利用ITS序列鉴定真菌

核糖 体 Ｄ ＮＡ 中的 １ ８ Ｓ 、 ５ ． ８ Ｓ和 ２ ８ ｓ的基 因组序 列在 大 多数 生 物 中 比较 保 守 ， 在 生 物种 间变 化 小 ； 而 内转 录间隔 区 Ｉ ＴＳ １ 和Ｉ Ｔ Ｓ ２作 为非 编码 区 ， 承受 的选 择 压 力 较 小 ， 相 对 变化 较 大 ， 并 且 能 够 提供 详 尽 的系统学 分析 所需要 的可遗 传 性状 ， 既 具 有保 守 性， 又均 在 科 属 种水 平 上 有 特 异性 序 列 ， 可 以作 为 真菌 分类鉴 定 的重要 依 据之 一 。Ｉ ＴＳ ＿ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ（ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ —
ｐ ｏ ｌ ｙ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｉ ｓ ｍ， 基于 Ｉ Ｔ Ｓ的 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性） 鉴 定技术 在 一些大 型 真 菌上 已经 有所 应 用ｌ ＿ ７ ｊ 。
该技术 是选 用不 同 的内切 酶 ， 对 真 菌 体 内的 核糖 体
ＲＮＡ 基 因特 征 进 行 分 子 生 物 学 的进 一 步 区 分 ， 根 据产 物多态 性分 析来 鉴定 真菌种 类 。 本 研究 以棉 花主要 病原 真 菌 大丽 轮枝 菌 、 黑白 轮 枝菌 、 立枯 丝核 菌 、 串珠镰 刀 菌 、 粉红 单 端孢 和 尖 孢镰 刀 菌为 主要检 测对 象 ， 根 据对 各 自的 Ｉ Ｔ Ｓ序 列 和不 同酶切位 点 的分析 ， 制 作可 供 比对 的参 考 电子
± 塑 ： 棉花主要真菌病害病原菌 Ｉ Ｔ Ｓ － Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ快速鉴定方法 ・２ ０ １ ３ ， ４ ０ （ １ ２ ） ： １ ３ ～１ ６
棉 花 主 要 真 菌病 害病 原 菌 Ｉ ＴＳ — ＲＦ Ｌ Ｐ快 速 鉴 定 方 法
李 志芳 ， 冯 自力 ， 赵 丽红 ， 师 勇强 ， 王玲 飞 ， 朱 荷琴

（3）取上清加入0.6倍体积异丙醇，室温下静置15min；沉 淀核酸
（4）4℃,10000g离心15min，取沉淀，用75%乙醇洗2次， 无水乙醇洗一次，真空干燥5min；
（5）将沉淀溶解在200μL pH8.0 TE Buffer中。 注：酚-氯仿-异戊醇于棕色瓶中4℃保存。
二、PCR加样体系
真菌DNA模版 10×buffer MgCl2（25mM） dNTP（各2.5mM） 上游引物ITS1 （10μM） 下游引物ITS4 （10μM） rTaq酶（5U/μL） ddH2O 总体积
利用ITS序列鉴定未知真菌
温永芳 2015.6.12
1：ITS鉴定原理 2：PCR原理 3：电泳原理 4：具体操作
目录
形态学鉴定：菌落形态、孢子形态等
微生物鉴定 分子鉴定
细菌：16s rDNA 真菌：ITS序列
生理生化
一、 ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定是指对ITS
二、PCR原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶 链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、 延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子 链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在 体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序 列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方 面。
电泳仪器和试剂
电泳仪、电泳槽、灌胶模具等 琼脂糖、TEVቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ冲液、样品缓冲液
一、真菌基因组DNA提取
CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与 脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并 使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。

its引物pcr体系学则
PCR（聚合酶链反应）是一种在体外复制DNA片段的技术。

ITS （内转录间隔区）是真菌分类和鉴定的一种标记。

ITS引物PCR是一种基于PCR技术使用ITS序列进行菌种分类和鉴定的方法。

ITS引物PCR体系是包含DNA模板，引物，酶和缺失DNA，反应缓冲液和其他诸如浓度和pH值等条件的反应混合物。

常见的ITS引物包括ITS1和ITS4，是从内转录间隔区序列中选择的特定引物。

PCR反应分为三步，即变性、回退和延伸。

引物与DNA模板杂交，引物延伸成DNA链，扩增目标DNA序列，不断重复该过程可得到数百万个复制的DNA片段。

ITS引物PCR技术可以在短时间内快速确定真菌的系统分类位置和物种鉴定。

它简单易行，并可用于复杂菌群的鉴定。

因此，在微生物学、生态学、农业、食品科学等领域中得到了广泛的应用。

关键词 ： 内转 录间隔区 ； 因测序 ； 基 丝状真菌 ； 形态学鉴定
Ｅｖ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ＤＮＡ－ｎ ｅ ｎ ｌ ｔａ ｓ ｒｂ ｄ ｓ ａ ｅ ｅ ｉ ｎ ｓ ｔ ｒ ｅｓ ｆ ｒ ｍｏ ｅ ｕ ａ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｏ ｌ ｉａ ａ ｕ ｔｏ ｎ ｒ ｉ ｔ ｒ ａ ｒ ｎ ｃ ｉ ｅ ｐ ｃ ｒ ｒ ｇ ｏ ｓ ａ ａ ｇ ｔ ｏ ｌ ｃ ｌ ｒ ｉ ｅ ｔ ａ ｉ ｆ ｃ ｉ ｃ ｌ ｉ ｆ ｏ ｎ
Ｔ ｅｆ ｎ ｔ ｎ ｏ Ｌ Ｔ ｉ ｅ Ｂａ ｋ ａ ｔ — ｅ ｅ ａｉ ｇｓ ｓ ｍ ｒｐ ｙｏ ｅ ｅ ｉ ｔｅ ｎ ｏ ａ ａｉ ｅｉ ｄ ｃ ｔ ｒ ｗ ｓｈ ｌ ｆ ｌ ｏ ｈ ｃ ｉ ｆ ＡＳ Ｇ ｎ ｎ ｕ ｏ ｇ ｎ ｒｔ ｙ ｔ ｆ ｈ ｌｇ ｎ ｔ ｒ ｅａ ｄ ｃ ｍｐ ｒ ｔ ｉ ａｏ ｓ ａ ｅ ｐ ｕ ｕ ｏ Ｂ ｎ ｎ ｅ ｏ ｃ ｖ ｎ ｔ ｄ ｔ ｒ ｎ ｈ ｉｈ ｈ ｍｏ ｏ ｏ ｓｓ ｑ ｅ ｃ ｓ Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｕ ｄ ｂ ｏ ａ ｅ ｉ ｈ ｒ ｈ ｌ ｇｃ ｌｉｅ ｔ ｃ ｔ ｎ ａ ｄ ｔｅ ｅ ｅｍｉ ｅ ｔ ｅ ｈｇ ｏ ｌｇ ｕ ｅ ｕ ｎ ｅ ． ｈ ｅ ｕｔ ｓ ｏ ｌ ｅ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗ ｔ ｔｅ ｍｏｐ ｏ ｏ ｉａ ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ｎ ｈ ｓ ｈ ｉ ｆ ｏ
ｃ ａ ａｔ ｎ Ｐ Ｒ）ａ ｐｉｃｔ ｎ ｎ ｈ Ｃ ｒｄｃｓｗ ｒ ｓｑｅ ｃｄ ａｄｃｍ ａｅ ｉ ｈ ａａｉ ｅＢ ｎ ． ｈ ｉ ｒ ｃｉ （ Ｃ ｎｅ ｏ ｍ ｌ ａ ｏ ，ａｄｔｅＰ Ｒ ｐｏｕｔ ｅｅ ｅｕｎ ｅ ｎ ｏ ｐｒｄｗｔ ｔ ｄｔ ｎＧ ｎ ａ ｋ ｉ ｆ ｉ ｈ ｅ
摘要 ： 目的 评价 内转 录间隔区（Ｔ ） ＩＳ 的多态性序列分 析（Ｄ Ａ ＩＳ序列分析 ） 临床少 见丝状真 菌的鉴定 ｒＮ — Ｔ 对 作用 ， 以形态学 鉴定方 法加 以补充验证 。方法 将 ３株待检 真菌通过 聚合 酶链 反应 （ Ｃ 扩 增和基 因测 序方法 Ｐ Ｒ）

Is ola tion of R abbit Derma tophyte s a nd Ana lys is a nd Ide ntifica tion of The irITS Se quence sLI Ming-yong ，M U Te ，LIU Ma n ，WANG Zha o-Pe ng（Qingdao Kangda Foo d Co mp a ny L imited ，Qingda o 266400）Abstr act:[Objectiv e]Rabbit Dermatophytes were isolated and their ITS sequences were analy zed and identified.[M ethod]T he co llected scurf and scab were cultured ，and then identified by morpho log ical traits;the fung al ITS region-specific primers were used to perform amplification and sequencing of the ITS.Thro ug h the blast analysis betw een ITS sequences and GenBank nucleic acid database ，the bio logical classificatio ns were identified and finally their relationships w ere analyzed acco rding to the phylo genetic tree.[Result]T he isolated rabbit Dermato phy tes were preliminary identified as M icrosporum by morpho log ical characteristics;the results of sequence analysis and phylogenetic tree show ed that the isolated fungi and M icro spo rum gypseum strain WCH-M G001（Accession Number:GU348990.1）belo nged to one g roup w ith 99%ho molo gy ，indicating that the isolated f ungi w ere M icrosporum g ypseum.Key words:Rabbit;Dermato phyte;M icrosporum gy pseum;ITSsequence 兔皮肤病原真菌的分离及其ITS 序列的分析鉴定李明勇，牟特，刘曼，王召朋（青岛康大食品有限公司，青岛266400）摘要:【目的】分离发病兔场皮肤真菌病的病原，并对其ITS 序列进行分析鉴定。

真菌分子生物学鉴定方法
真菌的分子生物学鉴定方法通常包括以下步骤：
DNA 提取：首先需要从真菌样本中提取DNA。

这可以通过商业DNA 提取试剂盒或自制的DNA 提取方法来实现。

PCR 反应：利用聚合酶链反应（PCR）扩增特定的真菌基因片段。

常用的标记基因包括核糖体RNA基因（rRNA）和线粒体DNA等。

对于真菌，常用的靶标基因包括18S rRNA、ITS（内转录间隔区）和28S rRNA等。

测序：对扩增得到的DNA片段进行测序，可以使用Sanger测序或者更先进的下一代测序技术。

序列分析：将测序得到的DNA序列与数据库中的真菌序列进行比对，以确定真菌的物种。

常用的数据库包括GenBank、UNITE等。

构建系统发育树：利用比对后的序列数据构建系统发育树，以了解真菌的亲缘关系和分类位置。

基于ITS序列鉴别真菌类药材马勃及其混伪品张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【摘要】目的:运用ITS序列鉴别真菌类药材马勃Lasiosphaera calvatia及其混伪品.方法:收集来自重庆、北京等9个地方的21份脱皮马勃、大马勃、紫色马勃样品,提取基因组DNA,经PCR扩增后双向测序.同时从GenBank上下载常见马勃药材混伪品的序列.将所有序列进行剪切校准拼接后分析,基于K2P(Kimura 2-Parameter)模型计算马勃及其混伪品的种内和种间遗传距离,并构建Neighbor-Joining(NJ)系统聚类树.结果:大马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0;脱皮马勃的ITS序列种内最大K2P遗传距离为0.003;紫色马勃的ITS序列种内最大遗传距离为0.003.大马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.019,脱皮马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.031,紫色马勃与混伪品种间最小K2P遗传距离为0.634.大马勃、脱皮马勃、紫色马勃的种内最大遗传距离均小于它们与混伪品的种间最小遗传距离.NJ树结果显示大马勃、紫色马勃、脱皮马勃各自聚为一支,表现出良好的单系性,能够与混伪品明显的区别开来.结论:基于ITS序列的条形码技术可以将马勃药材及其混伪品有效进行鉴别.【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2016(011)005【总页数】5页(P777-780,785)【关键词】马勃;混伪品;ITS;条形码【作者】张嘉丽;黄宇航;宋明;任阳阳;张梦婷;刘霞;孙伟;陈士林【作者单位】武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;安利(中国)植物研发中心,无锡,214145;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700;武汉理工大学化学化工与生命科学学院,武汉,430070;中国中医科学院中药研究所,北京,100700【正文语种】中文【中图分类】R282马勃Lasiosphaera calvatia为灰包科真菌脱皮马勃Lasiosphaera fenzlii Reich.、大马勃Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd、紫色马勃Calvatialilacina(Mont.et Berk.)Lloyd的干燥子实体，能够清肺利咽、止血，用于治疗风热郁肺咽痛，音哑，咳嗽；外治鼻衄，创伤出血[1]。

[基金项目] 浙江省档案局科研项目(2007-9)[作者简介] 燕勇(1974-),男,学士,主管技师,主要从事微生物检验工作。

=论著>r DNA -I TS 序列分析在真菌鉴定中的应用燕勇,李卫平,高雯洁,沈志英,王恒辉,陈黎霞(浙江省嘉兴市疾病预防控制中心,浙江嘉兴 314050)[摘要] 目的:通过对3株真菌的rDNA -I T S 序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA 基因(即rDNA )内转录间隔区(In ternal T ranscribed Spacer ,I T S)的多态性的序列分析(rDNA -I T S 序列分析)在真菌鉴定中的应用。

方法:通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA -ITS 序列,从GENBANK 获取相似序列,使用BLA S T 和DNAMAN 工具对r DNA -I TS 序列进行比对分析。

结果:1号真菌菌株与X y l a riales sp 1LM 40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penic illi u m oxa li cu m;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母III 组(最新命名为Candida m etaps il o si s)。

结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA -ITS 序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS 区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。

[关键词] r DNA;内转录间隔区(ITS);PCR;测序;真菌;鉴定[中图分类号] R 44615 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2008)10-1958-04Application of r DNA I TS sequence analysis in fungus identificationYan Yong,L iW ei -p ing ,Gao W ei -jie ,Shen Zhi -y in g,W ang H eng-hui ,Chen L i -x iao (Jiax ing Cente r for D i sease Contro l and P reventi on ,Ji ax i ng 314050,Chi na)[Abstract] O bjective :T o introduce and illu m i nate t he applicati on o f r DNA I T S sequence ana l ysis i n f ungus i dentifica ti on on basis o f sequence and l eng t h poly m orph i s m s o f i nterna l transcr i bed spacer(I TS)i n ri bosoma l RNA gene(rDNA )1M ethods :T he three pend i ng fungus stra i ns c rDNA I T S sequences tested by PCR a m plifi cati on and sequenc i ng m e t hods were analyzed and co m-pared w ith si m ilar sequences fro m G E N BANK by N CB I BLAST on li ne too l and DNAMAN so ft w are 1Resu lts :N o 11f ungus stra i n had a h i gh hom ology w it h X y l a riales sp 1L M 40,bu t w as no t yet i den tifiab le on genus or spec ies l eve l o f taxonom ic c l assifi ca -ti on 1N o 12strai n w as i den tified as P en icilliu m oxalicu m,a genus l eve l 1N o 13strai n w as i dentified as Cand i da m etapsil os i s ,ne w desi gnati on of Candida parapsilosis group III ,a g roup l eve l i n spec ies re l a ti ve l y 1Conc l u si on :Compared w ith the traditiona lm or -pho l og ical i den tificati on m ethods ,the r DNA ITS sequence ana lysis i s m ore ob j ective ,ti m e-sav ing ,convenient ,and fast for fun -gus identificati on ,butw it h so m e appli ed li m its currently 1D epended on the perfecti on deg ree o f gene database ,the nu m ber o f h i gh-deg ree homo l ogy sequence ,t he var i ability ex tent of ITS reg i on of biolog ical i nd i v i duals and so on it can be app lied 1T hen ,it does not identif y all f ung ,i and shoul d be co m bi ned w ith the trad iti ona lm orpho l og i ca l identificati on m et hods for f ungus identificati on 1[K ey words] r DNA;Inte rnal transcr i bed spacer(ITS);PCR;Sequenc i ng ;F ungus ;Identifi cation 真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S r DNA 、5S r DNA 、18S rDNA 和518S r DNA 4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。

Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔ ｉ ｐ ｐ ｒ ｓ ｍｍａ ｉｅ ｔ ｅ ｒ ｓｒ ｃ ： ｈｓ ａ ｅ ｕ ｒ ｓ ｈ ＤＮＡ－ Ｔ ｓ ｑ ｅ ｃ ａ ａｙ ｉ ｔ ｃ ｎ ｌ ｇ ｐ ｉ ｃｐ ｅ ｔｃ ｎ ｃ ｌ ｚ ＩＳ ｅｕ ｎｅ ｎ ｌ ｓｓ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｒｎ ｉ ｌ ， ｅ ｈ ｉａ
析 及病原腐霉的诊断和 比较各种类 的亲源关 系上 ， 例如对群结腐 霉菌的鉴定 ．
３４ 其他 分子 生物 学技 术 的应 用 聚合酶链 式反应一 链构象多 态性分析 （Ｐ Ｒ ｓ ｃ ） ． 单 Ｃ — ｓ Ｐ是一 种有较高 开发潜力 的技 术 ，
目前在植物病原 菌分类鉴定 中用 的还 比较 少．Ｃ — Ｓ Ｐ Ｄ Ａ 指纹技 术 以及 Ｄ Ａ 直接测序 法一样有简单快 速的特点， Ｐ ＲＳＣ 和 Ｎ Ｎ
ｕ ｉ ｕ Ｔｏ ｈｍ ｍ ｒｗ的检 测 ．
３３ ＲＦ Ｐ 、 ． Ｌ ＲＡＰ 和ＡＦ Ｐ在腐霉分子研 究上的应用 限际性长度多态性 分析（Ｒ Ｌ ） 酶切 的方法对 Ｄ Ａ 进行 序 Ｄ Ｌ Ｆ Ｐ利用 Ｎ
列多态性分 析． 在真菌 的分类 鉴定 中，Ｒ Ｌ 技术主要用 于分析相似种 间的亲源关系及种 内变异性． ＦＰ 例如采用 Ｐ Ｒ Ｒ Ｌ Ｃ — Ｆ Ｐ图
而 且更加经 济实 用 、 敏度会更 高， 是对于处 理大批量 的样 品时， Ｃ — Ｓ Ｐ比常规 Ｐ Ｒ更 有优势，只需要 一对通用 灵 尤其 Ｐ Ｒ ＳＣ Ｃ 引物就能够 同时对多个腐 霉种进行鉴 定． 对不 同的腐 霉菌株采用 ｒ Ｎ —Ｔ １ Ｃ — Ｓ Ｐ 析， 同的腐 霉种都有特 例如 Ｄ Ａ ＩＳ 的Ｐ Ｒ Ｓ Ｃ 分 不 征 Ｓ Ｃ 条带，利用 这一技术可将腐霉鉴定到种． ＳＰ 线粒体 Ｄ Ａ（ Ｄ Ａ） Ｎ ｍｔＮ 用于腐霉进化 和系统研究有 一定 的优势． 例如采用不 同种属 的腐霉 菌的细胞色素 Ⅱ（ＣＸ 基 因 Ｏ Ⅱ） 序列来研 究腐霉属的 系统 发育 关系 ； 利用线粒 体细胞色素氧化酶 Ⅱ基 因及间隔 区基 因序列分析 ， 把从形态特征上很难 区别 的菌株 区分 开． 目前 ｍ Ｄ Ａ 分 析方法在腐 霉的分子研 究上应用 还较少，将来通 过技术革 新， ｔＮ 有希望 在腐霉 Ｄ Ａ分 析鉴定 Ｎ

图１ 显示 ， Ｓ区段是位于 ５ ０—７０ ｂ 间的序 列 ， Ｉ Ｔ ０ ５ ｐ之 琼
脂糖凝胶 电泳检测条带单一 、 清晰 ， 说明 Ｉ 通用引物适合 疑 Ｓ Ｔ
似野生双孢菇菌株的核糖 体基 因转 录间隔 区， 样本符合测序 的条件 。
Ｃ ３ ～ ０ ｐ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ ；５ ４ ０ ｂ ： Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｃ １
（． １ 塔里木大学食用 菌研究所 ， 新疆阿拉尔 ８ ３０ ； ４ ３ ０ ２ 塔里木盆地生物资源保护利用省部共建国家重点实验室培育基地 ， ． 新疆阿拉尔 ８ ３０ ） ４ ３０
摘要 ： 通过提取新疆南疆疑似野生双孢 菇基 因组 Ｄ Ａ， Ｎ 采用通用 引物 ＩＳ Ｔ １和 ＩＳ Ｔ ４扩增 ＩＳ区序列 ， Ｇ ｎ ａｋ Ｔ 在 ｅＢ ｎ 中进行 Ｂ Ａ Ｔ， Ｌ Ｓ 对疑似菌株双孢菇进行初 步分 子鉴定 。结果表 明 ： Ｇ ｎ ａｋ的核酸序列数 据库 中登陆 的、 在 ｅＢ ｎ 与双孢 菇
收稿 日期 ：０ １—１ ９ ２１ ０—１
退火 ３ ，２℃延伸 １ｍｎ共 ３ ０ｓ７ ｉ， ０个循环；２℃延伸１ ｉ。 ７ ０ｍｎ １２ ４ ＩＳ区序列测定 ． ． Ｔ 将 Ｐ Ｒ产物送往上 海生工 生物工 Ｃ
基 金 项 目： 疆 生 产 建 设 兵 团 科 技 攻 关 项 目 （编 号 ： 新
ＩＳ Ｔ 序列 相似度 为 ９ ％ ， 数十种之 多 ， 中与登 录号为 Ｅ４０５ ９ 达 其 Ｆ６３４的双孢菇 同源性 达 １０ ， ０％ 覆盖率 达 ９％ 。根 据 １ ｒＮ Ｓ区序列分析准则和双孢 菇的形态 特征 ， Ｄ ＡＩ Ｔ 鉴定新疆南疆疑似野生双孢菇为双孢菇 （ｇｒｕ ｂｐｒ ） Ａ ａｃｓ ｉｏ ｓ 。 ｉ ｓ ｕ

基于ITS序列对野生大型真菌进行分子鉴定及系统地位研究李秋玲;吴智艳;乔洁;黄岩;侯晓强【摘要】针对目前我国食用菌存在资源广、利用少的问题,对采集于河北省廊坊市自然公园的7株大型野生真菌进行鉴定,为其开发利用与驯化栽培奠定基础.提取子实体基因组DNA,利用PCR技术对其rDNA的ITS区段进行扩增并测序,与GenBank数据库中序列进行Blast比对.采用邻接法对7株菌株进行系统发育分析.鉴定结果:ZR-1和ZR-7为大肥蘑菇(Agaricus bitorq uis)、ZR-3属于伞菌属(Agaricus julius),ZR-4属于黏滑菇属(Hebeloma sp.),ZR-5属于伞菌属(Agaricus sp.),ZR-8为罕见类群中国产地菇状马蒂奥洛菌(网孢地菇)(Mattirolomyces terfezioides≡Terfezia terfezioides),TYG-1为野生金针菇(Flammulina velutipes).这些结果为野生资源利用奠定了基础.【期刊名称】《廊坊师范学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(017)004【总页数】5页(P53-57)【关键词】野生大型真菌;鉴定;ITS;系统地位【作者】李秋玲;吴智艳;乔洁;黄岩;侯晓强【作者单位】廊坊师范学院,河北廊坊065000;河北省高校食药用菌资源开发应用技术研发中心,河北廊坊065000;廊坊市食用菌技术重点实验室,河北廊坊065000;廊坊师范学院,河北廊坊065000;河北省高校食药用菌资源开发应用技术研发中心,河北廊坊065000;廊坊市食用菌技术重点实验室,河北廊坊065000;廊坊师范学院,河北廊坊065000;河北省高校食药用菌资源开发应用技术研发中心,河北廊坊065000;廊坊市食用菌技术重点实验室,河北廊坊065000;廊坊师范学院,河北廊坊065000;廊坊师范学院,河北廊坊065000;河北省高校食药用菌资源开发应用技术研发中心,河北廊坊065000;廊坊市食用菌技术重点实验室,河北廊坊065000【正文语种】中文【中图分类】S184野生大型真菌种质资源的收集与鉴定是一项长期的基础性研究工作。

rDNA-ITS序列分析法与传统分类法相结合在真菌鉴定中的应用朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【摘要】采集了四川马尔康地区3种真菌,根据其形态学特征结合卯晓岚的《中国大型真菌》图谱,初步确定其疑似为黄菇、松乳菇、红菇3个种.为提高鉴定的准确性,通过构建基因池;用特异性引物进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序;将测得的实验样品的序列在GeneBank中进行BLAST比对;并与相似性较高的已知的种,利用DNA-MAN、Clustalx1.83和MEGA5.0软件采用N-J法构建进化树,探寻他们与已知物种的相关关系.结果表明,三种疑似菌株扩增出的目的条带为500-750bp,J1、J2、J3号菌株分别与臭黄菇、松乳菇、红菇的序列相似度最高.并利用序列的相似性做出了它们各自的进化树.最终得出结论:J1号菌株为臭黄菇(Russula foetens),J2号菌株为松乳菇(Lactarius deliciosus),J3号菌株为红菇(Russula.).利用rDNA-ITS序列分析法和形态学分类法相结合的方法鉴定菌种,不仅丰富了三种真菌的基因库,而且也克服了单纯的rDNA-ITS序列分析法因受基因库的完善程度、高度相似性序列的多少以及具体物种ITS区的可变程度等限制而不能鉴定出所有真菌的缺点,提高了真菌分类鉴定中一些模糊性状的区分度.【期刊名称】《西华师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(037)003【总页数】6页(P264-269)【关键词】真菌;鉴定;rDNA;ITS;PCR;测序【作者】朱洪庆;王盼盼;张萌;陈嘉慧;丁祥【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充637009;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川南充637009【正文语种】中文【中图分类】Q939.5传统的真菌鉴定方法主要通过培养后观察菌落形态和显微特征，或辅以生理、生化、营养实验来鉴定。

ITS2序列鉴定临床分离丝状真菌作者：吴奎海马均宝崔东岚来源：《中国保健营养·中旬刊》2013年第11期【摘要】目的：建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。

方法：利用通用引物扩增真菌核糖体转录间隔区2（ITS2），对PCR产物进行测序，在GenBank 中对测序结果进行Blastn等分析。

结果：9株真菌测序结果与表型鉴定符合，鉴定出7株临床分离丝状真菌。

结论：ITS2测序可以作为临床丝状真菌的分子生物学诊断方法之一。

【关键词】丝状真菌；内部转录间隔区；测序【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0043—02随着免疫抑制剂、广谱抗生素的广泛应用以及临床侵入性诊疗技术的广泛开展，临床深部真菌感染病例增多，尤其是丝状真菌引起的感染，对该类疾病的早期诊断对抗真菌治疗效果相当关键[1]。

丝状真菌采用传统的形态学检查，需要丰富的经验，而且耗时较长，不利于临床的快速、准确诊断。

随着分子生物学技术的飞速发展，人们发现真菌的5.8S rRNA基因和28S rRNA基因具有保守序列，它们之间的ITS2序列为可变区，具有属种差异[2]。

本研究建立以ITS2为靶序列鉴定临床分离丝状真菌的分子生物诊断方法。

1 材料和方法1.1真菌菌株本院微生物室和皮肤科实验室保存的真菌菌株，包括白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、新生隐球菌。

阴性对照为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、人类血细胞基因组。

1.2 临床分离丝状真菌临床分离7株丝状真菌，标本来源分别是血液3例、眼分泌物2例、耳道脓液2例。

1.3 DNA模板制备真菌菌株的DNA提取采用TaKaRa公司试剂盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取。

菌株 its 序列的新解析菌株ITS序列的新解析1. 引言菌株ITS序列分析是现代生物学研究的重要工具之一。

ITS（Internal Transcribed Spacer）序列是真核生物中核糖体RNA基因组内部的非编码DNA序列，位于18S、5.8S和28S rRNA基因之间，具有高度保守性和变异性。

菌株ITS序列的分析可以帮助我们了解菌株物种的分类、进化关系和功能特征。

在本文中，我们将深入探讨最新的菌株ITS序列解析方法和应用。

2. 基于深度和广度标准的菌株ITS序列分析在菌株ITS序列分析中，深度和广度是评估方法和结果质量的重要标准。

深度指的是对序列的全面解析和细致研究，包括序列比对、氨基酸残基的保守性和变异性分析、进化树构建等。

广度则是指对多个菌株或物种的ITS序列进行比较和分析，以获取更全面的信息。

基于深度和广度标准，我们可以对菌株ITS序列进行全面解析，揭示菌株之间的关系和功能特征。

3. ITS序列的变异性分析菌株ITS序列的变异性是评估菌株之间差异性的重要指标。

通过比对和分析ITS序列中的保守区域和变异区域，我们可以了解不同菌株的演化关系和功能特征。

最新的ITS序列解析方法可以自动识别变异区域，并根据多序列比对结果进行进化分析。

通过多重对比和矩阵分析，可以确定一个菌株ITS序列的亲缘关系和物种分类，为菌株分类学研究提供重要依据。

4. ITS序列解析的应用菌株ITS序列解析在多个领域有广泛的应用。

在微生物学和环境科学领域，菌株ITS序列的分析可以帮助我们了解不同环境中的微生物群落结构，从而揭示生态系统的功能和稳定性。

在药物研发和农业生产中，菌株ITS序列的研究可以帮助鉴定具有抗菌和生物农药活性的菌株，为新药和生物农药的研发提供依据。

菌株ITS序列的分析还在食品安全和医学诊断中发挥着重要作用，可以鉴定食品中的病原菌和疾病菌株。

5. 个人观点和理解在我看来，菌株ITS序列的新解析方法为菌株分类学和功能研究提供了更全面、深入的工具和途径。

基于ITS序列对万寿菊叶斑病病原菌的分子鉴定 摘要：采用改良的ctab法提取万寿菊（tagetes erecta l.）叶斑病病原菌总dna，以its1和its4为引物扩增病原菌的its片段，pcr扩增产物纯化后测序并与数据库中的已知序列进行blast比对，构建分子系统发育树，对该病原菌进行分子鉴定。结果显示分离的万寿菊叶斑病病原菌its序列与genbank中万寿菊链格孢（alternaria tagetica）af267134的its序列相似度为99%，在分子系统发育树上与万寿菊链格孢菌株聚为一支，结合形态特征确定分离的万寿菊叶斑病病原菌为万寿菊链格孢。 关键词：万寿菊（tagetes erecta l.）；叶斑病；its；链格孢属（alternaria）；鉴定 中图分类号：q939；s432.4+2；s436.8；s682.1+1 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）09-2074-03 万寿菊（tagetes erecta l.）为菊科（compusitae）万寿菊属（tagetes）一年生草本植物，不仅可用于城市的园林美化，同时也是理想的提纯天然黄色素的原料。湖北省恩施土家族苗族自治州为发展当地经济、加速新农村建设进程，积极建设万寿菊种植基地，努力扩大种植面积，巴东、鹤峰、咸丰、来凤等地的万寿菊种植已形成一定规模。但万寿菊易受到叶斑病的危害，发病率轻时占20%～30%，重则达70%以上，而且危害周期长、影响范围广，难以防治，使万寿菊的产量和质量严重下降[1]，对万寿菊的规模化生产造成了严重的威胁。 目前对万寿菊叶斑病原菌的鉴定多采用传统分类鉴定方法，因形态、地域的差异，结论并不一致。如高洁等[1]通过形态学、生理生化性状及生态学特征将万寿菊细菌性叶斑病的致病菌确定为丁香假单胞菌万寿菊致病变种（pseudomonas syringae pv. tagetis）；王龙等[2]则将甘肃地区万寿菊叶斑病的病原鉴定为链格孢属（alternaria sp.）物种。王婷等[3]通过形态鉴定将万寿菊叶斑病的病原菌鉴定为细极链格孢（a. tenuissima）。与传统的形态学鉴定方法相比，分子标记技术快速稳定，且不易受环境等因素的影响。its序列是核糖体dna上的转录单位间隔区（internal transcribed spacer，its），进化中由于不加入成熟核糖体，承受的选择压力较小，进化相对迅速且具有广泛的序列多态性，在其保守性上表现为在种内不同菌株间高度保守，而在种间存在明显差异，这为真菌的分类鉴定和分子检测提供了丰富的遗传信息，有利于属内种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[4]。本研究采用its分子标记结合形态学分类法对万寿菊叶斑病进行鉴定，以期为万寿菊叶斑病的有效防治提供依据。 1 材料和方法 1.1 供试菌株 万寿菊叶斑病带病植株采自湖北省恩施土家族苗族自治州巴东县；病原菌菌株分离后保存于恩施职业技术学院生物工程系微生物实验室。 1.2 试验方法 1.2.1 万寿菊叶斑病病原菌总dna的提取及检测 采用改良的ctab法[5]提取万寿菊叶斑病病原菌的dna，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取dna样品的质量。 1.2.3 万寿菊叶斑病病原菌its序列测定 万寿菊叶斑病病原菌its-pcr扩增产物采用uniq-10柱式pcr产物回收试剂盒纯化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司武汉测序部测序，测序要求为单向、正向测序，2个重复。 1.2.4 万寿菊叶斑病病原菌its序列分析与分子系统树的构建 将测序结果结合chromas软件查看峰形进行纠错，所得序列在genbank中进行blast同源性比对，同时在ncbi中下载同源序列。根据我国菊科植物上发现的链格孢属物种[6]以及与链格孢属形态相似的属[7]选择下载序列，共下载its序列16条。所有序列采用clustalx 1.83软件进行多序列比对，应用mega 4.0软件采用邻接法（n-j法）构建系统发育树，其他参数默认，以酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）为外类群。 2 结果与分析 2.1 万寿菊叶斑病病原菌its-pcr扩增产物的电泳检测结果 结合形态观察，万寿菊叶斑病病原菌菌株培养后可产生分生孢子，呈倒棒状、具长喙，孢子基本呈链状分布，患病植株叶片上的病斑开始时近圆形或长圆形，褐色，直径为1～5 mm，后变深褐色至近黑色，常相互愈合致整叶枯死，亦为害小枝和花茎，使病株矮化，或侵染花部使整朵花变黑褐色，与万寿菊链格孢的形态学特征一致，从而可确定本研究分离的万寿菊叶斑病病原菌为万寿菊链格孢。 3 小结与讨论 植物病原菌种类繁多，形态复杂且易受环境的影响，对这些病原菌的鉴定如果仅从形态学和生理生化特征来进行，有一定的局限性。分子鉴定具有快速、简便、分辨率高等特点，并可进行多相分类，按照种系进化的关系确定精确的位置和定种，可使分类鉴定结果更加客观合理[10]。基于its序列的分子标记技术灵敏、快速、准确[11，12]。本研究通过its序列分子鉴定，结合形态观察确定分离的万寿菊叶斑病病原菌为万寿菊链格孢，为万寿菊叶斑病的综合防治和万寿菊种植业的发展提供了科学依据。 参考文献： [1] 高 洁，白庆荣，董 然，等.万寿菊细菌性叶斑病的发生与病原菌鉴定[j].吉林农业大学学报，2002，24（2）：94-96. [2] 王 龙，张霄凌，何冬云，等.万寿菊叶斑病的发生及病原鉴定[j].南方农业（园林花卉版），2007（2）：7-9. [3] 王 婷，王 龙，王生荣.万寿菊叶斑病病原鉴定及其生物学特性研究[j].甘肃农业大学学报，2010，45（3）：66-68. [4] 仇 萌，邹先彪.rdna-its序列鉴定深部真菌菌种的研究进展[j].中国真菌学杂志， 2011，6（2）：122-125 [5] hillis d m， moritz c， mable b k， et al. molecular systematics[m]. ma sunderland： sinauer associates，1996. [6] 张天宇. 中国菊科植物上链格孢属真菌的种[j]. 云南农业大学学报，2002，17（4）：320-324. [7] 沈瑞清，康萍芝，张丽荣. 链格孢属（alternaria nees）与形态相似属区别的研究进展[j]. 宁夏农林科技，2004（6）：60-61. [8] 许忠能. 生物信息学[m]. 北京：清华大学出版社，2008. [9] landeweert r， leeflang p， kuyper t w， et al. molecular identification of ectomycorrhizal mycelium in soil horizons[j]. applied and environmental microbiology，2003，69（1）：327-333. [10] 朱研研，王耀耀，付美红，等.真菌分类鉴定研究进展[j]. 河北化工，2010，33（4）：37-39. [11] 和晓娜，李书兰，李安利，等.基于its序列对秦岭4种未知真菌进行分子鉴定[j].安徽农业科学，2012，40（3）：1271-1271. [12] 高 磊，徐 彪，何 刚，等.基于its区序列的疑似野生双孢菇菌株的分子鉴定[j].江苏农业科学，2012，40（4）：31-33.