考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4倍，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I（4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml（7）容量瓶10ml（8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量吴凡郭梦雨摘要:本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。
结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。
实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP),此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。
关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、外援添加物1 实验部分1.1 实验原理果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。
许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度高，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测卵白质含量之迟辟智美创作一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量.因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术.二、卵白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定卵白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤.最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4.2、标准卵白质溶液：纯的牛血清血卵白，预先经微量凯氏定氮法测定卵白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml卵白溶液.（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）.2、移液管使用（）.（三）、标准曲线制作：1、10ug、20 个点为ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线.1）、利用标准曲线查出回归方程.2）、用公式计算回归方程.3）、或用origin作图，测出回归线性方程.即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上.4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧.（四）、卵白质含量的测定：样品即所测卵白质含量样品（含量应处置在所测范围内），依照把持步伐1把持，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品卵白质含量.一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太年夜，可以稀释后再测A595nm 值，然后再计算.（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净.2、取量要准确.3、玻璃仪器要干燥，防止温度变动.4、对比：用被测物质以外的物质作空白对比.药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步伐（一）、实验准备：1、准备所需的药品和玻璃仪器.2、洗涤.（怎样洗涤算干净？）（二）、计算：1、百分比浓度计算：1)、G/V比例如配1% NaCl，称1g NaCl溶于100ml 水.2）、V/V比：例如配75%乙醇100ml，75%×100%=100%×X, X=75ml.取75ml无水乙醇，加25ml蒸馏水.乙醇：乙醚：丙酮=2：1：2配500ml，各取200 ml，100ml，200 ml混合.3）G/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量.2、摩尔浓度计算：注：药品的分子量一般在标签中注明. 1）、0.1M或0.1mol/L NaCl配100ml.M=质量/体积（L）称取NaCl0.1×0.1×40=0.4g 摩尔数=G （g）/摩尔质量毫摩尔数=G（mg）/摩尔质量微摩尔数=G（ug）/摩尔质量称取NaCl0.1×0.1×40=0.4ug 3、混合溶液配制的计算：如配3uMEDTA，2.25mM NBT以及60uM 溶液100ml，用50mM磷酸缓冲液配制.注意：1、分别标定体积计算2、分别配制再混合，但总体积不能为100ml （三）、标量：1、根据需要选择分歧量程的天平根据要求去分歧精度的丈量器，如量筒或移液管.2、电子分析天平的使用.（四）、溶解：1、根据药品配置要求选择溶剂.蒸馏水，双蒸水，无离子水等.2、只能用烧杯溶解.注意加入溶剂只能加入总体积的2/3左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右，直到洗涤干净.小知识：药品标签中一般标识有药品的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的知识判断药品的结构和性质特点（包括溶解性质）.如酸碱两性物质的配制（AA、卵白质、核苷酸等）如果溶解性能欠好可以用稀酸或稀碱增进溶解，但pH应在被要求的范围内.3、加热增进溶解，但注意应在配制的范围内有的药品还需水溶加热较好.如:配0.1%的淀粉，水裕加热（温度在80-90.C），过量会糊化.（五）、定容：1、用容量瓶定容；2、用玻璃棒引流或用小漏斗；3、用溶剂加入到接近刻度，然后用滴管加入到刻度.要求刻度与液体凹面相切为止（眼睛可视）；4、上下窑洞容量瓶几次，混合均匀即可.(注意不再定容了，防止溶液漏失落.)（六）、装入试剂瓶，贴上标签.标签应注明以下内容：药品浓度、名称、配制人、配制日期等.（七）、清理实验场所.二、磷酸缓冲液的配制.（一）、配制0.2mol/L即0.2M pH=6.8的磷酸缓冲液.用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液.选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O （酸）配缓冲液100ml.书中说明.（二）、计算：1、注：书中有注明配置的量.2、含有分歧结晶水的换算.书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O 需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需几多g？11.87=（178/358）×X，X=23.87g.（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）.即：0.2M Na2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml.（四）、按书中的量配制取量再混合.如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml.（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确.（六）如配50mM pH =6.8的缓冲液100ml ，以你配制的母液稀释即可.计算：50×0.1=0.2×1000×X （L）；X =0.025L；取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可.。
