.刚果红染色法分离与观察（涂布平板）所需仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头、温箱等。

需要灭菌的仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头。

纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。

特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。

对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。

纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。

纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。

多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。

纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。

实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。

可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。

（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。

先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。

（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。

稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。

（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。

此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。

菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。

常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。

（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。

纤维素降解微生物的分离与鉴定方法解析纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，它是一种由大量葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖。

纤维素的降解对于生物能源开发、废弃物处理和环境保护具有重要意义。

而纤维素降解微生物则扮演着关键的角色。

因此，分离和鉴定纤维素降解微生物的方法显得尤为重要。

本文将介绍几种常用的纤维素降解微生物的分离与鉴定方法。

一、平板法平板法是最为常用的纤维素降解微生物分离方法之一。

具体操作如下：1. 准备培养基：将适合纤维素降解微生物生长的培养基高温固化。

常用的培养基包括CMC培养基和Avicel培养基。

2. 稀释样品：将待分离的纤维素降解微生物样品进行适当稀释，通常采用百倍至千倍的稀释倍数。

3. 倒平板：将稀释后的样品均匀倒在高温固化的培养基上，并利用均衡板将其平均分布。

4. 培养：将平板培养在适当的温度下，一般为30-37℃，孵育时间根据需要而定。

5. 分离：观察培养基上的菌落情况，挑取个别菌落进行分离纯化。

二、液体培养法液体培养法是另一种常用的纤维素降解微生物分离方法。

主要包括以下步骤：1. 准备液体培养基：选取适合纤维素降解微生物生长的液体培养基，如液体CMC培养基、液体Avicel培养基等。

2. 接种：将待分离的纤维素降解微生物样品接种到含有相关培养基的试管中。

3. 培养：将试管放置于摇床或恒温培养箱中，在适当的温度和转速条件下培养一定时间。

4. 分离: 通过稀释方法，将培养液中的微生物进行分离纯化，得到单菌株。

三、生理生化特性分析对于分离的纤维素降解微生物，进一步进行鉴定需要进行生理生化特性分析。

常见的特性分析包括以下内容：1. 糖类利用能力：在各种糖类培养基上观察微生物的菌落形态和生长情况。

2. pH和温度适应性：分析微生物在不同pH和温度条件下的生长状况。

3. 酶活性检测：测定微生物产酶的能力，如纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等。

4. 生理代谢产物分析：通过气相色谱-质谱联用技术或其他适当的方法，分析微生物在纤维素降解过程中产生的代谢产物。

环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。

纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。

在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。

纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。

但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。

而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。

灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。

如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。

②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。

我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。

但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。

ｃｎｔ ｃｅ ａｅ ｎｇｎｔ ｉａｃ ｎｌｓ ．Ｉ ｕｔＴ ｒｅｓ ａ ｅ ｌ ｉｅｔ ｅ ｅＰｅ ， ｎ ｂｓｄ ｏ ｅｓｖｒｌ ｈｎｔ ｉ ｃａａｔｒ， ｏｓｕ ｔ ｂｓｄｏ ｅｅｉ ｄｓ ｎｅａａ ｉ １ ｒ ｄ ｃ ｔ ｙ ｓ ｓｉｌｈｅ ｔ ｉ ｗ ｒ ａ ｄｎｉ ｄｔ ｂ ｓ Ⅲ ａｅ ｎｔ ｅａ ｐ ｅｏｙ ｃ ｈｒｃ ｓ ｒｎ ｓ ｅ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｄ ｈ ｅ ｐ ｅ
ｐ ｔ ａ， ｕＭ ＷＨ１ ＷＨ１ 和 ２还需进 一步鉴定 。
关键词 纤维 素降解细 菌； 离； 分 鉴定 中图 分类 号 Ｓ ８ 文献标识 码 Ａ １ ２
文章编 号 ０ １ — ６ １ ｏ９ ０ — ３５ — ４ ５７ ６ １（ ０ ）９ ０９６ ０ ２
Ｉ ｌｔ ｎａ ｔＩｅｔ ｍａｏ ｆ ｆｅｅｔＣ ｎ ｌｓ－ ｓ ａｉ ｎｉ ｄｎｉ ｔ ｎｏ ｔ ｉ ｅｕｏｅ￣ ｏ ｏ ｆ ｉ Ｅ＇ ｎ ￣ ｌ ｅｅｉ ｌｔ ａ ａ ｒ Ｕ Ａ ｈ ｔａ （ ｒ ｅＣｌ ｇ ｆ ｈｎ ｏｇＵ ｉ ｒ ｔ ａ Ｗｅ ａ， ｉａ，ｈｎｏ ｇ ６２９ ｓｉ ｌ Ｍａｉ ｏｌ ｅｏ ａｄｎ ｎｖ ｓｙ ｔ ｉ ｉＷｅ ｉＳａｄｎ ４０ ） ｅ ｎ ｅ Ｓ ｅ ｉ ｈ ｈ ２
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微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离纤维素是一种广泛存在于自然界中的有机化合物，它是植物细胞壁的主要组成部分。

纤维素具有高度的生物降解性，然而，其高度结晶性和复杂的结构使其难以被常规的酶解系统降解。

在生物领域中，微生物分解是一种有效且环保的方法，因此，筛选和分离纤维素降解菌对于提高纤维素降解效率具有重要意义。

一、筛选纤维素降解菌的方法1.1 培养基的选择筛选纤维素降解菌的第一步是选择合适的培养基。

常用的纤维素降解培养基包括CMC（羧甲基纤维素钠）、Avicel（微晶纤维素）、Whatman No.1滤纸等。

这些培养基能够提供纤维素降解菌所需的碳源和营养物质，有利于菌群的生长和繁殖。

1.2 筛选方法传统的筛选方法是利用纤维素作为唯一的碳源，在培养基中培养环境中的微生物，通过测定产酶能力来判断纤维素降解菌的存在。

常用的方法有：（1）红色亚甲基纤维素（RAC）将纤维素培养基添加亚甲基蓝等指示剂，在纤维素降解区域由蓝色转变为红色，表明纤维素被降解。

（2）半定量筛选利用葡萄糖法测定纤维素降解能力。

在培养基中添加不同浓度的纤维素，观察菌落的生长情况和菌液中的葡萄糖含量，评估纤维素降解能力。

（3）放射标记纤维素将放射性同位素标记在纤维素分子上，通过测定纤维素的解脱率来评估菌株的降解能力。

二、纤维素降解菌的分离与鉴定2.1 分离方法从自然环境中分离纤维素降解菌是筛选过程的关键步骤之一。

常用的分离方法包括：（1）稀释平板法将适当稀释的样品在纤维素培养基上均匀涂布，经过一段时间后，将生长的菌落分离并培养纯种。

（2）可溶性物质包埋法将样品与纤维素培养基搅拌均匀，接种到含有纤维素的胶状物上，培养一段时间后，可分离出纤维素降解菌。

2.2 鉴定方法为了确定分离的菌株是否为具有纤维素降解能力的菌株，需要进行鉴定。

常用的鉴定方法包括：（1）形态学鉴定观察菌落的形态、颜色和菌落边缘等特征，使用显微镜观察细胞的形状和结构。

（2）生理生化特性鉴定测定菌株的氧耗、氧释等生理特征，通过测定菌株对不同碳源和氮源的利用情况来判断其代谢特性。

从土壤中分离纤维素分解菌-北师大版选修1 生物技术实践教案实验目的1.学习土壤中微生物分离纯化方法；2.学习纤维素分解菌的分类和鉴定方法；3.分离纤维素分解菌，探究纤维素分解相关技术。

实验原理纤维素分解菌纤维素是一个高分子多糖，由葡萄糖单元组成，交联成了一种高度结晶性的纤维。

纤维素是植物细胞壁中主要的成分，广泛存在于森林、草原、农田等土壤中。

生活在土壤中的细菌可以将纤维素降解为可溶性的糖和有机酸类物质。

这些细菌被称为“纤维素分解菌”，它们可以通过代谢纤维素降解材料为生存所需的营养，具有很高的应用价值。

纤维素分解菌分离分离纤维素分解菌可以使用常规的培养技术和纯化方法。

首先，需要将土壤样品带回实验室，处理样品以去除杂质和有机物质等。

然后，根据分离目的选择不同的培养基和培养条件。

由于细菌在不同培养条件下表现出不同的生长特性，因此需要针对纤维素分解菌的特性进行优化。

在培养基上筛选到细菌后，需要进行纯化处理。

这步采用连续接种或墙纸法等方法，使分离物越来越单纯，直至得到单一的细菌菌株。

纤维素分解菌的分类和鉴定分离纤维素分解菌后，需要对其进行鉴定。

首先，通过菌落形态、生长特性、染色性质和生理生化特性等初始特征，初步鉴定目标菌种。

然后，可使用生物化学鉴定方法或分子生物学鉴定方法对细菌进行深入鉴定。

其中常用的方法有生理生化鉴定、酶谱分析、荧光抗生素等，也可以通过16S rRNA序列进行分析鉴定。

实验步骤实验材料1.抽取自然土壤样品，放置于清洁聚丙烯袋中；2.纤维素分解菌选育培养基；3.大肠杆菌ATCC25922；4.PBS缓冲液；5.琼脂和洋葱汁。

实验步骤1.取出土壤样品约1克，加入PBS缓冲液中，磨碎悬浮液并过滤，采用不同温度和时间的处理方法使土壤样品中的纤维素分解菌得到彻底溶解释放。

2.取出所需的培养基，将其在121℃下高压灭菌20min，冷却后将大肠杆菌ATCC25922接种于培养基上，放置于37℃恒温培养箱中过夜，作为对照。

一、材料与方法
（一）实验主要材料：
1、杨凌地区六个不同点土样 2、增菌培养基（GN换用方）：
胰蛋白胨 葡萄糖 甘露醇 柠檬酸钠 磷酸氢二钾 氯化钠 蒸馏水 3、营养肉汤：蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 蒸馏水 4、糖发酵培养基：蛋白胨 氯化钠 牛肉膏
琼脂溴甲酚紫 （在上述基础培养基中，加入所需糖类即可） 5、 赫奇逊培养基：KH2PO4 MgSO4·7H2O NaNO3
结果
产酸
蔗糖
阴性
—
葡萄糖
阴性
—
甘露糖
阴性
—
产气泡 — — —
（3）代谢产物中脂肪酸的检测
4、滤纸崩解试验结果
滤纸崩解前后对比
讨论
本实验根据纤维分解菌对滤纸崩解的作 用，利用土粒法从土壤中分离得到好气性 纤维素分解菌，对其进行了一系列形态及 生理生化特征的检测，初步确定是属于纤 维粘菌属，并用气相色谱仪鉴定其代谢产 物中高级脂肪酸的变化，表明此菌只产生 极量的HFA 、分别为棕闾酸、油酸、亚油 酸。最后通过滤纸崩解试验进一步验证并 粗略比较该菌对纤维素的分解能力。
— ☆☆☆
玉米地
☆☆
柏树林
—
烟草地
☆
（二）菌的微生物学特性
1.菌落描述
菌落
形状
边缘
色泽
湿润
凹凸
色素
a
圆
理化性质
（1）革兰氏染色镜鉴
菌
革兰染色
a
G+
c
G+
湿润 —
低凸面 扩展
黄色不扩散色素 —
形态 单个椭圆形，偶有成链状
棒状，成链状，不分枝
（2）糖类发酵试验（只对C菌）
糖发酵液

纤维素分解微生物的分离和筛选方法纤维素是植物细胞壁的主要成分之一，具有广泛的应用前景。

然而，纤维素的分解一直是科学家们面临的难题之一。

为了解决这一难题，研究人员们积极寻找能够高效分解纤维素的微生物，以进一步开发出高效纤维素降解酶，促进生物能源和生物材料的开发利用。

本文将介绍纤维素分解微生物的分离和筛选方法。

一、样品来源和处理为了获得纤维素分解微生物，首先需要合理选择样品来源。

常见的样品来源包括土壤、沉积物、动物肠道、植物中等。

样品应进行一系列处理，如样品的收集与保存、溶液的筛选和分离、菌液的扩培等。

样品的收集和保存要注意避免样品受到污染和降解。

溶液的筛选和分离可以通过稀释液、过滤和分离培养等方法进行。

二、培养基的选择正确选择适宜的培养基对于纤维素分解微生物的分离和筛选至关重要。

纤维素分解微生物主要是厌氧和好氧微生物，因此可以根据纤维素的性质选择合适的培养基。

常用的培养基有液态和固态培养基，可以根据具体实验需求选择合适的培养基成分，如添加纤维素、蛋白质、矿物质等。

三、分离和筛选方法1. 纤维素分解菌的分离方法（1）稀释涂布法：将样品溶液稀释至适宜浓度，利用稀释液进行涂布培养，然后观察并选取纤维素分解环带较纯的菌落进行分离。

（2）筛选法：将样品溶液通过滤膜进行过滤，得到含有微生物的滤饼，然后将滤饼均匀涂布在含纤维素的固体培养基上进行培养。

（3）玻璃珠破碎法：将样品溶液与玻璃珠混合后进行振荡或超声破碎，使微生物从样品中释放出来，然后以相同的方式将混合液稀释后通过涂布的方式进行培养。

2. 微生物纤维素分解能力的筛选方法（1）纤维素降解活性测定：通过检测微生物降解纤维素后所产生的还原糖、酸、乙醇等物质的产量来评估微生物的纤维素降解能力。

（2）纤维素酶活性测定：利用酶学方法检测微生物分泌的纤维素酶的活性，包括纤维素酶活力、纤维素酶种类及其酶解产物等。

四、分离菌株的鉴定和特性分析通过形态学、生理生化特性以及分子生物学方法，对纤维素分解微生物进行进一步的鉴定和特性分析。

高二生物下册实验：分解纤维素的微生物的别离高二生物下册实验：分解纤维素的微生物的别离(1)实验原理：①土壤中存在着大量纤维素分解酶 ,包括真菌、细菌和放线菌等 ,它们可以产生纤维素酶。

纤维素酶是一种复合酶 ,可以把纤维素分解为纤维二糖 ,进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用 ,故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中 ,纤维素分解菌能够很好地生长 ,其他微生物那么不能生长。

②在培养基中参加刚果红 ,可与培养基中的纤维素形成红色复合物 ,当纤维素被分解后 ,红色复合物不能形成 ,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈 ,从而可筛选纤维素分解菌。

(2)实验过程：土壤取样：采集土样时 ,应选择富含纤维素的环境梯度稀释：用选择培养基培养 ,以增加纤维素分解菌的浓度涂布平板：将样品涂布于含刚果红的鉴别纤维素分解菌的固体培养基上挑选产生中心透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈,考试技巧 ,从产生明显的透明圈的菌落上挑取局部细菌 ,并接种到纤维素分解菌的选择培养基上 ,在30～37℃条件下培养 ,可获得较纯的菌种。

刚果红染色的两种方法的比拟：先培养微生物 ,在参加刚果红在到平板时参加刚果红优点显示出的眼神反映根本上是纤维素分解菌的作用操作简便 ,不存在菌落混杂问题缺点操作繁琐 ,参加刚果红溶液会使菌落之间发生混杂(1)由于琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质 ,可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反响(2)有些微生物具有降解色素的能力 ,长时间培养会降解刚果红 ,从而形成明显的透明圈 ,这些微生物与纤维素分解菌不易区分知识拓展：1.纤维素与纤维素酶(1)纤维素①化学本质：一种多糖。

②分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物 ,此外 ,木材、作物秸秆等也富含纤维素。

(2)纤维素酶①习惯上 ,将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和葡糖苷酶。

C1酶是对纤维素最初起作用的酶 ,破坏纤维素链的结晶结构。

Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解-1 ,4-糖苷键的纤维素酶。

分解纤维素的微生物的分离知识点分解纤维素的微生物是指能够分解植物纤维素的微生物，包括细菌、真菌和原生动物等。

纤维素分解微生物的分离是研究纤维素降解的关键步骤之一，需要一系列技术手段和实验方法。

以下是关于纤维素分解微生物的分离的一些知识点:1.分离介质的准备：为了分离纤维素分解微生物，需要准备一定的分离介质，常用的包括CMC（羟乙基纤维素钠）、氧化纤维素、纤维素硝酸酯等。

这些介质能够提供纤维素作为微生物的唯一碳源，并通过对媒介上的纤维素降解能力的检测来筛选分解能力强的微生物。

2.样品的收集与预处理：从自然环境中收集样品，如土壤、水体、动物肠道等，作为分离纤维素分解微生物的样品。

对于不同的样品，需要进行不同的预处理步骤，如土壤样品可能需要先进行筛分、稀释等，以获取适合的微生物样品。

3.纤维素分解菌的分离方法：常用的方法有网状过滤法、稀释平板法、涂布法和固体培养法等。

其中网状过滤法是将含有微生物的溶液经过一系列的精细滤网，用含纤维素降解酶活性的培养基滴洒在滤膜上，等待菌落的出现。

稀释平板法是将经过适当稀释后的微生物样品均匀涂布在含有纤维素的固体培养基上，将纤维素分解菌形成的菌落分离开，纯化得到纯种纤维素分解菌株。

涂布法则是将含有微生物的溶液均匀涂布于含有纤维素的涂料上，使纤维素降解菌后来形成的菌落附着在涂料上，然后将涂料悬浮于培养基中，得到分离的纤维素降解菌株。

4.分离纯化：通过以上方法获得菌落后，需要经过反复的分离纯化步骤，包括连续经过固体培养基的孢子形成、接种至液体培养基、分几次进行稀释平板和观察等步骤，以得到单个纯菌株。

5.鉴定和筛选：通过形态学、生理学和生化学方法对分离得到的纤维素分解微生物进行鉴定和分类。

同时，通过测定其纤维素降解酶活性和产生的代谢产物，评估其纤维素分解能力和代谢途径。

此外，还可以使用分子生物学方法，如16SrRNA测序和PCR等，对分离得到的微生物进行进一步的鉴定和分类。

6.构建工程菌株：通过基因工程技术，可以将纤维素降解酶基因导入到高效率发酵菌中，构建高纤维素降解能力的工程菌株，用于工业生产等。

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。

二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。

这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。

在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要： 1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC 酶、EG。

这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； 3. Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。

随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。

就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。

以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。

土壤中纤维素分解菌的分离鉴定纤维素是植物细胞壁中最主要的组成成分之一，其分解可以释放丰富的能量和营养物质，因此纤维素分解菌对土壤生态系统具有重要作用。

因此，对于土壤中纤维素分解菌的分离鉴定，有助于深入了解其功能和生态学意义。

一、实验材料和方法1.实验样品本实验采集自我国典型红壤中的一些样品，土壤样本为表层土壤（0-15cm）。

2.分离方法对样品进行拔草、松散、天然干燥、筛分等处理，然后进行分离。

1）直接培养法：将半固态纤维素酵母提取培养基（CMC-Na：1.5g/L；NHa2PO4：0.5g/L；KH2PO4：0.5g/L；MgSO4：0.5g/L；FeSO4：0.01g/L；NaCl：0.5g/L；以及0.5％的琼脂）均匀涂布于含有纤维素的平板上。

在37℃恒温箱中孵育培养。

2）稀释培养法：起初将样品按比例加入到同等体积的0.85%氯化钠溶液中。

接着对稀释液进行梯度稀释，将每1ml的第-1-7次稀释到含有纤维素的琼脂平板上。

在37℃恒温箱中孵育培养集落。

3）筛选方法在进行分离后，筛选出7个形态和功能不同的菌落，进行细菌纯化。

然后，利用革兰染色法、生理生化实验和16S rRNA序列分析等方法进行鉴定。

二、结果及讨论1.分离菌株的特征我们通过实验分离出来7个不同的纤维素分解菌株，它们分别是：AT1、AT2、AT3、AT4、AT5、AT6和AT7。

在进行鉴定时，我们根据它们的形态特征、生理生化性质及16S rRNA基因序列，对其进行了系统的分类和鉴定。

菌株AT1，为革兰阴性杆菌，能够在CMC-Na离子互济培养基中发生较强的纤维素降解。

我们对其进行16S rRNA测序，发现与Salmonella sp. ATCC 43971的16S rRNA序列高度同源（99.7%）。

因此，我们认为其为一株Salmonella sp.的分解菌株。

2.纤维素分解菌株的多样性我们通过对红壤样品中纤维素分解菌株的分离和鉴定，发现其中的菌株分属于不同的细菌属，如Salmonella、Microbacterium、Pseudomonas、Bacillus、Acinetobacter、Streptomyces、Rhodococcus等，这表明纤维素分解菌株在细菌属的多样性方面具有很高的潜力。

第7课时 分解纤维素的微生物的分离学习目标 1.掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。

2.理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。

3.掌握纤维素酶的测定方法。

一、纤维素分解菌的筛选1．纤维素与纤维素酶 (1)纤维素①基本组成单位：-----------。

②分布：主要分布在植物--------------等器官中。

特别提醒 纤维素的分布、主要性质和作用分布 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素主要性质 常温下比较稳定，不溶于水及一般有机溶剂；纤维素不具有还原性，但在一定条件下能进行水解反应，产生葡萄糖，故其水解产物具有还原性 作用植物细胞细胞壁的主要成分；一种重要的膳食纤维，具有刺激胃肠蠕动、促进消化液分泌的功能；此外纤维素可用于造纸、纺织、制造炸药等(2)纤维素酶①组成：是一种复合酶，至少包括三种组分，即C 1酶、C X 酶、葡萄糖苷酶。

②作用：纤维素―――――――→C 1酶和C X 酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖特别提醒 除自然环境中存在的分解纤维素的微生物外，在草食性动物牛、马、羊等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其可产生纤维素酶分解纤维素，而人体没有分解纤维素的能力。

2．纤维素分解菌的筛选 (1)方法：--------------。

①方法一：先培养------------，再加入-------------进行颜色反应。

②方法二：在------------时就加入刚果红。

特别提醒 方法一需要用NaCl 溶液洗去培养基表面浮色后，再进行观察，方法二不需要。

(2)原理纤维素＋刚果红→红色复合物↓纤维素酶纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物 ↓以--------------心的透明圈1．如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？提示 设计对照实验。

取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。