• 672 •第 44 卷第 3 期 2021 年3 月 《袷Drug Evaluation Research Vol. 44 No. 3 March 2021
遗传毒性评价Ames试验方法的比较分析
高梅“2,曹冲、王功霞\马会\英永”
1. 山东省药学科学院山东省化学药物重点实验室，山东济南2501012. 山东师范大学生命科学学院山东省动物抗性生物学重点实验室，山东济南250014
摘要：Ames试验是一项体外致突变性试验，被广泛用于药物、食品、化学品和农药的遗传毒性检测，以评价受试物致突 变的可能性。药物、食品、化学品和农药的指导原则和国家标准中Ames试验方法不尽相同，就这几者Ames试验方法的主 要异同点进行比较分析，以期能熟练掌握Ames试验实施要点，更加规范实施检测工作，不断提高试验质量。关键词：Ames试验；药物；食品；化学品；农药中图分类号：R962.2 文献标志码：A 文章编号：1674-6376 (2021) 03-0672-05 DOI ： 10.7501/j.issn. 1674-6376.2021.03.031
Comparison and analysis of Ames test for genotoxicity evaluation
GAO Mei12, CAO Chong1, WANG Gongxia1, MA Hui1, YING Yong1
1. Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Chemical Drug, Jinan 250101, China2. Shandong Normal University, College of Life Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Resistance Biology, Jinan 250014, China
鼠伤寒沙门氏菌试验
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文献综述：
鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）
摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展；
1 前言
污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。
众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。
2 定义
2.1 回复突变（Reverse mutation）
２４２ 生 物 技 术 通 讯ｖ ２５…Ｍａｒ．，ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ Ｂ１０ＴＥＣＨＮ０ＬＯＧＹ Ｏｔ．／３ Ｉ￣Ｏ，Ｚ Ｎ１ａｒ．…Ｚ，ＵＩｑ ＂ Ｖ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９—０００２．２０１４．０２．０２１ Ａｍｅｓ试验假阳性的判断方法 陈颖，姜娟，杨阳，李莹，周莉，孙祖越 上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室，中国生育调节药物毒理学检测中心，上海２０００３２ 技术方法 ［摘要］ 目的：确立一种判断Ａｍｅｓ试验假阳性的可靠方法。方法：在Ａｍｅｓ平皿掺入试验中发现经受试物处理的 ＴＡ９７和ＴＡ１５３５的菌落数相比溶媒对照组明显增加，为了证实其是因为受试物致突变性导致的回变菌落数增加还是 由受试物毒性导致的菌落数增加，对分别经受试物和阳性对照物处理的Ａｍｅｓ菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸 的培养基上，观察比较细菌的生长情况。结果：经受试物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中，而经阳性对照 物处理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上，说明经受试物处理的菌株没有发生突变。结论：此方法能可靠地 验证菌株是否为突变菌株，由本研究可以发现经受试物处理的菌株没有发生突变，Ａｍｅｓ平皿掺入试验中所观察到的 菌落数增加是由于受试物毒性造成的假阳性。 ［关键词］Ａｍｅｓ试验；假阳性；判断方法 ［中图分类号］Ｒ９６５．３ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］ １００９—０００２（２０１４）０２—０２４２—０３ Ａ Ｊｕｄｇｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｌｓｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ Ａｍｅｓ Ｔｅｓｔ ＣＨＥＮ Ｙｉｎｇ，ＪＩＡＮＧ Ｊｕａｎ，ＹＡＮＧ Ｙａｎｇ，ＬＩ Ｙｉｎｇ，ＺＨＯＵ Ｌｉ，ＳＵＮ Ｚｕ—Ｙｕｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｎｅｄ Ｐａｒｅｎｔｈｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｖａｌｕａ— ｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｄｒｕｇｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３２，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｈ ｓｕｎｚｙ６４＠１６３．ｃｏｒｎ Ａｍｅｓ等经十余年努力Ｎ－２１，于１９７５年建立并不 断发展完善的沙门菌回复突变试验（亦称Ａｍｅｓ试 验），是一种快速检测化合物致突变性和潜在致癌性 的方法 ，目前已成为世界范围内基因突变检测中 应用最为广泛的一种方法 ，也是我国药物遗传毒性 标准试验组合中必选的一项。鼠伤寒沙门菌的组氨 酸营养缺陷型（异养型ｈｉｓ一）菌株不能生长在缺乏组 氨酸的培养基中，受诱变剂作用后，大量细菌发生回 收稿日期：２０１３－０９—３０ 基金项目：十二五“重大新药创制”科技重大专项（２０１１ＺＸ０９３０１— ００５）；上海市实验动物创新行动计划（１１１４０９０１３００，１１１４０９０１３０３）； 上海市人才发展基金（２０１００３１） 作者简介：陈颖（１９８６一），女，研究实习员，硕士 通信作者：孙祖越，（Ｅ—ｍａ订）ｓｕｎｚｖ６４＠１６３．ｔｏｍ 复突变成野生型（原养型ｈｉｓ ），自行合成组氨酸，使 其在缺乏组氨酸的培养基上也能生长发育成肉眼可 见的菌落 。 在Ａｍｅｓ平皿掺入试验中，一般会在上层琼脂中 添加少量组氨酸，在含微量组氨酸的培养基中，除极 少数自发回复突变的细菌外，一般只能分裂几次，形 成在显微镜下才能见到的微菌落（即背景菌落）ｕ 。 通常判断受试物毒性的方法是通过观察背景菌落的 生长状态及琼脂培养基的清亮程度，一般来说背景 菌苔生长良好时琼脂呈乳白色，若琼脂清亮透明，则 说明背景菌苔生长不良，受试物具有细菌毒性。但 是，由于各厂家生产的琼脂质量不一，很难通过观察 琼脂培养基来判断受试物是否具有细菌毒性，在低 讪 ｍ ～～一一一一一一一～一 一一一～～～一一 ～～ ～．～．～一一～一～一～一一～一一～一一 一～～一～一一一～一一一一陈颖等：Ａｍｅｓ试验假阳性的判断方法 ２４３ 倍镜下观察背景菌落的生长状态也会受到琼脂的干 扰而影响观察，因此这些方法并不可靠。在此，我们 提供了判断Ａｍｅｓ试验假阳性结果的可靠办法。 １材料与方法 １．１材料 ５株标准测试菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２ 和ＴＡ１５３５购自Ｍｏｈｏｘ公司，在液氮或一８０％冰箱中 贮存。阳性对照诱变剂为敌克松（Ｄｅｘｏｎ）、叠氮钠 （ＳＡ）（上海楷洋生物有限公司），２一氨基芴（２一ＡＦ）、 ２一氨基蒽（２一ＡＮ）（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ公司）。 菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００和ＴＡ１０２除具有组氨 酸合成缺失突变外，还具有细胞壁脂多糖缺失突变 （可增加受试物渗透进入细胞的能力），含有ｐＫＭ１０１ 质粒（可增强细胞ＤＮＡ损伤的误修复，促使有可能 被修复的前突变转变为真正的突变，以提高菌株的 敏感性，表现为具有氨苄西林抗性）［１１１Ｏ ＴＡ１５３５不 含ｐＫＭ１０１质粒。ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００和ＴＡ１５３５菌 株具有切除修复系统缺失突变（紫外线敏感）；而 ＴＡ１０２则含有ｐＡＱ１质粒，表现为具有四环素抗性。 １．２抑菌试验 根据国家食品药品监督管理局２００７颁布的《药 物遗传毒性研究技术指导原则》ｎ ，对于可溶性的无 毒化合物，推荐的最高测试浓度一般为５ ｍｇ／皿；对 于可溶性的有细菌毒性的受试物，应根据杀菌或抑 菌情况确定最高浓度。因此，在抑菌试验中采用 ５．０、２．５、１．２５、０．６２５和０．３１２５ ｍｇ／皿，对受试物的毒 性进行检测。 １－３正式试验 根据抑菌试验中受试物的毒性情况确定最高浓 度后，设计５个剂量组，在加或不加Ｓ９代谢活化系统 的条件下采用平皿掺入法进行正式试验，同时设溶 媒对照和阳性诱变剂对照。直接诱变剂敌克松为实 验菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００和ＴＡ１０２的诊断性阳性 诱变剂；直接诱变剂叠氮钠为实验菌株ＴＡ１５３５的诊 断性阳性诱变剂；间接诱变剂２一氨基芴为实验菌株 ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００和ＴＡ１０２的诊断性阳性诱变剂； 间接诱变剂２一氨基蒽为实验菌株ＴＡ１５３５的诊断性 阳性诱变剂。 １．４验证试验 在正式试验中发现部分菌株的菌落数有所增 加，在不能确定受试物是否具有致突变效应的情况 下，将１．０ ｍｇ／ｌｌＲ￣０量作用的ＴＡ１５３５和０．２５ ｍｇ／ｎｌｌ 剂量作用的ＴＡ９７中疑似突变的菌落，以及相应的阳 性对照物作用的菌落进行增菌培养，划线接种于无 组氨酸的底层琼脂培养基上，以验证增加的菌落是 否为突变菌落。 ２ 结果 ２．１抑茵试验结果 在５．０ ｍｇ／皿剂量下５株菌均无菌落形成，在 ２．５ ｍｇ／皿剂量下仅出现极少量菌落，在１．２５ ｍｇ／ｌｌ／１ 剂量下各菌株菌落数明显少于自发回变菌落数，表 明该化合物在上述剂量下具有细菌毒性。故正式试 验中采用１．０ ｍｇ／ｉＩ／１为最高剂量浓度。 ２．２正式试验结果 采用平皿掺入法检测受试物在１．０、０．５、０．２５、 ０．１２５和０．０６２５ ｍｇ／ＩＲ剂量下对测试菌株ＴＡ９７、 ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２和ＴＡ１５３５的致突变性时，发现 ＴＡ９７在０．５和０．２５ ｍ 皿剂量下，无论有无Ｓ９活化 系统，对测试菌株ＴＡ９７产生的回变菌落数与溶媒对 照组相比呈增加趋势；ＴＡ１５３５在１．０ ｍｇ／ｍｔＮ量下， 无论有无Ｓ９活化系统，对ＴＡ１５３５产生的回变菌落 数与溶媒对照组相比虽无统计学差异，但能观察到 菌落数增加（表１，图１）。 ２＿３验证试验结果 给予受试物的菌株不能生长在无组氨酸的培养 基上，而给予阳性对照物的菌株却可以生长在无组 氨酸的培养基上，说明受试物造成的ＴＡ９７和 ＴＡ１５３５菌落数增加并非致突变作用所致（图２），而 是毒性作用导致的假阳性结果。 表１ 受试物平皿掺入试验结果 剂量 。 兰望 堕堕 ： ： 竺 （ ｇ／ 皿） ＴＡ９７ ＴＡ９８ ＴＡ１００ ＴＡ１０２ ＴＡ１５３５
ames实验原理
The Ames test is a widely used assay to assess the mutagenic potential of chemical
compounds. It was developed by Dr. Bruce Ames in the 1970s as a quick and cost-effective way to screen for potential carcinogens. The test is based on the ability of a
chemical to induce mutations in the DNA of bacterial cells, specifically the histidine-requiring strains of Salmonella typhimurium.
The principle behind the Ames test is relatively simple. Mutagenic compounds have
the ability to cause changes in the DNA sequence, leading to mutations. In the case of the
Ames test, the mutagenicity of a compound is assessed by measuring its ability to induce
reverse mutations in the histidine-requiring strains of S. typhimurium. These bacteria are
unable to synthesize histidine due to mutations in their histidine biosynthesis pathway,
