锰过氧化物酶的表达和白腐菌降解木质素机制中的锰调节
FREDERIC H. PERIE AND MICHAEL H. GOLD
俄勒冈科学技术研究所,化学和生物科学系
木质素是一种复杂的、异质的，
占植物纤维组分的20%~30%。
白腐担子真菌主要是负责引发木材分解木质素。
在白腐菌降解木质素培养条件下，研究得最透彻的是白腐担子菌，它可以产生两种胞外酶，分别是锰过氧化物酶（MnP）和木素过氧化物酶（LiP），沿同一H202生成系统，构成木质素降解系统的主要组成部分。
白腐真菌分泌过氧化物酶和氧化酶显然是独特的组合。
云芝和Phlebia 辐射每产生一个或多个漆酶在。
平菇sajor-凤尾菇分泌一种芳基醇氧化酶（5），一漆酶，和几个过氧化物酶（13）。
Bjerkendera夜蛾分泌一种芳基醇氧化酶（29），和Rigidoporus木质SUS 显然分泌漆酶和锰过氧化物酶一（14）。
以前报告显示，Dichomitus squalens （猪苓anceps）下各种条件，有效地降级自然从白桦木质素（2），白杨（30），和云杉木（8）和从小麦，大麦，和葡萄吸管（43）。
至扩大我们的的木质素降解酶的理解英文内容- orated 各白腐真菌，我们已进行了任务确定和特征外OXI- 的酶与格D。
squalens 及其调控。
在这种报告中，我们探讨D的能力squalens降解木质素合成在各种条件。
此外，我们演示该木质素的条件下这种微生物表达漆酶（34）和一个锰过氧化物酶和表达的锰过氧化物酶是由锰监管。
与此相反，既不外唇也不藜芦醇氧化酶的活性在检测文化根据各种各样的条件下生长。
材料与方法有机体。
Dichomitus squalens（喀斯特）里德（猪苓anceps派克）（CBS 432.34）由F. Zadrazil获得和维持在马铃薯葡萄糖，酵母提取物琼脂斜面。
菌丝夹连接为很容易观察到，indicat - ING的分离物保持在dikaryotic状态（12，35）。
培养条件。
生物体为长大的在28℃，250毫升的锥形烧瓶中任一100毫升振摇培养（150转，2.5厘米半径）或20毫升静止培养，如表示。
文化为在空气下培养6天，然后这一次，他们被清洗每三天用100％氧气。
多种生长介质中使用了我们的AT- 试探以识别胞外过氧化物酶和氧化酶由D. squalens生产。
生物体常规生长在摇晃的文化中高碳，低氮（HCLN）培养基（2％葡萄糖，1.2mM的酒石酸铵）含有- ING 3 FIM锰如前所述（27）或在一含下列成分的合成培养基（每升）：20克葡萄糖，2.5克L-天冬酰胺，0.15克的L- 苯丙氨酸，将0.03g腺嘌呤，0.1毫克硫胺素，1g的KH 2 PO 4，0.1g的Na2PO4，0.5g的MgSO 4干燥7H20，将10mg的的FeSO4·7H2O，5毫克硫酸铜5H20，以及16毫克硫酸锰H 2 O，以及0.01％的吐温80。
在具体实验中，在最后的锰浓度上述培养基调整为0，1，2，5，10，和100 ，嗯。
此外，藜芦醇（6毫摩尔），苯甲醇（6 毫米），或愈创木基木质素dehydropolymerizate（DHP）（2毫克）为附加的至以上含10，恩所描述的媒体锰，作为唇的潜在诱导剂（25）。
其他媒体中使用了固定的文化尝试至检测LiP的活性。
几种不同的无机盐和维生素的食谱（10，21，27）一起被用来与以下介质：HCLN，2％葡萄糖和1.2毫酒石酸铵;高碳，高氮气（HCHN），2％葡萄糖和12 毫酒石酸铵，低碳，高氮（LCHN），0.2％葡萄糖和12 mM甲酸铵酒石酸盐，低碳，低氮（LCLN），0.2％葡萄糖和1.2毫米酒石酸铵。
含木质纤维素的媒体。
的生物体是尽头下应该用针戳穿静止的桦树或云杉木屑条件或麦地稻草用水饱和。
这种介质不补充有任何额外的营养物。
二套的静止的文化为编写每个媒体（HCLN，HCHN，LCHN和LCLN，将含有脱
划线盐[27]），以及与桦木木屑培养基。
第一组是如下描述的，第二组包含藜芦醇（6毫米）。
酶测定。
除非另有说明，酶原样说是在1毫升的反应混合物在30℃下进行运用真菌培
养物的细胞外介质作为酶源。
漆酶的活性测定通过监测氧化- 化2,6 -二甲氧基苯酚在A469。
反应混合物载2,6 -二甲氧基苯酚（0.2毫米）和酶20 毫琥珀酸盐缓冲液（pH 3.0）。
锰过氧化物酶活动通过监测地层测的一锰（Ⅲ）-丙二酸二甲酯在A270复合物（41）。
反应混合Tures的含有硫酸锰（0.2毫米），H202（0.1毫米），并酶在50mM丙二酸钠（pH 4.5）中。
细胞信封绑定锰过氧化物酶测定是通过监测氧化OF2 -1,6 -二甲氧基苯酚在A469。
反应混合物载2,6 -二甲氧基苯酚（0.2毫米），H202（0.1毫米），硫酸锰（0.2 毫米），和细胞膜的酶组分（10毫克）在50mM的丙二酸钠（pH 4.5）中。
在反应培养为在28℃，之后细胞碎片为1小时离心3000除去x G和的的A469 上清液为测量。
完整的细胞结合锰过氧化物酶是由测量暂停一菌丝沉淀在含2,6的反应混合物- 二甲氧基苯酚（0.2 毫米），H202（0.1毫米），和硫酸锰（0.2 毫摩尔）在50mM丙二酸钠（pH 4.5）中。
在反应温育15分钟，之后将菌丝体是通过过滤除去，将滤液的A469是MEA- 变身。
LiP的活动通过监测的氧化测在A310藜芦醇（18，26）。
胞外LiP的活性为还通过监控一个二芳基的氧化测定丙烷作为A310 先前描述（28）。
反应所含混合物藜芦醇（2.5 毫米），H202（0.1 毫米），和酶在20mM琥珀酸钠缓冲液（pH 3.0）。
芳基醇氧化酶的活性通过监控测量该氧化藜芦或茴香醇在A310或A290，分别为，如先前所述（5，29）。
反应混合Tures的含有藜芦或茴香酒精（2.5 毫米）在20mM 钠琥珀酸（pH3至5.5），或在20mM钠磷酸phate（pH值为6〜7）。
细胞膜酶制剂。
文化为过滤用Miracloth，将细胞用冰冷0.05％氯化钠。
细胞（0.5 G）为冻结的在液氮和地面在沙一研钵和杵。
一毫升的10 毫钠磷酸盐（pH 7.0）中含甘油（10％）和苯甲基磺酰氟化物（0.5毫米）（缓冲液A）为补充说，和提取物搅拌5分钟在4°C。
之后，沙为删除通过沉淀，该提取物离心- fuged 在3,000 x 克为10分钟;的丸为在缓冲液A 和recentrifuged 在3,000 x 克最后颗粒为暂停在50mM 丙二酸钠（pH值4.5）。
显微镜检查显示这些细胞为均匀破碎。
'4 C-DHP 降解。
2-14C-侧链，14C-甲氧基- ，和U-14C环标记愈创木DHP类是准备从标记松柏醇前体如先前描述（17）。
该具体活动每个基片的为调整后至3 x 105 CPM /毫克与未标记的愈创木DHP。
放射性标记基板（50,000 每CPM 长颈瓶25，UL 的二甲基甲酰胺）为附加的至每激动文化上第三日的增长。
进化14CO2 为测量每三天如如前所述（17，27）。
铵离子，氨基酸，和葡萄糖测定。
先至分析，样品细胞外液为
图。
1。
矿化的通过'4 C标记的二氢吡啶D。
squalens。
（一）时间课程供的演变14CO2 从甲氧基（A）侧链（O）和环标记（A）DHP 在HCLN文化。
时间的菌丝体干重的依赖性（0）和氮气消耗（0）也同时显示。
（二）时间课程供的演变1'4CO2 从甲氧基（A）侧链（O）和环标记（A）DHP在ASN-苯丙氨酸文化。
时间的菌丝体干重的依赖（0），天冬酰胺（V）中，和苯丙氨酸（0）浓度也同时显示。
惊天文化为用100％定期吹扫02，并演变'4二氧化碳为测量如在所描述的文本。
超滤通过一个的Amicon Diaflo YCO5 膜（500分子量截止）。
的浓度弹药- 鎓离子在HCLN 文化为通过监控该indophe- 酚蓝法（20）。
的氨基酸的总浓度在天冬酰胺-苯丙氨酸培养物的培养基中为监控通过该茚三酮方法（42）。
天冬酰胺的个别浓度和苯丙氨酸为测量通过高效液相色度tography 上一个C8 反相柱（贝克曼超球体，5 时）衍生化后同邻苯二甲醛（3）通过使用等度洗脱，用甲醇-水（7:3）。
免费葡萄糖在细胞外液为决心通过该苯酚-硫酸酸法（1）。
结果一时间课程对DHP 降解在HCLN 发抖D的文化squalens 显示在图。
LA。
在这些的条件下，D。
squalens 矿化的40〜50％的各基材。
该残余铵的浓度和发展曲线为生物在这些条件下有也示于图。
LA。
该干重的菌丝体在
增加直到20日，在这之后一次下降显著，大概作为结果自溶。
免费氨氮浓度在
HCLN 文化下降RAP- 懒惰地以上第一7 天不一天后，检测10。
一时间课程为DHP 降解在ASN-苯丙氨酸文化是所示图。
磅。
比较结果从该二培养条件证明那D。
squalens 为能至降级DHP在任何媒介，但该环和侧面链标记的二氢吡啶为降级更多广泛在HCLN媒体。
与此相反，在ASN-苯丙氨酸支持媒体一相当快率和程度的生长。
该maxi- 沉默实现菌丝体干重在ASN-苯丙氨酸中为约150％在HCLN 媒介。
D。
squalens 还降级侧链标记在DHP HCHN文化（数据不示出）。
该程度的侧链标记DHP 降解在HCHN 文化为33％和50％的那实现了HCLN和ASN-苯丙氨酸文化，分别。
一时间课程（天3 通过对细胞外30日）锰过氧化物酶和在HCLN摇晃漆酶活性文化含 3 ，嗯锰是所示图。
2A。
文化在成长由于没有锰有无锰过氧化物酶检测活动通出该课程的该实验中，而在文化含锰，可溶性胞锰过氧化物酶活动为第一检测上5天，达一最大上18天，和始终坚持该课程的该实验。
在CON- 相比之下，外漆酶活性出现上日3 达一最大上9天，此后将其慢慢地下降。
此外，该表达漆酶活动不依赖的上存在的锰。
因为可溶性外锰过氧化物酶活动为只有在第一次检测5 天ofgrowth在HCLN培养，细胞信封绑定锰过氧化物酶活动为还检测。
如所示图。
3A，细胞ENVE- 诺普-绑定锰过氧化物酶活动为检测上日3 增加显著超越日10。
外观的此单元格信封结合活性还为完全依赖新生凹痕上该存在的MN在培养基中（数据不示出）。
外观的细胞信封结合活性相关以及与锰过氧化物酶活动在完整的细胞法检测。
一时间课程为细胞外的MnP和漆酶活动在ASN-苯丙氨酸培养物生长在存在或缺席的50 ，M Mn是显示在图。
2B。
同样，在缺乏生长的培养的锰展出无检测到细胞外的MnP 活动始终该课程的该实验。
与此相反，在文化在存在下生长的Mn，锰过氧化物酶的细胞外活动为第一检测上日3 达一第一最大在日12。
后一简要下降，锰过氧化物酶活动然后稳步提高直到约24天，之后，时间它仍然不变通过一天30。
同样，的表达，锡永oflaccase 活动不依赖的上存在的MN在ASN-苯丙氨酸的文化。
非锰依赖漆酶活动达一最大上约一天10，然后慢慢地下降。
实现漆酶的活性水平在ASN-苯丙氨酸文化（图2b）为始终在至少五年至六倍大于达到的HCLN培养（图2A）。
在对比至所述的结果以上，既不是LiP的也不芳醇氧化酶活动为在extracellu检测的拉尔中等HCLN 或ASN-苯丙氨酸摇动或固定培养物温育在存在OF0，1，2，5，10，或100 ，嗯硫酸锰。
此外，既没有外LiP的，也不芳醇氧化酶活动为在检测发抖或站进制含HCHN，LCHN，文化LCLN，或木质纤维素介质与任何假定诱导剂说明在物料与方法。
的存在的影响锰对该降解的14C标记的DHP示于图。
3。
一时间课程为降解的14C-环，端链，和-甲氧基-标记的
图。
2。
的影响锰上该细胞外表达锰过氧化物酶和漆酶的活性。
可溶性锰过氧化物酶活动从文化在生长存在（0）并没有（0）的Mn，水溶性漆酶活动从文化在成长该存在（U）并没有（O）的Mn，和细胞信封绑定锰过氧化物酶活动从文化长大的在存在（一）锰为决心如在描述该文本。
发抖文化为长大的在HCLN （一）和ASN-苯丙氨酸（二）媒体。
DHP 在HCLN文化含3，嗯锰示于图。
3A。
所有这三个标记二氢吡啶为广泛退化以上30 天该实验在含Mn- 文化。
该总和的该14CO2 30后的演变天是40至60岁50％的介绍了每个的的底物。
在CON- 相比之下，在培养物中生长在无的Mn，所有这三个标记二氢吡啶为降级很慢慢地，与小于标记的二氢吡啶的10％存在矿化中该30天的实验。
一时间进程为该进化的14CO2 从标在天冬酰胺-苯丙氨酸文化DHP类示于图。
图3b。
在ASN-苯丙氨酸中等，该降解两者的14C-环和方链DHP标记也为依赖的上存在的锰培养基中。
对于这两个DHP类，的程度14CO2 进化在没有Mn为小于15％那进化在Mn的存在
下进行。
与此相反，显著金额的14CO2 为演变ASN-苯丙氨酸的文化衍丰- 屏息以待同14C-甲氧基-标记DHP在缺乏锰。
30后天，文化培养同14C-甲氧基-标记DHP在没有锰进化约70％的如多二氧化碳如进化中存在的锰
图。
3。
的影响锰上矿化of14C标记的二氢吡啶。
的演变“4CO2 从环标记的DHP在存在（0）和不存在的Mn（0）表示，因为是该进化“4CO2 从侧链标记DHP 在存在（M）并没有（OI）锰和演进14CO2 从甲氧基-DHP标记在存在（A）和缺席（一）的锰。
惊天文化生长在HCLN（a）和天冬酰胺-苯丙氨酸（二）媒体。
讨论唇锰过氧化物酶为首先从细胞外分离中等P。
菌（18，26，28），以及酶从这个有机体已经特点广泛。
两酶是外含血红素的glycopro- teins这存在作为系列同工酶。
相当大的化学和生理学证据以前审查（7，18，22，26，28，37）建议这些酶构成主要组件的该木质素降解系统的P。
菌。
LiP的催化氧化裂解的非酚木质素模型由化合物一机制，着涉及该形成一基板芳阳离子激进的（18，22，26，37）。
一最近的一份报告还表明原油木质素过氧化物酶制剂催化，在最少部分地，本解聚的合成被子植物木质素（19）。
锰过氧化物酶催化锰氧化（Ⅱ）至锰（Ⅲ），以及后者，与复合一个有机酸，容易氧化酚醛木质素模型化合物（15，16，33，38，39）。
最近，我们展示那齐锰过氧化物酶还催化杆
tially合成的解聚被子植物和裸子植物木质素（40）。
此外，它已被妖近日在黄孢原毛平革strated的锰，主基板ofMnP，调节表达OFTHE酶（4，6）通过激活转录OFTHE锰过氧化物酶基因（6）。
在这种本文中，我们扩展我们的研究木质素降解通过检查由LIG-阐述了胞外酶宁降解木耳D. squalens。
其结果示于图。
1表明，与第菌（18，26），D. squalens 下木质素降解氮充分条件以及氮限制条件。
如该图所示。
磅，最初的滞后木质素后降解所得有效地在ASN-苯丙氨酸培养物中和HCLN文化。
此外，四squalens降解侧连锁标记在HCHN媒体对DHP 约33％的退化的HCLN介质的程度（数据未示出）。
锰过氧化物酶的活性是很容易的从介质检测ASN-苯丙氨酸的文化，并为双方的时间课程外锰过氧化物酶和漆酶的活动以及相关联用，对DHP 降解（图磅和2b）。
与此相反，在HCLN 锰含文化，可溶性锰过氧化物活性检测只5天之后和达到最大的18天，而木质素降解迅速地进行从第6天对（图1a 和图2a）。
然而，根据HCLN 的条件下，显著细胞膜结合的MnP活性水平上检测4天，这个活动大概占发病早期木质素降解。
细胞膜结合的MnP 活动有也被检测到体育菌（33）。
想必两种细胞包膜结合和可溶性外锰过氧化物酶有能够产生自由扩散的Mn（Ⅲ），哪在转氧化终端酚类底物，木质素。
我们有证实细胞信封绑定锰过氧化物酶是能够氧化2,6 -二甲氧基均不含细胞和完整细胞的测定法系统。
其结果示于图。
2 演示上根据高，低氮的条件下，D. squalens分泌两种漆酶和锰过氧化物酶一个。
然而，在对比P。
金黄sporium，没有LiP的活性检测在D squalens 文化根据各种条件，包括存在下生长各种浓度的碳，中氮，和Mn中既激动和固定瓶。
同样，润活动是在D squalens未检出处理过的培养同各个P的假定诱导剂菌LiP的活动（25）。
在此外，细胞外无芳基醇氧化酶是检测在这个有机体。
这些结果，连同以前（14，29）上述报告，建议唇缘可不是木质素的基本组成部分降解系统的每个白腐真菌和替代氧化EN- 切酶，如锰过氧化物酶，能够降解木质素。
与此相反的结果与营养素氮，该锰在D存在squalens文化控制的表达，锰过氧化物酶的锡安和木质素的程度降解。
结果图。
2表明，D。
squalens产生一个额外的在HCLN和Asn-苯丙氨酸蜂窝漆酶媒体在存在和缺乏锰。
与此相反，外观的两细胞外可溶性和细胞信封绑定锰过氧化物酶活动完全依赖于存在锰在媒介。
在HCLN文化的程度DHP 降解在不存在的Mn小于15％的，在存在锰。
小amountof “4CO2 进化可以观察到是木质素降解的结果通过这是漆酶表示在不存在锰或通过另一种酶。
这是可能对木质素的锰
效果降解是的结果锰锰过氧化物酶的诱导的表达，如已经显示为P。
菌（6）和的事实，即锰供应如该
底锰过氧化物酶。
但是，此时我们不能排除出少很有可能另一锰依赖酶是参与在木质素降解。
酶分析恶魔STRATE的四squalens 锰过氧化物酶酶活性是依赖的上锰，其结果在图。
2显示，锰规管的锰过氧化物酶表达在D squalens。
结果在图。
图3b 演示那甲氧基标记木质素是降级在天冬酰胺-苯丙氨酸介质而不是在HCLN 介质中的情况下的锰，关联与表达- 锡永漆酶。
漆酶表达在这生物是独立的Mn 和激活通过增长下高氮条件。
这些结果建议该extracel- lular漆是能的demethoxylating愈创木在DHP 体内。
该二聚氧化木质素模型由化合物漆酶具有被描述以前（22）。
在总之，这些结果建议这和锰过氧化物酶普罗巴- BLY 漆酶发挥重要在角色降解的木质素通过至少一些白腐真菌和那唇缘可不一个不可缺少的组成部分的木质素降解系统的一切白腐烂木耳。
研究结果还建议那一品种氧化的酶可利用通过白腐烂真菌为木质素降解。
我们有继续我们的研究上该木质素降解系统的D。
squalens 至鉴定该酶的参与。
致谢这项工作为由GROUPEMENT支持德RECHERCHES德拉克-精灵阿基坦大区，美国国家科学基金会（批DMB- 8904358），和美国部门的能源，基本的办公室能源科学（批DE-FG06-87-ER13715）。
