海洋硫酸多糖916的药代动力学分析方法的研究

中国海洋大学硕士学位论文海洋硫酸多糖916的药代动力学分析方法的研究姓名：王妍婷申请学位级别：硕士专业：生药学指导教师：吕志华;徐家敏20040610海洋硫酸多糖９１６的药代动力学分析方法的研究

摘要

海洋硫酸多糖９１６是以海洋甲壳质为原料，经脱乙酰化、羧甲基化和硫酸酯化等多步分子修饰而成聚阴离子硫酸氨基多糖。经系统的药效学、药理学、毒理学研究，发现９１６具有良好的抗动脉粥样硬化活性，已经国家药品监督管理局批准作为Ｉ类新药进入临床研究。论文旨在为９１６的人体药代动力学研究提供前期的探讨工作，考察了９１６在一定实验条件下的稳定性并且建立了在生物样品兔血清中的高效液相色谱检测方法。在稳定性研究方面，选择生物体液中存在的两种酶…溶菌酶和胰蛋白酶作为考察条件，采用高效凝胶渗透色谱法（ＨＰＧＰＣ）和明胶比浊法，分别考察不同指标，从分子量及分子骨架是否变化到有效基团是否脱落以确定９１６的稳定性。其中９１６的分子量及分子量分布系数采用ＨＰＧＰＣ法考察，有效基团硫酸酯基稳定性的考察采用明胶比浊法定量检测样品中游离硫酸根的含量。结果表明在所选择的实验条件下。９１６对溶菌酶和胰蛋白酶是稳定的，可以推定，在血清中９１６不会被这两种酶降解。为下一步研究９１６在生物样品的前处理中及生物机体内的稳定性进行一定的准备。论文首次利用高效液相色谱柱后衍生法测定兔血清中的９１６浓度，选取盐酸胍作为衍生试剂，并探讨了该衍生反应条件的优化。综合比较几种分析柱如氨基键合柱ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ一５０４Ｅ、凝胶柱ＴＳＫ—Ｇｅｌ．Ｇ２０００ＰＷ、离子排阻柱ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ一８７Ｈ的使用效果，确立离子排阻柱ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ一８７Ｈ为硫酸多糖９１６的分析柱。在生物样品兔血清的预处理中，应用多种除蛋白法如蛋白沉淀剂三氯乙酸、高氯酸、锌盐、乙腈、甲醇、乙醇、饱和硫酸铵等沉淀蛋白法、超滤法和胰蛋白酶消化法并加以比较，选择乙腈沉淀法为样品前处理方法，建立了标准曲线及线性范围，确定９１６在兔血清中的检测限和定量限，分别为２．５ｕｇ／ｍｌ和１０ｕｇ／ｍｌ，考察了精密度、重现性和回收率，建立了兔血清中９１６的高效液相色谱检测方法，为９１６的临床前及临床药代动力学研究提供了方法学基础。

关键词：硫酸多糖９１６，稳定性，兔血清，高效液相柱后衍生荧光色谱法

检测方法ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎａＩｙｔｉｃａＩｍｅｔｈｏｄｓｏｆ

ｓｕＩｆａｔｅｄＰｏＩｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ９１６

Ａｂｓｔｒａｃｔ

９１６ｌｓｏｎｅｋｉｎｄｏｆＤｏｌｙａｎｉｏＨｓｕｌｆａｔｅｄａｍｉｎｏｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗｈｉｃｈｊｓｄｅｒｉｒｅｄｆｒｏｍｍａｒｉｎｅｃｈｉｔｉｎａｎｄｂｙｗａｙｓｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｌｕｄｉｎｇｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ、ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｌａｔｉｏｎａｎｄｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓａｎｄｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，９１６ｓｈｏｗｓｇｏｏｄａｎｔｉａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｗａｓａｕｔｈｏｒｉｚｅｄｔｏｇｏｉｎｔｏｃＩｉｎｉｃｌｅｓｔｕｄｙｆｕｒｔｈｅｒｂｙＮａｔｉｏｎａｌＤｒｕｇａｎｄＦｏｏｄｓＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｔｔｈｅｎａｍｅｏｆｌｌｅｖｅｌｎｅｗｄｒｕｇ．Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｐａｐｅｒｉｓｔｏａｆｆｏｒｄｉｎｇｐｒｏｐｈａｓｅｓｔｕｄｙｏｆ９１６ｉｎｄｅｍｉｃｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．Ｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆ９１６ｕｎｄｅｒｓｏｍｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄａｎｄａａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅ－－ｒａｂｂｉｔｓｅｒｕｍｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙＨＰＬＣ．Ｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｇｅｌｐｅｒｍｅａｔｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｇｅｌａｔｉｎｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｔｅｓｔｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆ９１６ｂｙ１ｙｓｏｚｙｍｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｉｃｅｓｏｆｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｌｕｄｅｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｍｅｌｅｃｕｌａｒｓｋｅｌｅｔｏｎｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈｄｅｃｉｄｕｏｕｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｇｒｏｕｐ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｄｉｓＳＯＣｉａｔｉｖｅｓｕｌｆａｔｅｃｏｎｔｅｎｔｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓｔｈａｔ９ｉ６ｉｓｓｔａｂｌｅｂｙＩｙｓｏｚｙｍｅａｎｄｔｒｙｐｓｉｎｕｎｄｅｒｔｈｉｓｅｘＤｅｒｉｌ刀ｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｍａｋｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓｆｏｒｎｅｘｔｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｃｌｕｄｉｎｇＤｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｂｉ０１０９ｉｃａｌｓａｍｐｌｅａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆ９１６ｉｎｖｉｔｒｏ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｐｏｓｔ—ｃｏｌｕｍｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｅｒｉｖａｔｉｏｎＨＰＬＣｉｓｆｉｒｓｔｌｙｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅ９１６ｉｎｒａｂｉｔｔｅｓｅｒｕｍｕｓｉｎｇｇｕａｎｉｄｉｔｉｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅａｎｄａａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｉｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＩｏｎｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｏｌｕｍｎＡｍｉｎｅｘＨＰＸ一８７Ｈｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｂｅａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｏｌｕｍｎｏｆ９ｉ６ａｆｔｅｒｃｏｎｔｒａｓｔｅｄｗｉｔｈＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐ一５０４Ｅ．ＳｅｐｈａｒｄｅｘＴＳＫ—ＧｅｌＧ２０００ＰＷ．ＩｎｔｈｅＤｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｒａｂｂｉｔｓｅｒｕｍｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｗｉｔｈｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ｐｅｒｃｈｌｒｉｃａｃｉｄ，ｚｉｅｃｓａｌｔ，ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ｍｅｔｈａｎｏｌ，ａｌｃｏｈｏｌａｎｄｓａｔｕｒａｔｅｄａｍｎｌｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ，ａｃｅｔｏｎｉｔＩＹｌｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅａｎｄ１ｉｎｅｒｒａｎｇｅｗｅｒｅｂｕｉｉｄｅｄ，ｔｈｅ１ｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ１ｉｍｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，ｔｈａｔｉｓ２．５ｕｇ／ｍｌａｎｄ１０ｕｇ／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆ９１６ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ．ＡＩＩｔｈｅｓｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｖｉｄｅｂａｓｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒ９１６ｐｒｅｃｌｉｎｉＣｌｅａｎｄｃｌｉｎｉｃｌｅｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｅｓｔｕｄｉｅｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＭａｒｉｎｅｓｕＩｆａｔｅｄｐｏＩｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ９１６，ＳｔａｂｉＩｉｔｙ，ＲａｂｂｉｔｓｅｒｕｍＰｏｓｔ—ｃｏＩｕｍｎｆＩｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｅｒｉｖａｔｉｏｎＨＰＬＣ，ＡｎａＩｙｔｉｃａＩ

ｍｅｔｈｏｄ海洋硫酸多糖９１６的药代动力学分析方法的研究

刖吾

多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，在高等植物、藻类、细菌类及

动物体内均有存在，分布极广，具有能量储存、结构支持、防御功能和抗原决定性等多方面的生物功能。由于多糖特有的性质，它们很早就应用于医药领域。

近年来多糖更成为药物研究开发的一个热点。随着对多糖理化性质、结构和

药理作用的深入研究，发现多糖在医药领域有许多新用途，多糖可作为广谱免

疫促进剂，具有免疫调节功能，如多糖能治疗风湿病、慢性病毒性肝炎、癌

症等免疫系统疾病，还具有抗ＡＩＤＳ、抗炎、抗病毒、抗心血管疾病、抗氧化、

抗辐射和降血糖、降血脂，促进核酸和蛋白质的生物合成作用：能控制细胞

分裂和分化，调节细胞的生长与衰老。而且多耱作为药物其毒性极小，因而

多糖的研究已引起人们的极大兴趣［１－３］。

多糖的分析测定方法１４】

多糖的定性、定量分析方法很多，包括化学方法、物理方法、酶学方法

和免疫学方法等。

１多糖的定性分析方法

常用的有电泳法（鉴定粘多糖和中性多糖）、薄层色谱法（鉴定硫酸皮肤

素、硫酸皮质素）、纸色谱法（鉴定粘多糖）、柱色谱法、离子交换色谱法、

高效液相色谱（ｔＩＰＬＣ）法、酶解法等，此外，还可以根据比旋光度、红外吸收色谱（ＩＲ）和紫外吸收色谱（ＵＶ）进行定性分析。

２多糖的定量分析方法

多糖的定量分析方法有比色定量法、分光光度法、薄层色谱法、离子交

换色谱法、纸色谱法、高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法、酶法、凝胶电泳法、亲和

电泳法、蒽酮一硫酸法等。其中，电泳法、高效液相色谱（ＨＰＬＣ）法、气相色

谱（Ｇｃ）法等可同时用于多糖的定性、定量分析。

电泳技术是在蛋白质基因等研究中广泛应用的一种技术，随着糖类研究海洋硫酸多糖９１６的药代动力学分析方法的研究

的进‘步深入，电泳在糖的分离分析方法中愈发显示其重要性。可用于糖及

糖缀合物分析的方法有：柱电泳、薄层电泳和毛细管电泳（ＣＥ）三类，其中ｃＥ是８０年代发展起来的一类新型的高效、快速、微量的仪器化电泳技术。目前

毛细管电泳应用于单糖和寡糖的分析较多，在糖生物学中，ｃＥ法常用于糖蛋

自裂解的单糖和寡糖的测定。由于多糖类药物结构复杂，微观不均一性强，进行分离纯化以及纯度鉴定比较困难，利用ｃＥ法定量测定目前限于多糖中某

特定功能团和组成多糖的各单糖的定量分析。由于多数多糖没有紫外吸收基团和荧光发射基团，一般需要通过衍生引入发射团或用间接检测法。随着电

泳技术的不断完善，各种衍生化方法和检测技术的出现，ｃＥ法在糖的分离分析中的应用会越来越广泛。探索多糖及糖缀合物中糖链的有效解离，并不使

糖元发生讲解，寻求新的衍生试剂将是ｃＥ分离分析多糖及糖缀合物的关键，

ｃＥ于其他多种技术联合应用会获得多糖及糖缀合物更完整的信息１５’６１。高效液相色谱（ＨＰＬｃ）法是糖类研究方法学中的重要组成部分，在糖类

的分离和分析中，ＨＰＬＣ具有快速、方便、分辨率高、分离效果好、重现性好

和不破坏样品等优点，已经成为常量及微量单糖和寡糖重要的分离分析方法

之一，尤其适于测定热不稳定的单糖和低聚糖，效果较好，在多糖分子量测

定方面是其他方法无可比拟的。糖类化合物的传统检测方法采用柱后衍生和

可见光检测器检测，近年来常用示差折光检测器直接测定，样品无需要升华，

但灵敏度较低。为了提高分析灵敏度，可采用衍生化的方法将样品组分制备

成有紫外吸收或能发出荧光的衍生物，用紫外检测器、二极管阵列检测器或

荧光检测器检测１７～。

气相色谱（ＧＣ）法测定糖类，优点是选择性好、分辨率高、样品用量少、灵敏、准确快速等，遇到的主要困难是糖类本身没有足够的挥发性，必须将

其转化为挥发性衍生物才能进行测定。对于多糖，需首先将其降解为结构简

单的单糖或寡糖，然后将其衍生为易挥发、热稳定的衍生物，通过对降解糖

的衍生物进行定性、定量测定。常用的衍生物有：糖的三甲基硅醚衍生物、