慢病毒载体

慢病毒包装．慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。

它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。

其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。

目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。

与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。

慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。

在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。

慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。

包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）G 糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。

用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。

第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。

慢病毒载体，稳定表达一、慢病毒逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。

主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。

慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。

最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。

慢病毒结构：2个调节基因：（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。

（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。

4个辅助蛋白（附属）基因：（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；（2）vpr和nef参与疾病的表现。

慢病毒的优势：1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；2.可感染分裂和非分裂细胞；3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；4.可以更换特异性启动子；5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；二、慢病毒载体慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

慢病毒包装过程：慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。

慢病毒载体构建原理
慢病毒（lentivirus）是一类病毒，属于反转录病毒的一种。

慢病毒可以作为基因转移的工具，被广泛应用于基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域。

慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，将外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

慢病毒载体构建的原理主要包括以下几个步骤：
1. 选择适当的慢病毒载体，慢病毒载体通常由慢病毒的基因组和外源基因组成。

在构建慢病毒载体时，需要选择适当的慢病毒载体，通常选择已经经过改造的慢病毒载体作为基础，然后将需要表达的外源基因插入到载体中。

2. 插入外源基因，将需要表达的外源基因插入到慢病毒载体的适当位置。

通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法，将外源基因与慢病毒载体连接起来，形成重组的慢病毒载体。

3. 构建重组慢病毒载体，将插入了外源基因的慢病毒载体导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的复制和转录机制，使重组慢
病毒载体在宿主细胞中稳定复制和表达外源基因。

4. 验证慢病毒载体的稳定性和表达效果，对构建的重组慢病毒
载体进行验证，包括验证慢病毒载体在宿主细胞中的稳定性和外源
基因的表达效果。

通常采用PCR、Western blot等方法对慢病毒载
体进行验证。

总之，慢病毒载体构建是利用慢病毒作为基因传递的载体，将
外源基因导入慢病毒基因组中，并通过慢病毒的复制和转录机制，
使外源基因稳定地表达在宿主细胞中的过程。

这一技术在基因治疗、基因编辑、干细胞研究等领域具有重要的应用前景，对于疾病治疗
和生命科学研究具有重要意义。

慢病毒载体构建原理
慢病毒载体是一种常用于基因转染和基因治疗研究的工具，其构建原理主要包括载体选择、基因插入、包装和转染等几个关键步骤。

下面将分别对这些步骤进行详细介绍。

首先，载体选择是慢病毒构建的第一步。

常用的慢病毒载体包括pLenti、pSico、pRetro等，这些载体通常具有较高的转染效率和稳定性。

在选择载体时，需要考虑载体的大小、复制能力、转染效率以及转染细胞类型等因素，以确保最终构建的慢病毒载体能够满足实验需求。

其次，基因插入是慢病毒构建的关键步骤之一。

一般来说，可以利用限制性内切酶切割载体，然后将待插入的基因片段与载体连接，形成重组载体。

在进行基因插入时，需要注意选择合适的限制性内切酶，控制酶切的时间和温度，以确保基因能够正确插入到载体中。

接下来是包装步骤。

包装是指将重组载体导入到包装细胞中，通过包装细胞的辅助，使其产生慢病毒颗粒。

常用的包装细胞包括293T细胞、HEK293细胞等。

在包装过程中，需要利用辅助载体，如
pMD2.G和psPAX2等，通过三质体共转染的方式，使包装细胞产生
慢病毒颗粒。

最后是转染步骤。

转染是将包装好的慢病毒颗粒导入到目标细
胞中，实现基因的转染。

在进行转染时，需要根据目标细胞的特性
选择合适的转染方法，如离体转染、体内转染等，以确保慢病毒能
够有效地转染目标细胞，并表达目标基因。

总的来说，慢病毒载体构建的原理涉及到载体选择、基因插入、包装和转染等关键步骤。

通过合理的实验设计和操作，可以构建出
稳定、高效的慢病毒载体，为基因转染和基因治疗研究提供有力的
工具支持。

现今常用的制备慢病毒载体的方法为使用3或者4质粒系统转染293T细胞。

此外，也有使用其它几类慢病毒包装细胞系制备慢病毒载体。

瞬时转染制备慢病毒：细胞：慢病毒包装常用人胚肾细胞(HEK, human embryonic kidney)293T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白编码基因，转染效率极高。

但其贴壁性不好，所以需要使用多聚赖氨酸包被的培养皿增加其吸附性。

多聚赖氨酸培养皿可购买，也可自行制备。

转染前，细胞密度控制在40-70%比较好。

DNA：每10 cm培养皿约含5x106 293T细胞，需用30-40 ug不含内毒素的质粒进行转染。

质粒的纯度对慢病毒载体的包装效率非常关键。

不同的包膜蛋白表达载体，其使用量也不同。

转染：最经济的转染方法是磷酸钙转染法，虽然其溶液配置影响因素多，不易稳定重复得到最佳的转染结果。

其它方法有脂质体法和PEI法。

转染48-60后可以收集上清，通过低速离心，然后滤膜过滤可以去除上清中的细胞碎片。

如果使用VSV-G包膜蛋白的话，可以通过两次超速离心进行浓缩，从而最高可以获得滴度高达1011-1012 IU/ml的慢病毒载体。

之后可以将病毒载体溶解在PBS，HBSS或者DMEM中，并置于-80℃储存。

储存溶液添加血清会帮助提高病毒冻融时的存活率，然而有些病毒在侵染细胞时，血清会有干扰，所以需要依据具体病毒种类考虑是否添加血清。

病毒滴度：含VSV-G的慢病毒载体，其滴度在浓缩前一般为107 IU/ml，浓缩之后可以达到109 -107 IU/ml 。

含有荧光标记或者其它报告基因的病毒载体，可以通过梯度稀释侵染HeLa或者293，NIH3T3细胞来确定其滴度;不含报告基因的可通过测定病毒颗粒中相关病毒蛋白的活性或者含量来确定其滴度，比如使用p24gag的elisa试剂盒。

一般来说，每4-60 x 103个病毒载体含1ng p24 gag。

然而这种方法测出来的滴度并不准确，不同的病毒载体类型，不同的储存方式，都会导致p24 gag和病毒载体颗粒的比值变化较大。

慢病毒载体相关知识问答Q:什么是慢病毒？A: 慢病毒载体(Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因或siRNA的病毒载体系统，其感染效率可以达到100%。

慢病毒和细胞结合后通过包装蛋白将含有目的基因或者干扰序列释放到细胞内。

慢病毒RNA 通过逆转录酶转录为DNA。

DNA整合前复合体进入细胞核并整合到靶细胞的染色体DNA。

由于靶基因或基因干扰序列整合到染色体上并且伴随着细胞分裂时DNA的复制一起复制，基因的导入能够获得稳定的表达。

慢病毒的显著优势在于其可以整合到非分裂细胞，而其他载体（如非病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体）不具备整合到靶细胞染色体的特性，或者只能整合到分裂细胞的染色体（如常规的逆转录病毒）。

目前我们使用的慢病毒载体是基于HIV-1改造而来，该载体使用最为广泛，经过科学家的多次改造在包装滴度和使用安全性等方面都非常理想。

在实际的使用中我们可以用来表达目的基因或目的基因加上报告基因，近年来随着RNAi研究的深入，越来越多的科学家用慢病毒载体来表达干扰序列.Q:慢病毒用于RNAi研究A:目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。

当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。

U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。

慢病毒载体—包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录慢病毒载体—包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

学术术语来源---携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡文章亮点：1慢病毒做为介导基因转染的载体，具有独特的优势，既可以感染分裂细胞又可以感染非分裂细胞，原代培养的颗粒细胞能够直接反映体内的功能状况，因此，课题采用慢病毒介导基因成功感染原代培养的人卵巢颗粒细胞，望能为进一步研究卵巢早衰等内分泌相关疾病奠定理论基础。

2人原代卵巢颗粒细胞能够准确反映卵巢的功能状态，但由于原代细胞培养过程复杂、难度大、生长时间短，较难被各种基因载体转染，故与原代细胞相关的实验研究较少。

3实验采用人类原代培养的卵巢颗粒细胞为靶细胞，利用慢病毒将报告基因增强型绿色荧光蛋白及抗凋亡基因bcl-2导入原代培养的颗粒细胞中，结果发现抗凋亡蛋白Bcl-2的过度分泌能够抑制颗粒细胞凋亡，同时也表明携带增强型绿色荧光蛋白的空载慢病毒对体外培养的卵巢颗粒细胞具有一定的毒性，随着作用时间的延长及病毒滴度的增加，颗粒细胞的凋亡率明显增加，为研究临床细胞凋亡相关性疾病基因治疗奠定基础。

关键词：组织构建；组织构建细胞学实验；bcl-2基因；慢病毒；卵巢颗粒细胞；细胞凋亡；基因转染；载体构建；卵巢早衰；增强型绿色荧光蛋白基因；国家自然科学基金摘要背景：慢病毒可以感染分裂及非分裂细胞，对于较难转染的原代卵巢颗粒细胞，慢病毒能否成功进行感染？目的：探讨携带bcl-2基因的慢病毒感染原代人卵巢颗粒细胞的效率及对细胞凋亡的影响。

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。

当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。

U6和H1 RNA 启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。

在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。

慢病毒载体构建是一种用于基因治疗和基因转导的重要工具，其用于将外源基因或shRNA等插入到慢病毒载体中，从而实现对特定基因的表达调控。

下面是慢病毒载体构建所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、所需试剂和耗材1.慢病毒载体：用于包装目的基因的包装细胞系，如HepG2.2.15等。

2.目的基因或shRNA：需要插入慢病毒载体的DNA或RNA片段。

3.质粒DNA：用于构建慢病毒载体，包括表达盒质粒和包装质粒等。

4.DNA聚合酶：用于DNA扩增和连接。

5.限制性内切酶：用于DNA切割。

6.DNA连接酶：用于DNA连接。

7.缓冲液：维持反应液的pH值和其他辅助因子的浓度。

8.dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）：DNA合成的原材料，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP。

9.细胞培养基：用于细胞培养。

10.胎牛血清：提供细胞生长所需的营养物质。

11.抗生素：用于防止细胞污染。

12.其他细胞生物学试剂：如胰蛋白酶、无血清培养基等。

二、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合和振荡反应液。

2.离心机：用于离心管和细胞培养瓶等。

3.水浴锅：用于保温反应液。

4.移液器：用于精确添加试剂和溶液。

5.细胞培养箱：用于细胞培养。

6.倒置显微镜：观察细胞生长状态和感染情况。

7.紫外线分光光度计：用于测量DNA浓度。

8.电泳仪和电泳槽：用于分析DNA样品。

9.定量PCR仪：用于定量分析目的基因的转导效率。

三、准备工作1.了解慢病毒载体构建的基本原理和步骤。

2.设计并合成目的基因或shRNA序列，并确认其正确性。

3.准备所有所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

4.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

5.准备好实验服、口罩、手套等个人防护用品。

6.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

7.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。

8.设置细胞培养箱的温度和湿度等参数。

慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够长期潜伏在宿主细胞内，并且在细胞分裂时能够传递给子细胞的病毒。

慢病毒的研究和应用在基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域具有重要意义。

慢病毒载体构建是慢病毒研究的关键环节，下面将介绍慢病毒载体构建的原理。

首先，慢病毒载体构建的关键是选择合适的病毒骨架。

常用的慢病毒载体包括HIV-1、HIV-2和SIV等。

这些病毒骨架具有较高的转导效率和稳定性，能够有效地将外源基因导入宿主细胞中。

在选择病毒骨架时，需要考虑到载体的稳定性、毒性和转导效率等因素，以确保慢病毒载体能够在宿主细胞中稳定表达外源基因。

其次，慢病毒载体构建需要将外源基因整合到病毒基因组中。

一般来说，外源基因会被整合到病毒的长末端重复序列（LTR）之间，这样可以确保外源基因能够稳定地表达。

在整合外源基因时，需要使用逆转录酶将外源基因的RNA转录成DNA，并将其整合到病毒基因组中。

整合外源基因的位置和数量会影响慢病毒载体的稳定性和表达水平，因此需要对整合位点和整合数量进行精确控制。

另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的包装限制。

在病毒的生命周期中，病毒颗粒的组装和包装需要依赖于病毒的包装信号。

因此，在构建慢病毒载体时，需要确保外源基因的整合不会影响到病毒的包装信号，否则会影响病毒的组装和包装，从而降低病毒的转导效率和稳定性。

最后，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。

在构建慢病毒载体时，需要对病毒的毒性进行改造，以降低其对宿主细胞的损害。

同时，还需要对病毒的复制和传播进行限制，以确保慢病毒载体在宿主细胞中稳定表达外源基因，同时不会对宿主细胞造成不良影响。

综上所述，慢病毒载体构建是慢病毒研究和应用的重要环节。

通过选择合适的病毒骨架、整合外源基因、考虑病毒的包装限制和确保病毒的安全性和稳定性，可以构建出稳定、高效的慢病毒载体，为基因治疗、基因工程和细胞治疗等领域的研究和应用提供重要支持。

慢病毒载体构建原理慢病毒是一类能够引起慢性感染的病毒，其特点是在宿主细胞内复制速度较慢，病程较长。

慢病毒载体是一种用于基因转移和基因治疗的工具，其构建原理是通过将外源基因插入慢病毒基因组中，利用慢病毒的复制和转录机制将外源基因稳定地表达在宿主细胞中。

本文将介绍慢病毒载体构建的原理及相关技术要点。

首先，慢病毒载体构建的基本原理是利用慢病毒的基因组和复制机制来稳定表达外源基因。

慢病毒基因组包括基因组RNA和反转录酶，而慢病毒的复制过程主要依赖于反转录酶的活性。

因此，构建慢病毒载体的关键是将外源基因插入到慢病毒基因组中，并确保其在宿主细胞中的稳定表达。

其次，慢病毒载体构建的技术要点包括选择合适的慢病毒载体和外源基因插入位点。

常用的慢病毒载体包括逆转录病毒和伞状病毒，它们具有较高的基因载荷能力和稳定的表达特性。

而外源基因的插入位点则需要选择在慢病毒基因组中不影响病毒复制和转录的区域，通常选择在非编码区域或非必需基因上进行插入。

另外，慢病毒载体构建还需要考虑到病毒的安全性和稳定性。

为了确保慢病毒载体在宿主细胞中的稳定表达，需要对其进行适当的改造和优化，例如加入启动子和终止子来调控外源基因的表达水平，或者利用基因编辑技术来增强慢病毒的复制和转录能力。

此外，为了降低慢病毒载体的致病性和提高其安全性，还可以通过删除病毒基因组中的致病基因或关键复制基因来实现。

总之，慢病毒载体构建是一项复杂而关键的技术工作，其成功与否直接影响到基因转移和基因治疗的效果。

通过深入理解慢病毒的复制机制和基因组结构，合理选择慢病毒载体和外源基因插入位点，以及优化病毒的表达和安全性，才能够成功构建出稳定、高效、安全的慢病毒载体，为基因治疗和基因转移研究提供有力的工具支持。

慢病毒载体的构建一．构建原理：慢病毒属于逆转录病毒科, 但其基因组结构复杂, 除gag 、po l 和env 这3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外, 还包括4 个辅助基因, vif 、vp r 、 nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev 。

H IV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒, 第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。

慢病毒载体的构建原理就是将H IV 21 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。

载体系统包括包装成分和载体成分: 包装成分由H IV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建, 能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白; 载体成分与包装成分互补, 含有包装、逆转录和整合所需的H IV 21 顺式作用序列。

同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV ) 的可能性, 将包装成分的5′ L TR 换成巨细胞病毒(CMV ) 立即早期启动子, 3′ L TR 换成SV 40 po lyA 位点等。

将包装成分分别构建在两个质粒上, 即一个表达gag 和po l 、另一个表达env 。

二．实验操作举例：一）磷酸钙法转染HEK293T 细胞1. 试剂配制:无菌水ddw: 高温灭菌; 分装;2XHBS: 280mM NaCl10mM KCl1.5 mM Na2HPO412 mM glucose50 mM HEPESAdjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌,分装;2M CaCl2: 过滤灭菌,分装.2. 实验过程:1. 铺细胞: 选择状态良好的293T 细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish.2. 20-24h 后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染.下面就35mm dish 为例,采用以下转染体系:ddw: 105ulplasmid: 2 ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)2M CaCl2: 16.5ul2XHBS: 125ul按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂.先将前三者混匀,最后加2XHBS.一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入,吹打至微现乳白色,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.另一种方法是,加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定,建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打),之后步骤同上,立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液.二）转染方法2-Fugene转染病毒包装1．传293T细胞，将T75用明胶包被，每瓶T75加1.5-2mL明胶，置于37度培养箱10min。

金拓思慢病毒产品说明书一、产品简介慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点，慢病毒载体作为一种重要的基因转移工具应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。

区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，达到良好的基因治疗效果。

我公司生产的重组慢病毒均以国际通用的第三代载体四质粒体系生产，通过重组改造后将含有目的基因的慢病毒骨架及其相应的作用元件组合为新质粒，并通过辅助质粒将病毒包装的元件组成重组病毒。

通过自我灭活的方式，阻止病毒自我复制。

保证了慢病毒使用过程中的良好生物安全性。

二、重要说明2.1安全操作说明1.应在Ⅱ级及以上级别生物安全柜中使用慢病毒产品。

2.虽经过改造后病毒安全性极大提高，操作中仍需佩戴口罩、手套等安全防护措施以免产生潜在危害。

3.操作中所有接触慢病毒试剂的样品、耗材、器皿等均需通过84消毒液（1:20）浸泡后，高温121℃灭活15min以上。

4.实验过程中有病毒液洒落的情况时，应用纸巾将病毒液吸干后喷洒70乙醇，并将擦干的纸巾一并高温处理以免造成其它伤害、污染环境。

2.2使用注意事项所有慢病毒产品均通过干冰低温运输，请收到产品后立即转入-80℃冰箱保存。

每次使用时提前取出病毒液放置在4℃冰箱待融化，并保存于4℃冰箱。

每次融化后请尽快使用，病毒液应尽量避免反复冻融降低病毒滴度。

三、慢病毒制备与使用3.1实验材料细胞：人贴壁细胞293T培养基：高糖DMEM培养基血清：胎牛血清抗生素：青链霉素转染试剂：Transfection-mate增强剂：Polybrene3.2病毒制备方法3.2.1细胞准备细胞复苏：1.将液氮保存细胞取出后，迅速放入37℃水浴锅内，应及时轻柔摇动加快解冻速度。

2.将完全溶解的细胞离心，1500rpm，3min。

慢病毒载体在基因治疗中的应用前景随着科技的飞速发展，基因修复技术被广泛运用于人类疾病治疗。

然而，直接将基因修复剂传递到人体内，其危险性和有效性仍是一个开放性问题。

因此，研究人员开始探索利用慢病毒载体作为基因治疗的有效手段。

本文将探讨慢病毒载体在基因治疗中的应用前景。

一、慢病毒载体的特点慢病毒是一种非致命性病原体，具有以下特点：1. 可以将自己的RNA融入宿主DNA中；2. 在宿主体内存在较长时间，细胞内繁殖速度缓慢；3. 安全性高，转导范围广。

这些特点使得慢病毒载体成为基因治疗的潜在治疗手段。

二、慢病毒载体在基因治疗中的应用慢病毒载体在基因治疗中的应用主要有两种方式：直接将慢病毒载体注入人体、将基因修复剂嵌入慢病毒载体中单独注入人体。

前者可直接降低基因修复剂与宿主细胞的反应率，后者则可以提高基因修复剂的转导效率。

三、慢病毒载体的优势1. 转导范围广慢病毒载体可以在众多类型的细胞中高效转导，包括胚胎干细胞、造血干细胞及其分化的各种成分，机体多种组织和器官中的多种细胞，如心肌细胞、肝细胞、肌肉细胞、神经系统细胞等。

2. 转导效率高慢病毒载体能将外源基因表达至持续接近宿主细胞内基因治疗领域的观察时间。

在满足适当条菌感染条件下，慢病毒载体可以完成相对完整的外源基因整合进宿主细胞某个区域的整合，也可以在细胞内产生高效或稳定的外源基因表达。

3. 病毒相关疾病风险低慢病毒载体基本上不会导致肿瘤形成。

实验证明，慢病毒载体直接接触人体的作用时具有安全性，病毒产生病毒相关性疾病的风险较小。

由于慢病毒载体生长速度缓慢，造成病毒感染的风险也随之降低。

四、慢病毒载体的挑战1. 载体突变率高慢病毒载体在传播或整合到人体自身细胞时，由于长链RNA的复制过程，会出现一定的错误率。

这可能导致慢病毒载体突变，并产生与其本身不同的药物适应性。

2. 抗体的干扰人体对于外源病毒的抵抗力使得慢病毒载体越来越难以进入细胞。

一些慢病毒载体会被人体产生抗体排除，那么它的疗效就会大大降低。

一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。

通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。

用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。

三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。

回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。