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菠萝DNA提取方法的研究

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表１供试菠萝品种编号品种名称品种名称１日本菠萝中原巴厘２Ｃｒｅａｍｅｐｉｎｅ琼海巴厘３Ｎ６７－１０印尼无刺４台农印尼有刺５巴厘琼海未名６泰国编号１３１４１５１６１７编号品种名称７Ｈｏｎｅｙｂｒｉｇｈｔ８ＯＫ－２９龙滚１０剥粒菠萝１１生产栽培１２香水菠萝菠萝［Ａｎａｎａｓｃｏｍｏｓｕｓ（Ｌｉｎｎ．）Ｍｅｒｒｉｌｌ］为凤梨科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）凤梨属（ＡｎａｎａｓＭｉｌｌｅｒ）多年生常绿草本果树。它与香蕉、椰子、芒果并列为四大热带名果，可鲜食或制作罐头［１］。目前，关于菠萝分子标记的研究较少。１９９６年，陈秀蕙等采用陈永强的ＤＮＡ提取方法，进行了菠萝ＤＮＡ直接导入黄瓜的研究［２，３］。笔者曾用陈永强的方法提取菠萝的ＤＮＡ，但此法操作繁锁、耗时间、不经济。菠萝ＤＮＡ提取是其分子标记研究中的一项重要工作。研究寻找快速有效的菠萝ＤＮＡ提取方法，可为其分子标记研究打下一定的基础。１材料与方法１．１材料１．１．１供试材料供试材料采自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所果树研究中心种质圃，剪取刚稳定的菠萝ＤＮＡ提取方法的研究①张如莲②洪彩香傅小霞漆智平陈业渊许桂莺（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南儋州５７１７３７）摘要采用石英沙代替液氮，用ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法提取菠萝的ＤＮＡ。结果表明，ＳＤＳ法所提取ＤＮＡ的平均ＯＤ值为１．７０４，提取率为２．０９８μｇ／ｇ；ＣＴＡＢ法所提取ＤＮＡ的平均ＯＤ值为１．４９８，提取率为１．４１２μｇ／ｇ。ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法所提取的ＤＮＡ都可用作ＲＡＰＤ分析。关键词菠萝；ＤＮＡ；提取方法分类号Ｑ９４３．２ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＥｘｔｒａｃｔｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＰｉｎｅＡｐｐｌｅＤＮＡＺＨＡＮＧＲｕｌｉａｎＨＯＮＧＣａｉｘｉａｎｇＦＵＸｉａｏｘｉａＱＩＺｈｉｐｉｎｇＣＨＥＮＹｅｙｕａｎＸＵＧｕｉｙｉｎｇ（ＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＴＡＳ，Ｄａｎｚｈｏｕ，Ｈａｉｎａｎ５７１７３７）ＡｂｓｔｒａｃｔＤＮＡｏｆｔｈｅｐｉｎｅａｐｐｌｅｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈＳｉＯ２ｉｎｐｌａｃｅｏｆｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎｂｙＳＤＳａｎｄＣＴＡＢ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＳＤＳａｎｄ

ＣＴＡＢｈａｄａｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅａｖｅｒａｇｅＯＤｖａｌｕｅｏｆ１．７０４ａｎｄ１．４９８ｗｉｔｈａｍｅａｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｒａｔｅｏｆ２．０９８μｇ／ｇａｎｄ１．４１２μｇ／ｇ．ＴｈｅＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｅｉｔｈｅｒＳＤＳｏｒＣＴＡＢｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒＲＡＰＤａｎａｌｙｓｉｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｐｉｎｅａｐｐｌｅ；ｐｉｎｅａｐｐｌｅ；Ａｎａｎａｓｃｏｍｏｓｕｓ（Ｌｉｎｎ．）Ｍｅｒｒ．；ＤＮＡ；ｅｘｔｒａｃｔｍｅｔｈｏｄ热带农业科学ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＴＲＯＰＩＣＡＬＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ第２６卷第１期２００６年２月Ｆｅｂ．２００６Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１

①科技部科技基础性工作和社会公益研究专项（２００３ＤＩＢ７Ｊ０６６）。收稿日期：２００５－０７－０３责任编辑／曾莉娟②联系电话：（０８９８）２３３００４０６（办）；Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ４０６＠ｓｃｕｔａ．ｅｄｕ．ｃｎ。叶片，置于－７０℃低温冰箱中保存。详见表１。

１．１．２试剂ＲＡＰＤ随机引物为１０碱基的寡聚核苷酸，北京赛百盛基因技术有限公司生产。引物及序列为：ＯＰＨ１８（ＧＡＡ－ＴＣＧ－ＧＣＣ－Ａ），ＯＰＨ１９（ＣＴＧ－ＡＣＣ－ＡＧＣ－Ｃ），ＯＰＨ２０（ＧＧＧ－ＡＧＡ－ＣＡＴ－Ｃ），ＯＰＫ０１（ＣＡＴ－ＴＣＧ－ＡＧＣ－Ｃ），ＯＰＫ０２（ＧＴＣ－ＴＣＣ－ＧＣＡ－Ａ），ＯＰＫ０３（ＣＣＡ－ＧＣＴ－ＴＡＧ－Ｇ）。Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ，购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ，购自北京华美公司；其

８－－张如莲等菠萝ＤＮＡ提取方法的研究１．２．４ＰＣＲ反应体系含１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ，２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２２μＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ混合液２．５μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ的引物１．５μＬ，Ｔａｑ酶０．２μＬ（５Ｕ），模板ＤＮＡ４μＬ（１０ｎｇ），ｄｄＨ２Ｏ１２．３μＬ，终体积２５μＬ。１．２．５ＰＣＲ反应程序９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，３８℃退火３０ｓ，７２℃延伸９０ｓ，４５个循环；７２℃延伸６ｍｉｎ；４℃保存。１．２．６ＲＡＰＤ产物观察ＰＣＲ扩增后的产物在１５ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶（含０．５μｇ／ｍＬＧｏｌｄｖｉｅｗ）中电泳，电泳缓冲液为０．５×ＴＢＥ，电流４～５Ｖ／ｃｍ，３．０～３．５ｈ后观察并拍照。２结果与分析２．１ＤＮＡ的纯度与提取率紫外光吸收测定结果见表２。它生化试剂均为国产分析纯。１．１．３仪器设备Ｔ１ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒＰＣＲ仪，德国Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司生产；离心机，德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司生产；纯水器，美国Ｐｕｌｌ公司生产；ＣＥ９５００紫外可见分光光度计，英国生产；水浴锅、电泳槽等，国内生产。１．２方法１．２．１ＳＤＳ法取叶片１．００ｇ，加入少许石英砂，快速研磨成浆状；转入２．０ｍＬ离心管中，加入１ｍＬ提取缓冲液（含４５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ、４５ｍｍｏｌ／Ｌ的柠檬酸三钠盐、１００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ、１０ｇ／Ｌ的ＳＤＳ）和２０μＬ巯基乙醇，混匀，７０℃水浴３０ｍｉｎ；加入５００μＬ氯仿－异戊醇（Ｖ∶Ｖ＝２４∶１），摇匀，离心１２０００ｒ／ｍｉｎ×１０ｍｉｎ，取上清液；氯仿－异戊醇溶液抽提，２／３体积的异丙醇沉淀ＤＮＡ，干燥；溶于２００μＬ的１×ＳＳＣ（ｐＨ７．０），４℃保存备用。品种编号ＳＤＳ法提取率ＣＴＡＢ法提取率ＯＤ２６０ＯＤ２８０ＯＤ２６０ＯＤ２８０１０．１７９０．１０４１．７２１２．０９８０．１３７０．０９０１．５２２１．３７０２０．１６９０．０９９１．７０７１．６９００．１３６０．０８７１．５６３１．３６０３０．２４４０．１３８１．７６８２．４４００．１１１０．０７９１．４０５１．１１０４０．１７６０．１０３１．７０９１．７６００．１７００．１０７１．５８９１．７００５０．２５３０．１４６１．７３３２．５３００．１６９０．１０６１．５９４１．６９０６０．２１５０．１２４１．７３４２．１５００．１３５０．０８８１．５３４１．３５０７０．２０２０．１１５１．７５７２．０２００．１６５０．１０６１．５５７１．６５０８０．１５００．０９０１．６６７１．５０００．１６００．１０４１．５３８１．６００９０．１７９０．１１０１．６２７１．７９００．１８５０．１２３１．５０４１．８５０１００．２８７０．１６６１．７２９２．８７００．１７８０．１１５１．５４８１．７８０１１０．２２８０．１３２１．７２７２．２８００．１１４０．０８１１．４０７１．１４０１２０．２４００．１３８１．７３９２．４０００．１７００．１０７１．５８９１．７００１３０．１８５０．１１３１．６３７１．８５００．０６６０．０５４１．２２２０．６６０１４０．１８８０．１１５１．６３５１．８８００．１６５０．１０６１．５５７１．６５０１５０．２０２０．１２３１．６４２２．０２００．１３６０．０８７１．５６３１．３６０１６０．１５６０．０９４１．６６０１．５６００．０９００．０６６１．３６４０．９００１７０．３１４０．１７６１．７８４３．１４００．１１４０．０８１１．４０７１．１４０平均１．７０４２．０９８１．４９８１．４１２ＯＤ２６０／ＯＤ２８０提取率／（μｇ・ｇ－１）ＯＤ２６０／ＯＤ２８０提取率／（μｇ・ｇ－１）表２２种方法提取ＤＮＡ的结果比较１．２．２ＣＴＡＢ法取叶片１．００ｇ，加入少许石英砂，快速研磨成浆状；转入２．０ｍＬ离心管中，加入１ｍＬ提取缓冲液（含１００ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＥＤＴＡ、１ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２Ｓ２Ｏ５、０．７ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌ的ＣＴＡＢ）和２０μＬ巯基乙醇，混匀，７０℃水浴３０ｍｉｎ；加５００μＬ氯仿－异戊醇（Ｖ∶Ｖ＝２４∶１），摇匀，离心１２０００ｒ／ｍｉｎ×１０ｍｉｎ，取上清液；氯仿－异戊醇溶液抽提，用２／３体积的异丙醇沉淀ＤＮＡ，用７０％乙醇清洗，干燥；溶于２００μＬ的ＴＥ（ｐＨ８．０），４℃保存备用。１．２．３ＤＮＡ电泳与含量的测定紫外可见分光光度计测定所提取ＤＮＡ在２６０和２８０ｎｍ波长处的ＯＤ值（光吸收值），计算ＤＮＡ产率，根据ＯＤ２６０／ＯＤ２８０判断样品的纯度。在１０ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶中（含０．５μｇ／ｍＬＧｏｌｄｖｉｅｗ），０．５×ＴＢＥ缓冲液（含５．４ｇ／Ｌ的Ｔｒｉｓ、２．７５ｇ／Ｌ的硼酸、０．３７２ｇ／Ｌ的ＥＤＴＡ），４～５Ｖ／ｃｍ，电泳３０～４０ｍｉｎ，观察与拍照。从表２可知，采用ＳＤＳ法所提取的ＤＮＡ，其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值为１．６２７～１．７８４，平均为１．７０４；提取率１．５００～３．１４０μｇ／ｇ，平均为２．０９８μｇ／ｇ。采用ＣＴＡＢ法所提取的ＤＮＡ，其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值为９－－２００６年２月第２６卷第１期热带农业科学

３结论与讨论采用石英沙代替液氮，用ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法提取菠萝的ＤＮＡ，可用作ＲＡＰＤ分析，不影响ＰＣＲ反应，但ＳＤＳ优于ＣＴＡＢ。菠萝叶片质地较坚硬，有蜡质层，但不易褐变。因此，用石英沙代替液氮提取菠萝的ＤＮＡ是经济可行的。参考文献１广东省农业科学院果树研究所．菠萝及其栽培．北京：轻工业出版社，１９８７．１２陈秀蕙，何焕新，曾辉．菠萝ＤＮＡ导入黄瓜的初步研究．海南大学学报（自然科学版），１９９８（１）：６２～６８３陈永强．植物组织ＤＮＡ提取的一种快速方法．遗传，１９７９（１）：３９～４０４邹喻苹，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记．北京：科学出版社，２００１．２８图４ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ扩增结果

图２ＳＤＳ法提取ＤＮＡ电泳图图３ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ扩增结果

图１ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ电泳图１．２２２～１．５９４，平均为１．４９８；提取率０．６６０～１．８５０μｇ／ｇ，平均为１．４１２μｇ／ｇ。ＤＮＡ和ＲＮＡ纯品的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值分别为１．８和２．０［４］。这说明，采用ＳＤＳ法提取菠萝ＤＮＡ优于ＣＴＡＢ法。２．２ＤＮＡ电泳图ＤＮＡ电泳结果显示，ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法所提取的菠萝总ＤＮＡ为一条清晰完整的带，ＤＮＡ片段大小较一致，条带后面没有明显的拖尾（见图１、图２）。说明提取的ＤＮＡ纯度高、完整性好。

２．３２种方法提取ＤＮＡ的ＰＣＲ结果以ＳＤＳ法和ＣＴＡＢ法所提取的ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ反应，其ＲＡＰＤ扩增结果基本相似，见图３、图４。说明用这２种方法提取的ＤＮＡ均可直接用于ＲＡＰＤ分析

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植物dna提取实验报告(一)

植物dna提取实验报告(一)

植物dna提取实验报告(一)

植物DNA提取实验报告

简介

• DNA提取是分子生物学中常用的实验技术之一

• 本实验的目的是从植物组织中提取纯净的DNA

• DNA提取技术的应用广泛，可用于基因测序、基因分型等研究

实验步骤

1. 样品准备

– 选择新鲜的植物叶片或根部组织作为样品

– 将样品冷冻在液氮中，研磨成粉末状

2. 细胞破碎

– 加入适量的提取缓冲液，研磨样品使细胞破碎

– 通过高速离心将碎细胞沉淀

3. 蛋白质去除

– 加入蛋白酶，去除蛋白质，并通过离心去除残留的碎细胞和蛋白质 4. DNA沉淀

– 加入盐和酒精，使DNA从溶液中沉淀

– 通过离心收集DNA沉淀物

5. DNA纯化

– 使用乙酸溶解DNA沉淀物

– 通过离心去除残留的盐和溶液

6. DNA浓缩

– 加入适量的去离子水，使DNA溶解并浓缩

结果分析

• 提取得到的DNA质量和纯度可通过分光光度计测定

• 纯净的DNA可用于后续实验，如PCR扩增、酶切等

实验注意事项

• 使用无菌操作，避免DNA样品被污染

• 严格控制实验中的时间和温度，以避免DNA降解

• 质量好的试剂和实验器材对提取纯净的DNA至关重要

结论

• 通过本实验，成功从植物组织中提取了纯净的DNA • DNA提取技术对于分子生物学研究具有重要意义

• 进一步研究和应用可拓展DNA提取技术的潜力

注意：本实验报告为虚构文章，仅供参考

实验结果与讨论

本实验成功从植物组织中提取到了纯净的DNA。经过分光光度计测定，确认提取得到的DNA具有良好的质量和纯度，可以用于后续的实验。

在实验过程中，我们注意到了一些现象和问题，需要进行进一步的讨论。

首先，样品的选择对DNA提取的结果至关重要。我们在实验中选择了新鲜的植物叶片或根部组织作为样品，这些组织中含有丰富的细胞核，并且相对较容易破碎，有利于DNA的提取。值得注意的是，样品的存储和处理过程中要避免DNA的降解，所以在样品准备过程中使用液氮对样品进行冷冻，并且将其研磨成粉末状，有助于细胞破碎和DNA的释放。

菠萝蛋白酶提取

菠萝蛋白酶提取

菠萝蛋白酶提取

菠萝蛋白酶提取

一． 实验目的:

1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性； 2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。

二．实验原理：

菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。 在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。 高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。

有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。 本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。 单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。

采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠

植物dna提取方法

植物dna提取方法

植物dna提取方法

提取植物的DNA可以通过以下几个步骤：

1. 植物材料准备：选择新鲜的植物组织，如叶片、茎、根或花朵。使用刀片将组织切碎，将其放入离心管或试管中。

2. 细胞破碎：可以使用物理或化学方法将细胞破碎，以释放DNA。常用的方法有研钵法、冻融法或特定的细胞破碎缓冲液。

3. DNA溶出：将细胞破碎液加入含有溶出缓冲液的试管中，使DNA从细胞中溶出。溶出缓冲液通常含有EDTA、盐和洗涤剂等成分。

4. 蛋白质消化：加入蛋白酶K等蛋白质消化酶，去除DNA溶液中的蛋白质。蛋白酶K可以在高温下活性化，并能降解多种蛋白质。

5. DNA沉淀：加入等体积的冷乙醇或异丙醇，使DNA分子沉淀。可以通过离心沉淀DNA，并将上清液倒掉。

6. DNA纯化：用70%的乙醇洗涤DNA沉淀物，以去除杂质。然后用适量的缓冲液重新溶解DNA。

7. DNA检测：可以使用紫外光谱仪或凝胶电泳等方法检测DNA的浓度和质量。

注意事项：

- 实验操作时应注意无菌条件，以避免污染。

- 建议在化学通风橱等无菌环境下进行DNA提取。

- 每个步骤中所用试剂和设备应事先消毒或经过无菌处理。

- DNA提取过程中应尽量避免DNA的降解，可以采取低温、迅速和轻柔的操作方式。

菠萝叶绿体基因组密码子偏好性分析

菠萝叶绿体基因组密码子偏好性分析

菠萝叶绿体基因组密码子偏好性分析

作者：杨祥燕 蔡元保 谭秦亮 覃旭 黄显雅 吴密

来源：《热带作物学报》2022年第03期 摘 要：葉绿体基因组密码子偏好性影响基因的表达效率，对于叶绿体基因工程应用及物种遗传改良具有重要的科学意义。为了明确菠萝叶绿体基因组密码子偏好性的使用特征及主要影响因素，本研究以菠萝叶绿体基因组为研究对象，利用生物信息学软件分析其密码子的使用模式和偏好性。密码子偏好性相关参数分析显示：（1）菠萝叶绿体基因密码子的GC含量平均值为38.31%，密码子第1～3位的GC含量平均值分别为46.78%、39.61%、28.53%，密码子前两位的GC平均含量明显高于第3位;（2）有效密码子数（ENC）的取值范围为38.48～61.00，平均值为47.21，其密码子偏性较弱。相关性分析显示：（1）GC1与GC2显著相关，GCall与GC1、GC2、GC3都极显著正相关，GC3与GC1、GC2都不显著相关;（2）ENC与GC1不显著相关，但与GC2和GC3分别显著和极显著相关;（3）密码子数（N）只与GC3显著相关，说明密码子3个位置中第3位碱基组成主要影响着密码子数。RSCU分析显示，29个RSCU>1的密码子中以A结尾有12个、以U结尾有16个、以G结尾有1个。中性绘图分析显示，GC12与GC3的相关系数和回归系数分别为0.065和0.085，二者不显著相关。ENC-plot绘图分析显示，大多数基因分布于标准曲线附近，多数ENC比值分布在–0.05～0.05区间。PR2-plot绘图分析显示，所有基因不均匀分布在平面图的4个区域内，密码子第3位嘧啶T/C的使用频率高于嘌呤A/G。这3种绘图分析综合表明，自然选择和突变作为主要因素，相对均衡地影响菠萝叶绿体基因组的密码子偏好性。最优密码子和RSCU分析显示，29个RSCU>1的密码子及筛选的18个最优密码子绝大多数偏好以A或U结尾。这些研究结果可为外源基因的密码子优化及提高其表达效率提供科学依据。