HSV_tk_GCV系统对ACC_M细胞作用的体外试验

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.netHSV-tk󰃗GCV系统对ACC-M细胞作用的体外试验

孙春晓　何荣根　张志愿　刘兴坤　周晓健　陈诗书3

摘　要　目的:为研究HSV2tk󰃗GCV系统对涎腺腺样囊性癌细胞株(ACC2M)细胞的体外杀伤作用。方法:采

用MTT法和细胞计数法对GCV在不同剂量和不同作用时间时细胞的生存率进行研究。结果:HSV2tk󰃗GCV系统

能有效地杀伤ACC2M细胞,杀伤呈时间依赖性和剂量依赖性,这种作用有比较明显的旁杀伤效应,旁杀伤效应的

强弱与细胞间的接触程度呈正比关系。结论:HSV2tk󰃗GCV系统能有效地杀伤ACC细胞,可望用于ACC的治疗。

关键词　涎腺腺样囊性癌细胞　HSV2tk󰃗GCV　系统　细胞死亡　旁杀伤效应

THEEFFECTSOFHSV-TK󰃗GCVGENETHERAPYSYSEMON

ADENOIDCYSTICCARCINOMACELLSINVITRO

SunChunxiao,HeRonggen,ZhangZhiyuan,etal.

TumorBiologyLaboratory,DepartmentofOral&MaxillofacialSurgery,

theNinthHospital,ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai200011

[Abstract]Objective:TostudytheeffectsofHSV2tk󰃗GCVsystemonadenoidcysticcarcinoma(ACC)cellsinvit-

ro.Methods:AdenoidcysticcarcinomacellstransducedHSV2tkgeneweretreatedwithganciclovir(GCV)indif2

ferentconcentrationsandatdifferenttimes,thecellkillingwasdetectedwithMTTassay.Results:HSV2tk󰃗GCV

systemcankilltheACC2Mcellsgreatlyindose2dependentandtime2dependentway,thereareapparentbystander

effectamongcellkilling.Conclusions:TheHSV2tk󰃗GCVsystemcanbeusedtotreatACC.

Keywords　adenoidcysticcarcinomaofsalivarygland　HSV2tk󰃗GCVsystem　bystandereffect

作者单位:上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物学实验室本课题由国家自然科学基金资助(批准号39800150)E2mail:inir@iris.shic.ac.cn或Sun_chunxiao@hotmail.com陈诗书(上海第二医科大学人类基因治疗中心)孙春晓(现在中科院上海生命中心35#(200031))作者简介:孙春晓(1969-),男,博士后 HSV2tk󰃗GCV不仅能直接有效地杀伤肿瘤细

胞,它还有间接的杀伤作用-旁杀伤效应(by2

standereffect),然而由于细胞间的差异,该系统对

各种细胞的杀伤作用也并不完全一样,有报道认为

一个tk基因阳性的肿瘤细胞死亡时可以引起邻近

10个基因阴性细胞的死亡[1],也有报道认为这种作

用并不十分明显[2],为了探讨该系统对ACC2M细

胞的作用,我们进行了下列实验。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　GCV:美国Roche公司产品。

1.1.2　MTT为美国Sigma公司产品。

1.1.3　96孔板、24孔板、6孔板等均为丹麦Nun2

clon公司产品。

2　方法

2.1　细胞:高转移性腺样囊性癌细胞株ACC2M和

舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113由本室建立、转导

HSV2tk基因的ACC2M细胞(AmTK)和Tca8113

细胞(TcaTK)及转导空白载体的AmLN和TcaLN细胞获得和鉴定将另文报道。

2.2　长期杀伤试验:将1×102的对数生长期细胞

接种于96孔板中,接种后第2天加GCV4ΛM,隔天

换液并加等浓度GCV,分别于加药后的第2、4、6、

8、10、12、14天计数细胞,每种细胞每次计4孔。

2.3　细胞体外杀伤试验

细胞体外杀伤试验采用MTT法和细胞计数

法。将1×105细胞接种于96孔板上,24hr后换以新

鲜培养液,并分别加上0、0.04、0.4、4、40、400ΛM浓

度的GCV,分别在24、48、96小时用台盼蓝染色,计

算各孔活细胞或MTT法检测细胞存活率(每48小

时换液并加相应浓度的GCV),每个浓度设3个复

孔。・62・　口腔颌面外科杂志　1999年第9卷第1期　

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net2.4　旁杀伤效应的检测

(1)将总数为1×105的tk+细胞和亲本肿瘤细

胞以不同的比例混合,接种于96孔培养板上,24小

时后换液并加400ΛMGCV,分别于作用24、48、96

小时以台盼蓝染色,计数各孔活细胞数(每48小时

换液并加400ΛM的GCV),每个时间点设3个复

孔。

(2)将1×105的tk+细胞和1×105的亲本肿

瘤细胞混合接种于96孔板(<7mm)、24孔板

(<16mm)、6孔板(<35mm)、<65mm培养皿和

<100mm培养皿中,24小时后换液并加40ΛM的

GCV,96小时后台盼蓝染色计算活细胞数,每个孔

径设3个复孔。

3　结果

3.1　长期杀伤作用

1×102󰃗孔细胞接种于96孔板后,第二天加入

4ΛM的GCV,结果发现,4ΛM的GCV对ACC2M

及AmLN细胞的生长无明显影响,而对AmTK细

胞在最初几天只表现为生长抑制,而在6天后才表

现出明显的杀伤作用,并在第12天完全杀死所有细

胞,其长期杀伤作用曲线如图1所示:

图1　4ΛMGCV作用下细胞的长期生长曲线

图2　不同浓度的GCV作用4天细胞的生长曲线

3.2　时间剂量效应

实验结果显示,转导HSV2tk基因的ACC2M

细胞,加用不同浓度的GCV后,部分孔第二天即出

现细胞死亡,细胞死亡呈现时间依赖性和剂量依赖性,即GCV的浓度越高,细胞死亡出现越早,死亡

的细胞越多;作用时间延长,可增加死亡的细胞数。

而GCV对亲本肿瘤细胞及转导空白载体的肿瘤细

胞无明显杀伤作用,说明HSV2tk󰃗GCV系统能有效

杀伤ACC2M细胞,HSV2tk󰃗GCV系统对ACC2M

细胞的杀伤作用如图2,3所示。

图3　不同浓度的GCV在不同作用时间时细胞的生长情况

但是HSV2tk󰃗GCV系统对Tca8113细胞的体

外杀伤作用不十分明显,400ΛMGCV作用4天只

杀伤29.05%的肿瘤细胞。HSV2tk󰃗GCV系统对

Tca8113细胞的剂量杀伤效应曲线如图4。

图4　不同浓度的GCV作用4天时TcaTK细胞的生长曲线

图5　不同比例的ACC2M细胞和AmTK细胞混合体外

培养产生的旁杀伤作用・72・　口腔颌面外科杂志　1999年第9卷第1期　

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net图6　ACC2M细胞和AmTK细胞以1∶1的比例混合培

养,在不同的培养体积时的旁杀伤作用

3.3　旁杀伤效应

(1)研究结果表明:HSV2tk󰃗GCV系统对

ACC2M细胞的作用存在明显的旁杀伤效应,将总

数为1×105的ACC2M细胞和AmTK细胞以不同

比例混和,加以400ΛMGCV后,不仅可以杀伤

AmTK细胞,还可以明显杀伤ACC2M细胞,ACC2

M细胞与AmTK细胞以1∶1混合时,GCV作用6

天后细胞数只有原先的26.4%左右,说明两者间存

在明显的旁杀伤效应。不同比例AmTK杀伤曲线如

图5。

(2)进一步的研究发现,AmTK与ACC2M细

胞的旁杀伤作用强弱不仅与两者间的比例有密切关

系,也与两者作用所在的容积有关系,即与细胞间的

接触程度呈正相关关系。将总数为2×105的ACC2

M细胞和AmTK细胞以1∶1的比例混合后接种

于不同容积的培养板(皿)中,加以40ΛMGCV,4天

后发现,96孔板中活细胞数最少而<10cm的培养皿

中活细胞最多,说明旁杀伤效应除与tk+细胞成正

比外,还与作用的空间距离成反比,旁杀伤效应与容

积的关系如图6。

4　讨论

到目前为止,几乎所有的文献均报道,HSV2tk󰃗

GCV系统能有效地杀伤肿瘤细胞,其杀伤机理是tk

基因的表达产物将原本对细胞无毒性的核苷类似物

GCV等磷酸化,被磷酸化的核苷类似物替代细胞

DNA合成中的核苷(dTTP)掺入到细胞DNA合成

中,或抑制细胞的DNA聚合酶,从而引起DNA合

成的中止[3]。因此HSV2tk󰃗GCV系统杀伤肿瘤细胞

的前提条件是肿瘤细胞处于增殖分裂状态。

本研究发现,HSV2tk󰃗GCV系统对不同的细胞

作用强弱不同。本研究所选用的细胞ACC2M为通过克隆筛选出来的高转移性腺样囊性癌细胞株[4],

其生长极为活跃,然而本实验中,只有当GCV在较

高浓度时(400ΛM),才对AmTK有较强的杀伤作

用,这可能是由于ACC2M细胞对单磷酸化的GCV

进行二磷酸化或三磷酸化的激酶活性不高之故,因

为研究发现HSV2tk只能将GCV等单磷酸化,而只

有当细胞内的激酶将GCV变成三磷酸化产物后,

才能对细胞产生毒性作用,这些酶可能是二磷酸核

苷激酶和GMP激酶[5]。他人的研究还发现tk+细胞

对GCV的敏感性不及BVDU的百分之一。这是由

于两者的作用机理略有不同之故。GCV属于嘌呤核

苷类似物,这类物质有:GCV(ganciclovir)、ACV(a2

cyclovir)、PCV(pencilovir)、BCV(buciclovir)及

araM(62methoxypurinearabinonucleoside)等;而

BVDU属嘧啶核苷类似物,这类物质有BVDU、

BVDC、IVDU等。后一类物质是通过抑制胸苷酸合

成酶(thymidylatesynthase)而抑制细胞DNA合

成[6]。本研究中HSV2tk󰃗GCV系统对ACC2M细胞

作用不十分明显,还可能与细胞生长活跃、恶性程度

高、对毒性药物的耐受性较好有关;但该系统对

Tca8113细胞作用比对ACC2M细胞更差,就比较

难解释了。由于HSV2tk󰃗GCV系统对Tca8113细

胞的作用较差,本研究主要以ACC2M细胞作为研

究对象。

旁杀伤效应是自杀基因治疗有别于其它基因治

疗的一大特点,它的存在可以大大增强治疗作用,还

有可能弥补目前基因治疗中基因转导效率低下的问

题,然而旁杀伤效应的强弱又受众多因素影响,故不

同细胞之间旁杀伤效应也各不相同,目前认为引起