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慢病毒在病毒学研究中的应用随着科技的不断发展和进步，病毒学研究也在不断地深入和扩展。
慢病毒的发现和应用，为病毒学研究提供了新的思路和方法。
本文将探讨慢病毒在病毒学研究中的应用。
一、慢病毒是什么慢病毒是一种病毒，属于逆转录病毒的一类。
其基因组为RNA，但可以通过逆转录酶转录成为DNA。
慢病毒具有很强的侵染性，可以感染多种细胞，包括神经细胞和免疫细胞等。
慢病毒具有长周期的生命周期，可以在细胞中长期存在，慢慢地对细胞进行破坏。
慢病毒感染可以导致一些慢性疾病的发生和发展，如艾滋病等。
二、慢病毒在病毒学研究中的应用1. 基因治疗慢病毒可以用于基因治疗。
慢病毒感染后可以将基因序列导入细胞，并在细胞内进行表达和复制。
这为基因治疗提供了理论基础和实验依据。
因为慢病毒可以继续存在于细胞内，从而使导入的基因序列长期保持在细胞内，具有稳定和持久的表达效果。
而且慢病毒也可以甄别目标细胞，靶向进行基因传递。
这可以大大提高基因治疗的效果和成功率。
2. 疫苗开发慢病毒可以用于疫苗的开发。
疫苗的免疫机制是在免疫细胞中产生对病原体的免疫反应，并产生免疫记忆。
慢病毒可以被作为病毒载体，将目标病原体的基因序列导入免疫细胞中，使其产生对病原体的反应。
这样，就可以通过慢病毒制备出特异性疫苗，来预防和治疗一些病原体感染导致的疾病，如乙型肝炎等。
3. 疾病模型研究慢病毒可以用于疾病模型的建立和研究。
慢病毒的侵入和感染能力很强，可以模拟一些疾病在细胞和组织层面的发展和变化。
例如，慢病毒可以在神经细胞中表达外源基因，模拟一些神经退行性疾病的发生和发展过程。
这有助于揭示疾病的发生机制和治疗方法。
三、慢病毒在病毒学研究中的挑战和应对1. 安全性问题慢病毒具有侵染性和导入基因序列的能力，因此需要对其进行严格的安全性检测和监测。
在疫苗和基因治疗等方面的应用中，需要确保慢病毒对人体无害，不会导致不良反应和病原体的突变产生。
2. 菌株选择问题在慢病毒的应用过程中，需要选择最适合应用的菌株，以确保其对细胞和组织的侵染和基因导入效果最佳。
慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。
主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。
可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。
慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。
慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。
在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。
2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。
通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。
3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。
4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。
通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。
总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。
这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。
慢病毒载体的设计
1. 两质粒系统
以HIV-1为骨架，将其中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞（如293T细胞）进行包装。
两质粒系统为复制缺陷型载体，仅能获得较低的滴度，且仅能感染CD4+的靶细胞，并存在产生HIV的感染风险。
2. 三质粒系统
将HIV-1基因组中负责包装，逆转录和整合所需要的顺式作用序列结构和编码反式作用蛋白的序列分离，再克隆到三个独立的质粒中，并去除了所有的辅助序列。
极大地增加了病毒的安全性，是目前比较常用的慢病毒包装系统。
3. 四质粒系统
四系统也是目前较为常用的病毒系统。
与三质粒系统相比，第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上，新增一个质粒更增加了系统的安全性。
第二个变化是将tat基因去除，并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR，以启动载体质粒的表达。
这样就形成了四个质粒的系统，即pGag/Pol、pRev、pVSV-G。
此外，还有一个可以放置目的基因序列的载体。
四质粒HIV-1病毒包装系统。
慢病毒载体的研究进展及应用张蕊;龚道清【摘要】慢病毒载体是近年来受到广泛关注的一种逆转录病毒载体,具有更安全、转移效率高、可将目的基因整合入宿主基因组和可感染非分裂期细胞等优点,因此有望成为理想的基因转移载体,并在临床和生产实践中广泛应用.作者主要以HIV-1为代表对慢病毒载体的构建及其在基因治疗和转基因动物生产中的应用作一综述.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)006【总页数】5页(P227-231)【关键词】慢病毒;慢病毒载体;基因治疗;转基因动物【作者】张蕊;龚道清【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒科(Retroviridae),为RNA病毒,由于这类病毒的一个重要特点是病毒粒子中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶,故现名为逆转录病毒。
慢病毒已经从绵羊(绵羊脱髓鞘性脑白质炎/慢性进行性肺炎病毒)、山羊(羊关节炎脑炎病毒)、牛(牛免疫缺损病毒)、马(马传染性贫血病病毒)、猫(猫免疫缺损病毒)、猴(猴免疫缺陷病毒)和人(人免疫缺陷病毒)中分离得到(Robl等,2007)。
慢病毒在宿主细胞内,能以病毒RNA为模板在自身反转录酶的作用下合成cDNA,再以此cDNA为模板合成双链DNA,经环化后通过病毒整合酶作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达(李跃萍等,2006)。
慢病毒以其基因组为基础去除部分基因代之以所需的目的基因和标记物,构建而成的慢病毒载体(Lentiviral vector)具有转移效率高、可整合入宿主细胞基因组、包装后更安全并可转染非分裂期细胞等优点,在基因治疗和转基因动物生产中得以广泛的使用。
1 慢病毒载体1.1 慢病毒的基本结构慢病毒载体种类很多,其中对HIV-1的结构和生物学特征的研究较多,而HIV-1型已成为目前较为常用的慢病毒载体系统。
用于肿瘤基因治疗的慢病毒载体研究进展【关键词】慢病毒载体;基因治疗;人类免疫缺陷病毒Ⅰ型;综述基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其他难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一愿望的最大障碍。
慢病毒(LV)属于逆转录病毒属的一个亚科，其中包括灵长类LV如人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIVⅠ)、HIVⅡ、猴免疫缺陷病毒(SIV)和非灵长类LV如Visna病毒、马传染性贫血病毒(EIA V)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)等7个亚属。
其中对HIVⅠ的结构及生物学特性研究较多。
HIVⅠ具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、感染率高、免疫反应小等优点，弥补了逆转录病毒载体和腺病毒载体等病毒载体的缺陷，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。
对该类载体的研究进展做一综述。
1 LV的基因结构[1～3]人类免疫缺陷病毒直径110～120 nm，呈20面体对称结构，大致呈球形。
病毒外膜是磷脂双分子层，来自宿主细胞，膜上有表面蛋白(gp120)与镶嵌蛋白(gp41);gp41是跨膜蛋白，gp120为刺突，并与gp41通过非共价作用结合。
包膜内面是蛋白P17形成的球形基质蛋白(Matrix)，以及衣壳蛋白(p24)形成的半锥形衣壳(Capsid)，衣壳在电镜下呈高电子密度。
衣壳内含有病毒的RNA基因组和其他来自宿主细胞的成分(如tRNAlys3，作为逆转录的引物)。
病毒基因组是两条相同正股RNA 链，全长约9 200 bp。
两端是长末端重复序列(LTR)，含顺式调控元件,序列为5′U3R U5 3′，控制前病毒的表达。
现已证明，在LTR有启动子和增强子并含负调控区。
LTR之间的序列至少编码9个蛋白，可分为3类：结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。
结构蛋白Gag、Pol、Env 基因编码。
gag基因产生相对分子质量55 000的蛋白P55。
癌症免疫疗法中的慢病毒载体摘要癌症免疫疗法领域中的基础科学进步在临床上产生了多个取得成功的疗法。
这些疗法中的很多需要将基因插入细胞中以直接杀死它们或是重新指导宿主细胞以诱导有效的免疫反应。
其他类似的疗法工作还有通过改造效应细胞以提高靶向性以及加强对肿瘤细胞的杀伤。
最初使用γ-反转录病毒进行的研究结果前景可观，但是集中于可能发生插入突变的安全性问题凸显了对于发展其他备选的基因载体的需求。
已经确认了慢病毒载体（LVs）可能时更有效和更安全的备选运输载体。
LV现在被用于包括癌症在内的多种不同类型的内生和获得性疾病的临床试验中。
本综述会讨论关于LV的只是和以这种病毒载体为基础的运输载体在癌症免疫治疗中的应用。
癌症免疫疗法指的是为了根除肿瘤细胞而利用免疫系统的疗法。
体内的免疫细胞本来就有识别和攻击恶性细胞的机制；但是，肿瘤细胞经常会采取针对这些机制的反制措施来使其失效。
免疫疗法旨在通过多种不同方法来加强和补充这些自然反应，其中包括抗体和细胞因子疗法、癌症疫苗和过激细胞输注。
这些疗法中的一些需要对病人的细胞进行基因改造，或者直接杀伤肿瘤细胞或者诱导免疫反应或提高其靶向和细胞毒性。
为了能将这些基因疗法应用于临床，一个能安全而有效的导入转基因的可靠方法至关重要；到目前为止已经研究并检测了很多方法。
使用γ-反转录病毒（又名肿瘤病毒）将特异性的T细胞受体输送到淋巴细胞以治疗黑色素瘤是第一个将经过基因改造的免疫细胞用于癌症免疫疗法的临床试验。
在这项公布于2006年的工作之后，很多不同的癌症免疫疗法方案应用了多种基因传输方法。
应用了包括病毒和非病毒的多个系统。
重组γ-反转录病毒仍然是一个流行的选择；但是，慢病毒载体（LV）已经成为另一个潜在的更为安全和有效的选择。
到2014年为止，19.2%的基因疗法试验中使用了γ-反转录病毒。
使用LV 的目前仅占到公开和历史试验的3.5%，但是，这个数字正在增长。
其他常用的病毒基因传输的选择包括重组腺病毒（Ad）以及腺相关病毒（AAV）。
慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展李妍1 杜红延2★ 李红卫2★[摘 要] 慢病毒载体是一类逆转录病毒载体，以其转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞，可容纳较大的基因片段等优点，现已被作为转移目的基因的理想载体。
而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术，在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。
通过慢病毒载体与RNA干扰技术的结合应用，有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。
[关键词] 慢病毒载体；RNA干扰；应用Lentiviral vector and its application and development in the RNA interference technology LI Yan1, DU Hongyan2, LI Hongwei2★(1.The First Affiliated Hospital of Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)[ABSTRACT] Lentiviral vector, a kind of retroviral vectors, has become an ideal vector for target gene transferation because of its high efficiency of transfection, the ability of transfection to the dividing or non-dividing cells and a capacity of large target gene fragments. RNA interference technology is a new kind of technology developing rapidly in recent years which can be used in eliminating a specific gene or suppressing the expression of a specific gene. And now it is widely applied in the treatment of virus infection, cardiovascular diseases, tumor and other diseases. With the combination of the lentiviral vectors and the RNA interference technology, it is expected to provide new methods for the study in the function of specific gene and the treatment of related diseases.[KEY WORDS] Lentiviral vector; RNA interference; Application慢病毒载体作为一类来源于逆转录病毒的载体，以其转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞，可容纳较大的基因片段等优点，在科研领域有着良好的发展前景。
人血管内皮生长因子165基因慢病毒载体的构建及转染人胚胎神经干细胞的开题报告题目：人血管内皮生长因子165基因慢病毒载体的构建及转染人胚胎神经干细胞一、研究背景及意义神经干细胞（NSCs）是一类能够自我更新和分化为多种神经细胞的细胞，具有很强的潜在临床应用价值。
血管内皮生长因子165（VEGF165）是一种与细胞增殖、生存及新生血管形成等生命活动密切相关的蛋白质因子，而在神经系统中也被证实对神经发育及更新具有重要作用。
因此，将VEGF165基因引入NSCs中，可能能够促进神经系统的发育和修复，有助于治疗各类神经系统疾病。
目前，基因转染是实现NSCs基因治疗的主要手段之一。
而慢病毒载体因其具有较稳定的基因转染效率、转染细胞种类广泛等特点，被广泛应用于NSCs基因治疗研究中。
因此，本研究旨在构建VEGF165基因慢病毒载体，将其转染人胚胎神经干细胞，探究其对NSCs增殖和分化的影响，为神经系统疾病的治疗研究提供新思路和方法。
二、研究内容及方法1.构建VEGF165基因慢病毒载体使用PCR扩增VEGF165基因，并将其克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1中，形成pLVX-VEGF165-IRES-ZsGreen1载体。
经测序鉴定，确认其序列正确。
2.转染人胚胎神经干细胞将pLVX-VEGF165-IRES-ZsGreen1载体导入到293T细胞中，制备慢病毒颗粒。
将NSCs接种到细胞培养板中，并将慢病毒颗粒加入培养基中，转染NSCs。
以未转染NSCs以及转染空载体NSCs作为对照组，观察VEGF165基因慢病毒载体对NSCs生长和分化的影响。
3.检测NSCs增殖和分化采用MTT法检测转染NSCs及对照组的增殖情况，采用免疫荧光检测CD44、Nestin、GFAP等标志性蛋白的表达情况，评价VEGF165基因载体对NSCs增殖和分化的影响。
三、预期结果与意义本研究将构建VEGF165基因慢病毒载体，并将其转染人胚胎神经干细胞，在检测NSCs增殖和分化情况的基础上，探讨VEGF165基因慢病毒载体对NSCs的影响。
慢病毒载体及其在血液病研究中的应用进展曾锦芳【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2011(017)008【摘要】Lentiviral vector is a kind of gene vector which has extremely rapidly developed in recent years, with the advantages of strong ability to infect dividing and non-dividing cells, and accommodate large fragments of exogenous genes which can be continuously expressed while the immune response is mild. In recent years, along with the intensive study of lentiviral vector progessing, the application of Lentiviral vector in the study of blood diseases are more extensive. So this review is focus on the process of the lentiviral vector and its application in the researching of blood diseases.%慢病毒载体是近年来发展极其迅速的基因载体,对分裂及非分裂细胞均具有感染力强大、能容纳大片段外源目的基因、基因持续表达、宿主免疫反应小等优点.近年来对慢病毒载体的研究日渐深入,慢病毒载体在血液系统相关疾病的研究中也得到广泛的应用.现对慢病毒载体及其在血液系统疾病研究中的应用予以综述.【总页数】3页(P1146-1148)【作者】曾锦芳【作者单位】福建医科大学附属协和医院血液研究所,福州,350001【正文语种】中文【中图分类】R552;R331【相关文献】1.腺病毒载体在基因治疗中的应用进展 [J], 王俊伟2.腺病毒载体在基因治疗中的应用进展 [J], 王俊伟3.慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展 [J], 梁艳4.腺病毒载体及其在血液病基因治疗中的应用和研究进展 [J], 魏旭东5.骨科基因治疗中腺病毒载体的应用进展 [J], 邹海波;安洪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。
下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。
2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。
3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。
4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。
5.限制性内切酶：用于DNA切割。
6.DNA连接酶：用于DNA连接。
7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。
8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
9.细胞培养基：用于细胞培养。
10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。
11.抗生素：用于防止细胞污染。
12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。
二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。
2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。
3.水浴锅：用于保温反应液。
4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。
5.细胞培养箱：用于细胞培养。
6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。
7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。
8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。
9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。
三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。
2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。
3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。
6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。
慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。
慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。
本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。
首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。
慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。
因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。
其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。
常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。
而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。
另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。
为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。
此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。
总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。
通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。
慢病毒载体包装构建过程原理:慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达目的序列的效果.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。
对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体,能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率,且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
概念:慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒—1 (H IV—1）来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。
携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织,实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系.慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
基本原理:慢病毒载体系统由两部分组成,即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。
包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能.将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞），即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒.载体成分:与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
用于基因治疗的慢病毒载体(一)基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最大障碍。
非病毒学的基因转移方法效率较低；已用于人体试验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。
常用的逆转录病毒载体从小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，目前主要用于基因治疗的离体方案；腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导；其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意。
理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。
近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。
研究表明〔1-5〕，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。
本文即对该类载体的研究进展做一简介。
1HIV-1基因组的基本结构〔6〕HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5＇LTR-gag-pro-pol-env-3＇LTR。
其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。
与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。
万方数据 万方数据７２中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶ０１．２６Ｎｏ．１１２００６
表达时间¨４｜。这些调控元件的发现为构建慢病毒载体，使目的基因在靶细胞中持续高效表达提供了依据。２．３提高转入基因的转录靶向性病毒载体携带的外源基因转入宿主细胞后是否能够表达还与启动外源基因的启动子及宿主细胞的类型均有关系，一般类型的慢病毒载体都选用管家基因的启动子来启动外源基因以保证其有效转录。研究者由此想到了应用靶细胞特异性表达基因的启动子作为载体外源基因的启动序列，从而使转入的外源基因只在特定类型的细胞中表达。有研究报道，利用星形胶质细胞的特异性表达蛋白ＧＦＡＰ的启动子构建的慢病毒载体在注入动物模型的受损脑区后，其携带的外源基因特异性地在星形胶质细胞中表达，并且外源基因的表达水平可以伴随内源性ＧＦＡＰ基因的激活而得到调节¨５｜。这一技术也被应用于生产不同组织特异性表达ＧＦＰ的转基因动物，其方法是利用含不同组织特异表达蛋白启动子的慢病毒载体转染胚胎细胞，如果胚胎发育成功，特定的组织细胞会呈ＧＦＰ阳性。应用组织特异性的启动子和增强子来驱动慢病毒载体中的外源基因能够使其在特定的组织细胞中表达，这一进展为慢病毒载体介导的基因靶向性治疗提供了理论基础。２．４加入可对外源基因进行转录调节的调控元件如何使慢病毒载体携带的外源基因根据机体的需要进行有效调节也是保证基因治疗的有效性和安全性的重要问题。目前应用最多、前景最好的是四环素调节系统，即ｔｅｔ－ｏｎ及ｔｅｔ－ｏｆｆ系统。这一系统是根据大肠埃希氏菌属ＴＮｌ０的四环素抗性操纵子的结构特点构建的，这一抗性操纵子包含一个四环素抑制蛋白（ＴｅｔＲ）、一个特异性的ＤＮＡ结合位点及四环素操纵序列（ＴｅｔＯ）。无四环素存在的条件下，ＴｅｔＲ呈二聚体状态并与ＴｅｔＯ结合。四环素（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）或四环素类似物——强力霉素（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）可以与ＴｅｔＲ结合使其构象发生改变，从而导致ＴｅｔＲ与ＴｅｔＯ分离。后来发现，ＴｅｔＲ存在一种突变体结构，在这种突变体中决定ＴｅｔＲ空间构象的四个核心蛋白发生了突变，形成了一种反式的空间构象，即当ｄｏｘ存在时，ＴｅｔＲ呈二聚体结构结合于ＴｅｔＯ上阻碍了下游基因的转录。利用四环素原核操纵将单纯疱疹病毒的转录激活域（ＶＰｌ６）与ＴｅｔＲ或ＴｅｔＲ的突变体融合分别组成四环素反式激活因子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＴＡ）和ｒｔＴＡ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）１．１６Ｊ。为了在哺乳动物细胞中表达，研究者将ＣＭＶ启动子与ＴｅｔＯ重复序列融和，与ｔＴＡ结合构成了Ｔｅｔ．ｏｆｆ转录调节系统，与ｒｔＴＡ结合构成了ｔｅｔ－ｏｎ转录调节系统。由于ｔｅｔ．０ｆｆ系统需要长期给予强力霉素来维持外源基因的表达，这对于终身的基因治疗不是一个理想的选择。同时，ｔｅｔ．ｏｆｆ系统的诱导启动需要通过药理作用清除强力霉素，这一过程较ｔｅｔ－ｏｎ系统的诱导过程要缓慢。因此，ｔｅｔ．ｏｎ转录调节系统在目前基因治疗领域的应用更为广泛［１７ｌ。
图３四环素操纵子ｔｅｔ－ｏｎ和ｔｅｔ－ｏｆｆ结构模式图Ｆｉｇ．３Ｐｉｃｔｕｒｅｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｏｎａｎｄｏｆｆｓｙｓｔｅｍ
目前应用的Ｔｅｔ－ｏｎ基因调节系统多分别构建于两个质粒中，其中一个含有由外源启动子驱动的ｒｔＴＡ，另一个质粒中含有ＴＲＥ及受其调控的外源基因。二者通过共同转染同一细胞来发挥ＴＲＥ和ｒｔＴＡ问的调控作用，这一过程需要通过两步筛选来完成，即首先筛选出成功转染ＴＲＥ的细胞群，再用含ｒｔＴＡ的质粒来转染ＴＲＥ阳性的细胞群，然后通过第二次的分筛筛选出二者都转染成功的细胞群。这一系统更适合于体外的实验，在在体实验中的可控性较差。有研究者正试图将二者构建于同一载体中。但是，Ｔｅｔ－ｏｎ系统不足之处在于背景效应的存在，所谓背景效应是指在四环素不存在的情况下，ｒｔＴＡ也会与ＴｅｔＯ结合，这种情况会导致受其调控的蛋白表达量的下降，这对于在低剂量水平发挥作用的蛋白表达更为不利，如生长因子类蛋白。针对这一问题，有些实验室正对ｒｔＴＡ作进一步的改进，如经过改建后的反式转录激活因子ｒｔＴＡ２ｓ．Ｍ２６，经过ＴｅｔＲ区的突变和遗传密码的优势选择，以及ＶＰｌ６区的激活域改建为含１２个氨基酸的重复序列，其特异性、稳定性、可调性都得到了很大提高。它可以在四环素浓度较最初的ｒｔＴＡ低１０倍的情况下发挥作用，在四环素不存在的情况下，没有背景效应的产生。并且外源基因的表达水平与四环素的浓度在一定范围内呈剂量依赖关系，即随着外源给予四环素浓度的增加，外源基因的表达量也会相应增加【ｌ８｜。因此，通过对ｒｔＴＡ的改
万方数据２００６，２６（１１）王淑艳等：慢病毒载体的设计及应用进展７３建，对逆转录病毒载体中加入的外源基因表达水平可以进行准确的调节，使载体和外源基因的可控性更强，为慢病毒载体应用于临床打下了基础。最新型的四环素可调控系统与慢病毒载体相结合，使基因的条件性表达和基因敲除都成为可能，为探索基因的功能提供了有利的工具。Ｓｚｕｌｃ等¨９ｊ利用ＫＲＡＢ结构域（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂｏｘ）的结构和功能特点构建了一种新型的ＴＥＴ－ｏｎ／ｏｆｆ调控系统。接近三分之一的参与转录调控的锌指结构中包含ＫＲＡＢ结构域，当ＤＮＡ与锌指结构相互作用时，ＫＲＡＢ结构域环化成为多分子复合体，引发组蛋白的脱乙酰作用和甲基化，从而导致染色体的变构而抑制转录激活。ＫＲＡＢ结构域与ｔｅｔＲ结构相融合构成了转录激活抑制结构，研究者证实利用这种结构与四环素操纵子结构相互作用（图４）在体外细胞培养试验和在体试验中都能得到了更为严格的基因调控表达效果。３讨论与展望现阶段将目的基因导入靶细胞和组织的方法主要包括真核表达质粒的转染，和病毒载体介导的基因转移方法等。其中真核表达质粒的转染对于分裂增殖比较旺盛的体外培养细胞转染效果较好，但表达的目的基因常常随时间的延长而发生丢失。与真核表达质粒相比，病毒载体介导的基因转移可以整合入宿主的基因组中，具有更好的稳定性。最初研究的鼠干细胞病毒和后来的腺病毒载体在转染分裂增殖旺盛期的细胞时都取得了较好的效果，但对于分裂增殖缓慢和处于静息期的细胞基因转染的效果却不尽人意。慢病毒载体出现以后，先后在造血干细胞，胚胎干细胞，以及在体的神经胶质细胞，神经元的基因转移中都取得了成功。随着慢病毒载体的构建更加完善和基因组学蛋白质组学的进展，基因治疗成为一些疾病的最佳选择。而慢病毒载体的一些生物学特性使许多基因治疗的设想具备了可行性。由于慢病毒家族中的ＨＩＶ．１及其他类型的病毒对人类和动物有极大的危害性，因此慢病毒载体的生物安全性成为阻碍其应用的主要问题。第三代的慢病毒载体虽然已经进一步提高了载体系统的安全性，并且在以前的研究中并没有在载体生产过程中产生野生型病毒的报道。但要使慢病毒载体系统应用于临床，还需要从以下几个方面作出进一步的努力。首先在载体设计过程中应进一步缩短载体及包装质粒中的病毒编码序列，这样可以降低病毒基因重组的几率，但是载体中的包装信号和包装质粒中的ｇａｇ序列之间的重复不可能完全避免，因此有必要在生产过程中通过长期培养和ＰＣＲ技术对生产出来的病毒载体进行分析。另外在载体设计时应避免出现潜在的自杀基因，这类基因一旦被激活，会导致靶细胞的死亡。如果慢病毒载体真正应用于临床，那么机体的免疫系统会引发针对注入的病毒颗粒的免疫应答，这些病人就可能在ＨＩＶ抗原检测中呈阳性结果，导致诊断的混淆和病人心理上的压力。因此为进一步提高慢病毒载体的生物安全性，应在临床应用前对其进行多方面的安全检测和分析。通过以上的介绍，慢病毒载体是理想的真核细胞基因转移工具，通过对其结构和功能的进一步的完善，在科学研究中有着广泛的应用前景。慢病毒载体可以转化处于分裂静止期和分化终末状态的细胞，今后应用在一些可以通过基因治疗方式治愈的疾病的实验和临床研究中。比如一些神经系统疾病。在神经系统中，绝大多数的神经元和胶质细胞处于一个相对静止的时期，其它的逆转录病毒载体对于神经系统疾病的基因治疗显得无能为力，而实验证实，慢病毒载体无论是在体外细胞及组织培养实验中，还是在在体的基因治疗实验中，对神经元和胶质细胞都具有稳定的转染能力。因此，慢病毒载体为一些神经系统疾病的基因治疗带来了希望。近期的研究表明，由慢病毒载体系统介导的应用ＧＤＮＦ（胶质源性神经营养因子）对帕金森氏病进行基因治疗已经在灵长类和啮齿类动物实验中得到证实，由慢病毒载体介导的ＧＤＮＦ基因可以整合入移植部位细胞的基因组ＤＮＡ中，长期表达分泌，促进损伤部位的多巴胺能神经元的存活，突触延长，并能改善动物模型的行为学异常。随着慢病毒载体和一些基因调控元件的结合应用，可以对载体携带的外源基因进行基因表达调控的研究。这种组合会克服基因治疗过程中所遇到的一些问题，比如如何调控外源基因在靶细胞和组织中的表达水平，持续表达时间，以及如何将外源基因特异地导入某一类型的靶细胞中等等。目前，以四环素的原核操纵子结构为基础的药物调节系统已经被构建于慢病毒载体系统中，并迸一步提高了基因表达调控的敏感性，准确性和特异性。使这一系统成为基因的转录调控研究和基因治疗研究的重要工具。虽然慢病毒载体的设计进展为进行深入的基因表 万方数据７４中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶ０１．２６Ｎｏ．１ｌ
２｜Ｄ０１６
达研究带来了希望，但我们在实际的研究应用过程中还应该考虑到外源性载体转入对细胞及组织生物学特性的潜在影响。在改进载体结构的同时，还应该在体外细胞水平进行详细深入的探讨。如目前较为热点的干细胞治疗和基因治疗相结合的研究领域，不应该单纯追求外源基因表达后的一些正面的结果，还应该对慢病毒载体转化成功的干细胞进行单克隆培养取得生物学性质均一的细胞克隆，然后进行基因表形分析，在确保转化后干细胞的生物安全性后再迸行移植治疗。另外，慢病毒载体的另一应用热点是将其作为基因转移载体直接作用于病变组织局部，如帕金森氏病，脊髓侧索硬化，神经损伤等，虽然在动物实验中都取得了比较理想的结果，但大多数载体不能对病变细胞进行特异性的转化，因此在发挥治疗作用的同时也可能带来一些副作用，应该在今后的实验中得到重视。
参考文献［１］ＬｏｉｓＣ，ＨｏｎｇＥＪ，ＰｅａｓｅＳ，ｅｔａ１．Ｇｅｒｍｌｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎａｎｄｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｄｅｌｉｖｅｒｅｄｂｙｌｅｎｆｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２。２９５：８６８～８７２［２］ＰｆｅｉｆｅｒＡ，ＩｋａｗａＭ，ＤａｙｎＹ。ｅｔａ１．ＴｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓｂｙｌｅｎｆｉｆｉｒＭｖｅｃｔｏｒｓ：ＬａｃｋｏｆｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｅｅＵｓａｎｄｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｅｍｂｒｙｏｓ．ＰｒｏｃＮａｄＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２００２，９９：２１４０～２１４５，２９８８—２９９３［３］ＬＯｉＺ，ＢｒａｄｙＲＯ．Ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｉｎｔｏｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｓｙｓｔｅｍｉｎｖｉｖｏｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ，２００２，６７：３６３～３７１［４］ＺｕｆｆｅｒｅｙＲ．Ｓｅｌｆ．ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｆｏｒｓａｆｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＪＶｉｒａｌ，１９９８，７２：９８７３—９８８０［５］ＹｕＸ，ＺｈａｎＸ，ＣｈｅｎｇＬ，ｅｔａ１．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｔｗｏｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎｔｅｒｎａｌｐｒｏｍｏｔｅｒｓｔｒａｎｓｆｅｒｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｔｏｈｕｍａｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍ—ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２００３，７：８２７～８３８［６］ＺｕｆｆｅｒｅｙＲ，ＤｕｌｌＴ，ＭａｎｄｅｌＲＪ，ｅｔａ１．Ｓｅｌｆ．ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｆｏｒｓａｆｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ轨ｖｉｖｏｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＪＶｉｒｏｌ，１９９８，７２：９８７３～９８８０［７］ＮａｋａｊｉｍａＴ，ＮａｋａｍａｒｕＫ，ＨａｓｅｇａｗａＭ，ｅｔａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｏｖｅｌｓｉｍｉａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｌｃｉｅｎｅｙｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｃａｒｒｙｉｎｇｄｕａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，２０００，１１：１８６３～１８７４［８］ＣｈａｎｇＬＪ，ＺａｉｓｓＡＫ．Ｓｅｌｆ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｅｒｅ—ｌｏｘＰｒｅｐｏＡｅｒｓｙｓｔｅｍ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＭｅｄ，２００３，７６：３６７～３８２［９］ＹｏｄｅｒＪＡ，ＷａｌｓｈＣＰ，ＢｅｓｔｏｒＴＨ．Ｃｙｔｏｓｉｎｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｅｃｏｌｏｇｙｏｆｉｎｔｒａｇｅｎｏｍｉｃｐａｒａｓｉｔｅｓ．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，１９９７，１３：３３５～３４０［１０］ＰａｎｎｅＨＤ，ＯｓｂｏｒｎｅＣＳ，ＹａｏＳ，ｅｔａ１．Ｒｅｔｍｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｓｄｅｎｏｌｏｍｅｔｈｙｌａｓｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄｍａｒｋｅｄｂｙｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅｈｉｓｔｏｎｅｃｏｄｅ．ＥＭＢＯＪ，２０００，１９：５８８４～５８９４［１１］ＰａｎｎｅＨＤ，ＥｌｌｉｓＪ．Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｄｅｓｉｇｎｏｆｒｅｔｒｏｖｉｍｓｖｅｃｔｏｒｓ．ＲｅｖＭｅｄＶｉｒｏｌ，２００１，ｔ１：２０５～２１７［１２］ＧｉｎｎＳＬ，ＦｌｅｍｉｎｇＪ，ＲｏｗｅＰＢ，ｅｔａ１．ＰｒｏｍｏｔｅｒｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｔｈｅＵ３ｒｅｇｉｏｎｉｎｅａｒｌｙ－－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＨＩＶ－·１·ｒｄｅｒｉｖｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓｃａｎｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｅｌｌ·ｔｙｐｅａｎｄｓｐｅｃｉｅｓ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｎｎｅｒ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ，２００３，１４：１】２７—１１３７［１３］ＭａｙＣ，ＲｉｖｅｌｌａＳ，ＣａｌｌｅｇａｒｉＪ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ
