锰过氧化物酶的表达和白腐菌降解木质素机制中的锰调节
FREDERIC H. PERIE AND MICHAEL H. GOLD
俄勒冈科学技术研究所,化学和生物科学系
木质素是一种复杂的、 异质的， 分子中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的高聚物。占植物纤维组分的20%~30%。白腐担子真菌主要是负责引发木材分解木质素。在白腐菌降解木质素培养条件下，研究得最透彻的是白腐担子菌，它可以产生两种胞外酶，分别是锰过氧化物酶（MnP）和木素过氧化物酶 （LiP），
沿同一H202生成系统，构成木质素降解系统的主要组成部分。白腐真菌分泌过氧化物酶和氧化酶显然是独特的组合。云芝 和Phlebia 辐射 每产生一个或多个漆酶在。 平菇 sajor-凤尾菇分泌一种芳基醇氧化酶（5），一 漆酶， 和几个过氧化物酶（13）。 Bjerkendera夜蛾 分泌一种芳基醇氧化酶（29），和Rigidoporus木质 SUS 显然分泌漆酶和锰过氧化物酶一（14）。 以前 报告显示，Dichomitus squalens （猪苓 anceps） 下 各种条件，有效地 降级 自然 从白桦木质素 （2），白杨（30），和云杉 木（8）和从小麦，大麦，和葡萄吸管（43）。 至 扩大 我们的 的木质素降解酶的理解英文内容- orated 各 白腐真菌，我们已进行了 任务 确定 和 特征 外OXI- 的酶与格 D。 squalens及其调控。 在这种 报告中，我们探讨D的能力squalens降解 木质素合成 在各种 条件。
此外，我们 演示 该木质素的条件下这种微生物 表达漆酶（34）和一个锰过氧化物酶和表达 的 锰过氧化物酶 是由锰监管。 与此相反，既不外 唇也不藜芦醇氧化酶的活性在检测
文化 根据各种各样的条件下生长。 材料与方法 有机体。 Dichomitus squalens（喀斯特）里德（猪苓 anceps派克）（CBS 432.34）由F. Zadrazil获得 和 维持 在马铃薯葡萄糖，酵母提取物琼脂斜面。
菌丝夹 连接 为 很容易观察到，indicat - ING的分离物保持在dikaryotic状态 （12， 35）。
培养条件。 生物体 为 长大的 在 28℃， 250毫升的锥形烧瓶中任一100毫升振摇培养
（150转，2.5厘米半径）或20毫升静止培养， 如 表示。 文化 为 在空气下培养6天，然后 这一次，他们被清洗每三天用100％ 氧气。 多种生长介质中使用了我们的 AT- 试探以识别胞外过氧化物酶和氧化酶 由D. squalens生产。 生物体常规生长 在摇晃的文化中高碳，低氮（HCLN） 培养基（2％葡萄糖，1.2mM的酒石酸铵）含有- ING 3 FIM锰如前所述（27） 或 在 一 含下列成分的合成培养基 （每 升）：20克葡萄糖，2.5克L-天冬酰胺，0.15克的 L- 苯丙氨酸，将0.03g腺嘌呤，0.1毫克硫胺素，1g的 KH 2 PO 4，0.1g的Na2PO4，0.5g的MgSO 4干燥7H20，将10mg的 的FeSO4·7H2O，5毫克硫酸铜5H20，以及16毫克 硫酸锰H 2 O，以及0.01％的吐温80。 在具体实验中，在最后的锰浓度 上述培养基调整为0，1，2，5，10，和100 ，嗯。 此外，藜芦醇（6毫摩尔），苯甲醇（6 毫米），或愈创木基木质素dehydropolymerizate（DHP）（2毫克） 为 附加的 至 以上含10，恩所描述的媒体 锰， 作为 唇的潜在诱导剂（25）。 其他媒体中使用了固定的文化 尝试 至 检测LiP的活性。 几种不同的无机 盐和维生素的食谱（10，21，27）一起被用来 与以下介质：HCLN，2％葡萄糖和1.2毫 酒石酸铵;高碳，高氮气（HCHN），2％ 葡萄糖和 12 毫酒石酸铵，低碳，高 氮（LCHN），0.2％ 葡萄糖和12 mM甲酸铵 酒石酸盐，低 碳， 低氮（LCLN），0.2％葡萄糖 和 1.2毫米 酒石酸铵。 含木质纤维素的媒体。 的生物体是尽头 下应该用针戳穿 静止的 桦树或云杉木屑条件 或 麦地 稻草 用水饱和。 这种介质 不 补充有任何额外的营养物。 二 套 的 静止的 文化 为 编写每个媒体 （HCLN，HCHN，LCHN和LCLN，将含有脱
划线盐[27]），以及与桦木木屑培养基。 第一组是如下描述的，第二组包含 藜芦醇（6毫米）。
酶测定。 除非另有说明，酶原样 说是在1毫升的反应混合物在30℃下进行 运用 真菌培养物的细胞外介质作为 酶源。 漆酶的活性测定通过监测氧化- 化 2,6 -二甲氧基苯酚在A469。 反应混合物 载 2,6 -二甲氧基苯酚（0.2毫米）和酶20 毫琥珀酸盐缓冲液（pH 3.0）。
锰过氧化物酶 活动 通过监测地层测 的 一 锰（Ⅲ） -丙二酸二甲酯在A270复合物（41）。
反应混合 Tures的含有硫酸锰（0.2毫米），H202（0.1毫米），并 酶在50mM丙二酸钠（pH
4.5）中。 细胞信封绑定 锰过氧化物酶测定是通过监测 氧化OF2 -1,6 -二甲氧基苯酚 在A469。 反应混合物 载 2,6 -二甲氧基苯酚（0.2毫米），H202（0.1毫米）， 硫酸锰 （0.2 毫米）， 和细胞膜的酶组分（10毫克） 在 50mM的丙二酸钠（pH 4.5）中。 在反应 培养 为在28℃，之后细胞碎片为1小时 离心3000除去 x G和的的A469 上清液 为 测量。 完整的细胞结合 锰过氧化物酶是由测量 暂停 一 菌丝 沉淀在含2,6的反应混合物- 二甲氧基苯酚 （0.2 毫米）， H202（0.1毫米），和硫酸锰（0.2 毫摩尔）在50mM丙二酸钠（pH 4.5）中。 在反应 温育15分钟，之后将菌丝体是 通过过滤除去，将滤液的A469是MEA- 变身。
LiP的 活动 通过监测的氧化测 在A310藜芦醇（18，26）。 胞外LiP的活性 为 还通过监控一个二芳基的氧化测定 丙烷作为A310 先前描述 （28）。 反应 所含混合物 藜芦醇（2.5
毫米）， H202（0.1 毫米）， 和酶在20mM琥珀酸钠缓冲液（pH 3.0）。 芳基醇氧化酶的活性 通过监控测量 该 氧化 藜芦或茴香醇在A310或 A290， 分别为， 如先前所述（5，29）。
反应混合 Tures的 含有藜芦或 茴香 酒精（2.5 毫米） 在20mM 钠 琥珀酸 （pH3至5.5），或在20mM钠磷酸 phate（pH值为6〜7）。 细胞膜酶制剂。 文化 为 过滤 用Miracloth，
将细胞用冰冷 0.05％ 氯化钠。 细胞 （0.5 G） 为 冻结的 在 液氮 和 地面 在沙 一 研钵和杵。 一 毫升 的 10 毫 钠 磷酸盐（pH 7.0）中 含 甘油 （10％） 和苯甲基磺酰 氟化物 （0.5毫米）（缓冲液A） 为 补充说， 和 提取物 搅拌5分钟 在 4°C。 之后， 沙
为 删除 通过沉淀， 该 提取物 离心- fuged 在 3,000 x 克为10分钟;的 丸 为 在缓冲液 A和 recentrifuged 在 3,000 x 克 最后 颗粒 为 暂停 在50mM 丙二酸钠 （pH值4.5）。 显微镜 检查显示 这些细胞 为 均匀 破碎。 '4 C-DHP 降解。 2-14C-侧链，14C-甲氧基- ， 和
U-14C环标记 愈创木 DHP类是 准备 从 标记 松柏 醇前体 如 先前描述 （17）。 该 具体活动 每个基片的 为 调整后 至 3 x 105 CPM /毫克与未标记的愈创木DHP。 放射性标记
基板 （50,000 每CPM 长颈瓶 25，UL 的二甲基甲 酰胺） 为 附加的 至 每 激动 文化 上
第三 日 的 增长。 进化 14CO2 为 测量每三 天 如 如前所述（17，27）。 铵离子， 氨基 酸， 和 葡萄糖测定。 先 至 分析，样品 细胞外液 为
图。 1。 矿化 的 通过'4 C标记的二氢吡啶 D。 squalens。 （一） 时间 课程 供的演变 14CO2
从甲氧基（A） 侧 链（O）和环标记（A）DHP 在 HCLN文化。 时间 的菌丝体干重的依赖性（0）和氮气消耗（0） 也同时显示。 （二）时间 课程 供的演变 1'4CO2 从 甲氧基（A）侧链（O）和环标记（A）DHP在ASN-苯丙氨酸 文化。 时间的菌丝体干重的依赖（0），天冬酰胺 （V）中， 和苯丙氨酸 （0） 浓度也同时显示。 惊天文化 为 用100％定期吹扫 02，
并演变'4二氧化碳 为 测量 如 在所描述的 文本。 超滤 通过 一个 的Amicon Diaflo YCO5
膜 （500分子量截止）。 的浓度 弹药- 鎓 离子 在 HCLN 文化 为 通过监控 该 indophe-
酚蓝法 （20）。 的氨基酸的总浓度 在天冬酰胺-苯丙氨酸培养物的培养基中 为 监控 通过
该 茚三酮 方法 （42）。 天冬酰胺的个别浓度 和苯丙氨酸 为 测量 通过高效液相 色度
tography 上一个 C8 反相 柱 （贝克曼 超 球体， 5 时） 衍生化后 同 邻苯二甲醛（3）
通过使用 等度洗脱，用甲醇-水 （7:3）。 免费 葡萄糖 在细胞外液 为 决心 通过 该 苯酚-硫酸 酸法 （1）。 结果 一时间 课程 对DHP 降解 在 HCLN 发抖 D的文化 squalens 显示 在 图。 LA。 在这些 的条件下， D。 squalens 矿化的40〜50％的各 基材。 该 残余铵的浓度和 发展 曲线 为 生物 在这些条件下 有 也示于 图。 LA。 该 干重 的 菌丝体
在
增加 直到 20日，在这之后 一次下降 显著， 大概 作为 结果 自溶。 免费 氨氮浓度在HCLN 文化 下降 RAP- 懒惰地 以上 第一 7 天 不 一天后，检测 10。 一 时间 课程 为
DHP 降解 在ASN-苯丙氨酸文化 是 所示 图。 磅。 比较 结果 从 该 二 培养条件证明 那
D。 squalens 为 能 至 降级 DHP在任何媒介，但该 环 和侧面 链标记的二氢吡啶 为 降级 更多 广泛 在 HCLN媒体。 与此相反，在ASN-苯丙氨酸 支持媒体 一 相当 快 率 和 程度 的生长。 该maxi- 沉默 实现菌丝体干重 在ASN-苯丙氨酸 中 为 约 150％ 在 HCLN
媒介。 D。 squalens 还 降级 侧链标记 在DHP HCHN文化 （数据 不 示出）。 该 程度 的
侧 链标记 DHP 降解 在HCHN 文化 为 33％和50％的 那 实现了HCLN和 ASN-苯丙氨酸
文化，分 别。 一 时间 课程 （天 3 通过对细胞外30日） 锰过氧化物酶 和 在HCLN摇晃漆酶活性 文化 含 3 ，嗯 锰 是 所示 图。 2A。 文化 在成长 由于没有 锰有 无 锰过氧化物酶检测 活动 通 出 该 课程 的 该 实验中， 而在 文化 含 锰， 可溶性胞锰过氧化物酶 活动 为 第一 检测 上 5天， 达 一 最大 上 18天， 和 始终坚持 该 课程 的
该 实验。 在 CON- 相比之下，外 漆酶活性出现 上 日 3 达 一 最大 上 9天， 此后将其 慢慢地 下降。 此外， 该 表达 漆酶 活动 不 依赖的 上 存在 的 锰。 因为 可溶性 外
锰过氧化物酶 活动 为 只有在第一次检测 5 天 ofgrowth在HCLN培养，细胞 信封绑定 锰过氧化物酶 活动 为 还检测。 如所示 图。 3A， 细胞 ENVE- 诺普-绑定 锰过氧化物酶 活动 为 检测 上 日 3 增加显著超越日 10。 外观 的 此单元格 信封结合活性 还 为 完全依赖新生 凹痕 上 该 存在 的 MN在培养基中 （数据 不 示出）。 外观 的 细胞 信封结合活性 相关 以及与锰过氧化物酶 活动 在完整的细胞法检测。 一 时间 课程 为 细胞外的MnP和漆酶 活动 在 ASN-苯丙氨酸培养物生长在存在 或 缺席 的 50 ，M Mn是 显示
在 图。 2B。 同样， 在缺乏生长的培养 的 锰展出 无 检测到细胞外的MnP 活动 始终 该
课程 的 该 实验。 与此相反，在 文化 在存在下生长 的Mn， 锰过氧化物酶的细胞外 活动 为 第一 检测 上 日 3 达 一 第一 最大 在 日 12。 后 一 简要 下降， 锰过氧化物酶 活动 然后 稳步提高 直到 约24天， 之后， 时间 它仍然 不变 通过一天 30。 同样，
的表达， 锡永oflaccase 活动 不 依赖的 上 存在 的 MN在ASN-苯丙氨酸的文化。 非锰依赖 漆酶 活动 达 一 最大 上 约一天 10，然后 慢慢地 下降。 实现漆酶的活性水平 在
ASN-苯丙氨酸文化 （图2b） 为 始终 在 至少五年 至 六倍 大于达到的HCLN培养 （图
2A）。 在 对比 至 所述的结果 以上， 既不是LiP的 也不 芳 醇氧化酶 活动 为 在extracellu检测的 拉尔 中等 HCLN 或 ASN-苯丙氨酸摇动或固定 培养物温育在存在OF0，1，2，5，10， 或100 ，嗯 硫酸锰。 此外， 既没有外LiP的，也不芳 醇氧化酶 活动 为 在检测 发抖 或 站 进制 含HCHN，LCHN，文化 LCLN，或 木质纤维素 介质与任何 假定 诱导剂 说明 在 物料 与方法。 的存在的影响 锰对 该 降解 的 14C标记的 DHP示于 图。
3。 一 时间 课程 为 降解 的 14C-环， 端 链， 和 -甲氧基-标记的
图。 2。 的影响 锰 上 该 细胞外表达 锰过氧化物酶 和 漆酶的活性。 可溶性 锰过氧化物酶 活动 从文化 在生长 存在 （0） 并没有 （0） 的Mn，水溶性漆酶 活动 从 文化 在成长 该 存在 （U） 并没有 （O） 的Mn，和细胞 信封绑定 锰过氧化物酶 活动 从文化
长大的 在 存在 （一） 锰 为 决心 如 在描述 该 文本。 发抖 文化 为 长大的 在HCLN（一） 和 ASN-苯丙氨酸（二）媒体。 DHP 在HCLN文化 含 3，嗯 锰 示于 图。 3A。 所有这三个标记二氢吡啶 为 广泛退化 以上 30 天 该 实验 在 含Mn- 文化。 该 总和 的
该 14CO2 30后的演变 天 是40至60岁 50％ 的介绍了每个 的 的底物。 在 CON- 相比之下，在培养物中生长在无 的Mn， 所有这三个 标记 二氢吡啶 为 降级 很 慢慢地， 与小于 标记的二氢吡啶的10％ 存在 矿化 中 该 30天的实验。 一 时间进程 为 该 进化
的 14CO2 从标 在天冬酰胺-苯丙氨酸文化DHP类示于 图。 图3b。 在ASN-苯丙氨酸 中等， 该 降解 两者的 14C-环 和方 链 DHP标记也 为 依赖的 上存在 的 锰 培养基中。
对于这两个DHP类，的程度 14CO2 进化在没有 Mn为 小于 15％ 那 进化 在Mn的存在
