鸡粪异养除硫化氢菌株的分离、筛选与菌剂配制

・　３０　・　现代化农业　２０１２年第９期（总第３９８期）　鸡粪异养除硫化氢菌株的分离、筛选与菌剂配制　赵晓锋，于文清。隋文志　（黑龙江省农垦科学院农畜产品综合利用研究所，黑龙江佳木斯１５４００７）　

摘要：试验分离了细菌ＫＢ１７和ＫＢ５１、放线茵ＫＡ１８和ＫＡ９９四个菌株，使鸡粪堆肥的硫化氢释放量分别降低　了７２．Ｏ１　、７６．２８　、７３．Ｏ２　和７３．ＯＯ　。初步鉴定细茵ＫＢ１７为短状杆菌属、ＫＢ５１为假单胞茵属、放线茵ＫＡ１８　为链霉菌属、ＫＡ９９为小单孢茵属。茵剂复配试验结果表明，ＫＢ１７与ＫＡ１８、ＫＢ５１与ＫＡ９９复配后使鸡粪堆肥的　硫化氢释放量分别降低了７７．３２　和７８．６９　。　关键词：生物除臭；并养除硫化氢菌株；鸡粪；茵剂配制　

０　引言　鸡粪高温堆肥过程中会释放出大量有害的恶臭气体，其中浓度较高、对人体健康危害最大的主要是氨气和　硫化氢。除硫化氢菌株能够促进硫化氢转化为硫酸盐，从而减少硫化氢释放。该试验为分离、筛选高效除硫化　氢菌株，并将各菌株复配成除硫化氢的菌剂，为减少鸡粪高温堆肥硫化氢释放提供理论依据和菌种资源。　

１试验材料与方法　１．１　试验材料　样品来自水田土，池塘淤泥，菜园土，花园土，山坡腐殖层土，河床土，草炭和腐植酸，鲜鸡粪（水分６９．４　、　有机质５７．８　、全氮３８．１０ｇ／ｋｇ、全磷１９．９４ｇ／ｋｇ、全钾２６．６３ｇ／ｋｇ、ｐＨ值７．９２），污水水处理厂的污泥。　１．２异养除硫化氢菌株的分离、筛选　１．２．１　分离　收稿日期：２０１２一Ｏ８—２Ｏ　基金项目：黑龙江省科技攻关项目《寒区畜禽粪便生物处理除臭技术研究》（ＧＡＯ９Ｂ５Ｏ２＿１）　作者简介：赵晓锋（１９８１一），男，黑龙江佳木斯人，硕士，助理研究员，主要从事农业微生物学研究。　（　●００●｜．¨¨ＯＯ◆ＯＯ●ＯＯ●ＯＣ●ＯＯ◆ＯＯ●ＯＯ◆００◆０Ｏ●０（）●ＯＯ●００●００●００●Ｏ０●ⅢＯＯ●ⅢⅢⅢＯ…　ＯＯ　ＯＯ∽●Ⅲ　＇’．Ⅲ１＿．．Ⅲ００●ｏ０●州ＯＯ●ｏＯ●０ｏ●００●０Ｏ◆。。．（）　、”●ⅢＯＯ●。。．ｏ　试验结果表明，黄皮９８１８的产量最高，公顷产量达４７１８４ｋｇ，其次是早醉仙和金雪莲，产量最低的是风　味４号，产量仅为３９ｏ４７ｋｇ，极显著低于其它３个品种，其它３个品种间的产量差异不显著。　表ｌ经济学性状结果　

３结论与讨论　由于春末夏初是黑龙江水果价格较高的季节，只有尽早上市才有可能取得较好的经济效益，早醉仙生育　期相对较短，有较好的推广潜力。黄皮９８１８属于网纹类型，生育期虽然较长，但它是比较典型的哈密瓜品　种，口感甜脆、颜色漂亮，消费者比较认可，可与早醉仙搭配栽培，丰富栽培品种，延长采摘时间，取得更好的　经济效益。　筛选品种只是引种工作的第一步，需进一步进行试验了解品种特性，根据品种特性完善、改进栽培措施，　充分发挥品种特性，扬长避短，取得最佳的经济效益。（Ｏｌ７）　现代化农业　２０１２年第９期（总第３９８期）　・　３１　・　ａ．分离培养基。细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏一号培养基；真菌：马铃薯蔗糖培养基。鸡粪　浸提液：２００ｇ鲜鸡粪加８００ｍＬ水搅拌后，过滤，调滤液ｐＨ值为７．０～７．２，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。　ｂ．分离方法。将样品稀释至１０～，不同的浓度分别采用稀释平板法、涂布法和划线法分离细菌、放线　菌、真菌，纯化，然后将细菌、放线菌在２８～３０。Ｃ、真菌在２５～２８℃培养，４℃保存备用。　１．２．２　筛选　ａ．初筛将分离得到的菌株采用鸡粪浸提液培养基制成菌液，并将新鲜鸡粪用风干鸡粪调节含水量至　６ｏ％～６５　，３０。Ｃ条件下培养２４ｈ后，称取５Ｏ．０ｇ装入２５０ｍｉ　三角瓶中，将制成的菌液按５　９／６的接种量接入　三角瓶，混拌均匀后塞好胶塞。分别在第１、３、５、１０、１５ｄ凭感官测定臭味等级，臭味等级分为５个级别，分别　为Ｍ０（无臭味）、Ｍ１（仔细才能闻到）、Ｍ２（有明显臭味）、Ｍ３（比较臭）、Ｍ４（恶臭）。同时测定菌液的ｐＨ值。　ｂ．复筛将初筛得到的菌种，培养成菌液。称取风干鸡粪５０．０ｇ，加人１０ｍＬ培养好的菌液，然后补充　４０ｍＬ无菌水，混合均匀，装人１０００ｍＩ　的广口瓶中。放入装有３０ｍＬ锌铵络盐溶液的５０ｍＬ小烧杯，敞口放　入２８～３０℃的温箱中１ｈ后，盖塞并用双层薄膜封口。每个菌种做５个重复，同时，做一组只加无菌水的空　白对照。每隔５ｄ取出小烧杯，用比色法测定锌铵络盐吸收液，测定广口瓶中鸡粪的硫化氢释放量，从而筛选　出可减少硫化氢排放的菌种，至第２０ｄ结束。　１．２．３　菌株初步鉴定　细菌根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册（第八版）》鉴定，放线菌根据《放线菌的分类和　鉴定》鉴定。　１．２．４　菌株拮抗　细菌、放线菌划线接种，两两交叉划线。３Ｏ℃培养３～５ｄ后，观察是否有拮抗作用。　１．２．５　菌株组合　将经过复筛并且没有拮抗作用的菌株进行复配，按照复筛的方法测定复合菌剂对硫化氢的去除率。　

２试验结果与分析　２．１　异养除硫化氨菌株的分离、筛选结果　２．１．１　菌株分离结果　试验从各样品中共分离４４９株菌株，其中，细菌２１　７株，编号为ＫＢ１～ＫＢ２１　７；丝状真菌１０１株，编号为　ＫＦ１～ＫＦ１０１；放线菌１３１株，编号为ＫＡ１～ＫＡ１３１。　２．１．２　菌株初筛试验结果　ｐＨ值测定结果显示，细菌菌株发酵过程中ｐＨ值都较对照培养基要高，放线菌和真菌中个别菌株ｐＨ　值下降幅度特别大，达到４．０～５．０，将这些菌株筛选出来进行复筛试验。通过感官试验筛选出最终臭味等　级为Ｍ０的菌株和ｐＨ值下降幅度较大的菌株ｌ８株，进行复筛试验。　２．１．３　菌株复筛试验结果　经过试验筛选出除硫化氢效率高于７Ｏ　的菌株４株，其中分别是ＫＢ１７、ＫＢ５１、ＫＡ１８和ＫＡ９９，硫化氢　去除率分别为７２．０１　、７６．２９％、７３．Ｏ２　和７３．Ｏ０　（见表１）。　２．２菌株鉴定结果　ａ．ＫＢ１７革兰氏阳性，杆菌，好氧。菌落小，圆形，无色透明。菌体（Ｏ．５～０．７）　ｍ×（２．０～４．０）　ｍ，不　运动，无芽孢，Ｍ．Ｒ＋，Ｖ．Ｐ＋，发酵蔗糖和葡萄糖产酸不产气，初步鉴定为短状杆菌属。　ｂ．ＫＢ５１革兰氏阴性，杆菌，好氧。菌落微黄，透明，油脂状。菌体（０．７～０．８）　ｍ×（１．７～１．８）　ｍ，运　动，鞭毛单生，Ｍ．Ｒ一，Ｖ．Ｐ＋，发酵蔗糖不产酸不产气，发酵葡萄糖产酸不产气，初步鉴定为假单胞菌属。　Ｃ．ＫＡ１８菌落初始白色，菌丝浓密，后由中间向四周变灰色，培养基背面紫红色。菌丝无横隔，多分枝，　直径０．５～０．７＞ｍ，气生菌丝分裂成孢子链，孢子球形。初步鉴定为链霉菌属。　ｄ．ＫＡ９９基内菌丝为主，基内淡黄色，菌落较硬，无气生菌丝，后期表面有白色茸状物。菌丝有分枝，　有横隔，直径０．５～０．６　ｍ，孢子单生，无梗。初步鉴定为小单孢菌属。　・　３２　・　现代化农业　２０１２年第９期（总第３９８期）　２．３菌株拮抗试验结果　拮抗试验结果表明，ＫＢ１７与ＫＡ１８、ＫＢ５１与ＫＡ９９之间无拮抗作用，ＫＢ１７、ＫＡ１８分别与ＫＢ５１和　ＫＡ９９存在拮抗作用。　’　表１　复筛菌株２０ｄ硫化氢释放总量与最终去除率　菌株编号Ｈ　Ｓ释放量ｍｇ／ｋｇ　Ｈ　Ｓ去除率　菌株编号Ｈ　Ｓ释放量ｍｇ／ｋｇ　ＨｚＳ去除率　ＫＢ１３　４５．２１　２２．Ｏ３　ＫＢ１５７　１９．２８　６６．７４　ＫＢ１７　１６．２３　７２．Ｏ１　ＫＢ１６１　６Ｏ．１３　—３．７　ＫＢ５１　１３．７５　７６．２９　ＫＢ１６５　３９．４８　３１．９　ＫＢ６１　５Ｏ．２９　１３．２７　ＫＢ２１５　２５．０４　５６．８１　ＫＢ６２　４６．９５　ｌ９．Ｏ２　ＫＡ１８　１５．６４　７３．０２　ＫＢ６９　１９．７０　６６．Ｏ２　ＫＡ９９　ｌ５．６６　７３．ＯＯ　ＫＢ８４　３４．５７　４０．３７　ＫＦ２　２５．７１　５５．６６　ＫＢ１２３　３６．４８　３７．Ｏ９　ＫＦ９６　２４．９４　５６．９９　ＫＢ１４９　６８．２６　—１７．７３　ＣＫ　５７．９８　Ｏ　ＫＢ１５Ｏ　５２．４５　９．５３　

２．４单菌制剂与复合制剂除臭试验效果　表２中可以看出，菌株复合较单株菌的硫化氢去除率要高，说明各个菌株之间都有相互促进除硫化氢的　作用，ＫＢ１７与ＫＡ１８、ＫＢ５１与ＫＡ９９混合后的菌液使硫化氢释放量分别降低了７７．３２　和７８．６９　。　由于细菌繁殖速度较快，所有添加细菌的菌剂在最初就能控制硫化氢的释放，放线菌和真菌则是在５～　１０ｄ时开始起到作用的。各菌剂硫化氢释放趋势与对照一致，在初始５ｄ内释放量较高，菌株ＫＢ５１与菌株　ＫＡ９９复合的菌剂在１５～２０ｄ仅释放０．０７１ｍｇ／ｋｇ，平均每天不足０．０１５ｍｇ／ｋｇ，说明该菌剂在１５ｄ内就能够　控制硫化氢的释放，缩短了Ｈ　Ｓ释放时间。　表２菌株组合硫化氢释放量与最终去除率　

３　结论　ａ．分离筛选了细菌ＫＢ１７和ＫＢ５１、放线菌ＫＡ１８和ＫＡ９９四个菌株，使鸡粪堆肥的硫化氢释放量分别　降低了７２．Ｏ１　、７６．２８　、７３．０２　和７３．ＯＯ％。　ｂ．ＫＢ１７与ＫＡ１８、ＫＢ５１与ＫＡ９９复配后使鸡粪堆肥的硫化氢释放量分别降低了７７．３２　和７８．６９　。　Ｃ．初步鉴定细菌ＫＢ１７为短状杆菌属，ＫＢ５１为假单胞菌属，放线菌ＫＡ１８为链霉菌属，ＫＡ９９为小单孢　菌属。　

４参考文献　［１］　陈瑞勤．鸡粪除臭微生物的筛选［Ｊ］．中国饲料添加剂，２００９（６）：２４—２６．　Ｅ２］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学出版社，２０１１．　［３］Ｒ．Ｅ．布坎南，Ｎ．Ｅ．吉本斯．伯杰细菌鉴定手册［Ｍ］．８版．北京：科学出版社，１９８４．　Ｅ４３　阎逊初．放线菌的分类和鉴定［Ｍ］．北京：科学出版社，１９７４．　（０１７）