神经生长因子诱导神经干细胞向胆碱能神经元的分化
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神经生长因子诱导神经干细胞向胆碱能神经元的分化 刘佳梅，陈东*，孟晓婷 （吉林大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，吉林 长春 130021）
摘 要 为了探讨神经生长因子（NGF）是否具有诱导神经干细胞（NSCs）向胆碱能神经元分化的能力，利用无血清培养技术从胎鼠脑内获得神经干细胞，传代纯化后利用免疫细胞化学技术，观察不同剂量NGF作用后神经干细胞向乙酰胆碱转移酶（ChAT）阳性细胞分化的情况。结果发现：50，100，200ng/mlNGF组ChAT阳性细胞数明显比对照组增加，且以100ng/ml组最为明显；加入NGF组，分化的细胞状态较好，且突起明显比对照组增粗增长，以200ng/ml组最为明显。此结果证明NGF具有诱导NSCs向胆碱能神经元分化的趋势，且能促进分化细胞突起的生长。 关键词 神经干细胞 神经生长因子 胆碱能神经元 Study on neural stem cells differentiated into cholinergic neuron induced by NGF Liu Jia-mei，Chen Dong*, Meng Xiao-ting
Dept.of Histology & Embryology, School of Basic Medical Science, Jilin University, Changchun 130021
Abstract: In order to study the ability of NSCs differentiation into cholinergic neuron induced by NGF. NSCs were obtained by serum-free medium technique. The expression of ChAT was detected by immunocytochemistry. The results show the number of ChAT positive cells were significantly increased in 50, 100, 200ng/ml groups compared with control group. The length of total primary neurite in 50, 100, 200ng/ml NGF groups were obviously longer than that in control group. These results suggested that NSCs can differentiate into cholinergic neuron in vitro induced by NGF. Key words: neural stem cells, cholinergic neuron, NGF 20世纪90年代初期，Reyholds[1]等先后在成鼠和胎鼠脑组织中分离出能够不断分裂增殖、
具有多向分化潜能的细胞群落，称其为神经干细胞(neural stem cells，NSCs)。由于NSCs可以从胚胎期及成年中枢神经系统中获得并可在体外培养条件下高度增殖、分化成神经元及胶质细胞表型，从而使其成为治疗神经系统疾病的理想供体细胞。应用NSCs移植治疗神经系统疾病的主要目的是补充缺失的神经元，并使供体细胞与宿主细胞之间形成突触样的结构，使神经组织损伤区得以修复[2]。但NSCs向神经元的低分化率，对补充缺失的神经元、轴突的
再生及神经髓鞘的形成是非常不利的。鉴于此种原因，学者们试图利用外加营养因子或通过基因修饰将NSCs向所需的神经元定向分化，由于NSCs的分化受多种因素的影响，致使其定向分化成为目前研究的热点与难点。许多学者致力于NSCs向胆碱能神经元分化的研究，并已证实NSCs移植入大鼠脑内可以有ChAT的表达[3]。但有关NSCs向胆碱能神经元定向分化的诱导因
子及其分化机制尚有待深入研究。本实验应用不同浓度的NGF作用于NSCs，观察NGF是否有诱导NSCs向胆碱能神经元分化的作用。 材料与方法 1．材料 神经生长因子(NGF)由吉林大学第一临床医院神经内科胡林森教授惠赠；ChAT抗体购自武汉博士德公司；即用型SP免疫组化试剂盒购自福州迈新试剂公司。 2．方法 2.1 NSCs的分离、培养及鉴定
基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金 （20030183048）；吉林大学创新基金 *通讯作者：陈东，吉林大学基础医学院，长春，130021
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___________________________________________________________________________http://www.paper.edu.cn利用无血清培养技术从胎鼠脑内分离、培养NSCs，并对其进行鉴定。具体方法见文献[4]。 2.2 应用流式细胞仪(FCM)对获得的NSCs进行纯度检测 2.2.1 NSCs单细胞悬液的制备 应用Dispase 消化NSCs进行传代培养，消化第二代NSCs制成单细胞悬液，PBS洗细胞，1500 r/min离心5min，计数后将细胞终浓度调成1×107个细胞/ml，
取5×106个细胞快速打入5ml冷70%乙醇中固定，4 oC过夜，以增加细胞膜的通
透性。 2.2.2 Musashi蛋白表达的检测 将冷乙醇固定后的细胞用PBS 洗，1500 r/min离心后用2%鼠血清封闭，PBS洗，加Musashi 抗体50µl（1：50），4oC反应1.5h，PBS 洗2次，加FITC标记的二抗50µl（1：
100）4oC反应45min，PBS洗2次加300µl PBS进行FCM检测。其中，样品设非特异对照组，
即以PBS代替一抗，其余步骤同上。采用B-D公司生产的FACScan流式细胞仪，激发光源为15mW氩离子激光，波长488nm。应用间接荧光法进行检测，FACS软件收集细胞，Lysis软件分析处理数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异对照值。 2.3 免疫细胞化学染色 将生长状态较好的NSC移入35mm培养皿中，培养液内撤去EGF和bFGF，添加10％小牛血清及不同浓度的NGF。实验共分为5组，分别为25 ng/ml、 50 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml NGF组及含10％小牛血清的对照组。每组分为5个培养皿进行培养，培养至第4d换液，培养至第10d，弃去培养液，4%多聚甲醛固定20min后，PBS冲洗，0.3%H2O2 作用15 min，以灭活内源性过氧化物
酶，正常血清封闭20 min，加入一抗（ChAT 1:100）4oC孵育过夜。PBS冲洗后滴加生物素化的二抗，室温孵育15 min。PBS冲洗后滴加过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温孵育15 min。AEC显色（红色），显微镜下观察染色结果。对照染色用PBS代替一抗。染色结束后，计数每个培养皿5个高倍视野的阳性细胞数与细胞总数，计算阳性细胞百分率，用χ2检验进行统计学分析。
2.4 分化细胞突起的测量 将培养10d的各组细胞用Motic Images Advanced 3.0 图像分析系统测量分化细胞初级突起长度(×200；像素：1000，50)，各组间差异用t检验。
结 果 1． NSCs纯度的检测 应用流式细胞仪对获得的NSCs进行纯度检测，结果显示：获得的单个NSCs有96%为Musashi阳性(Fig. 1)。
Fig.1 Musashi positive cells were detected by FCM 2．NSCs分化后形态的改变 添加不同浓度NGF组及血清对照组的神经球在培养24h贴壁并开始分化，球体中心为密集排列的圆形细胞，沿球体周边可见呈放射状排列的无数细长突起。培养至第3d，发现NGF诱导组突起明显增粗，且明显比对照组伸长（Fig.2，3）。培养至第5d，清晰可见分化的细胞胞体饱满，呈
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中国科技论文在线___________________________________________________________________________http://www.paper.edu.cn典型的神经细胞样形态：胞体不规则，有多个细长突起。并在一些细胞内可见鸟眼状细胞核。 Fig. 2 Differentiated NSCs in control group in vitro bar=20µm Fig. 3 Differentiated NSCs in 200ng/ml
NGF group in vitro bar=20µm
3．NGF诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化的能力 各实验组行抗ChAT免疫细胞化学染色后，统计学分析结果显示：50，100，200ng/ml组ChAT阳性细胞数明显比对照组增加，且以100ng/ml组最为明显（Fig.4，5）。具体结果见表1。
Fig. 4 Showing ChAT positive cells of differentiated NSCs in control group by immunocytochemistry bar=20µm
Fig. 5 Showing ChAT positive cells of differentiated NSCs in 200ng/ml NGF group by immunocytochemistry bar=20µm
表1 不同浓度的NGF对NSCs向ChAT阳性细胞分化的影响 组别 培养皿数 分化细胞总数 ChAT阳性细胞数ChAT阳性率 对照组 5 2186 86 3.93 25ng/ml NGF 5 1307 112 8.57*
50ng/ml NGF 5 858 113 13.17*100ng/ml NGF 5 990 136 13.74*200ng/ml NGF 5 946 110 11.63*
χ2 检验(χ2 test) : *P < 0.005 4．NGF对分化细胞突起的影响 将培养10d的各组细胞用Motic Images Advanced 3.0 图像分析系统测量分化细胞初级突起长度，结果发现50，100，200ng/ml NGF组可促进分化细胞突起的生长，且以200ng/ml组为著。具体结果见表2。
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