碱性磷酸酶底物显色试剂盒

方法评价
优点：灵敏度较高，显色稳定，
不需去蛋白，操作简单、快速；
缺点：准确度和精密度都较低,受
胆红素和溶血的干扰。
实验材料与仪器
器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管 架、吸量管、恒温水浴箱、分光 光度计
移液器
1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头
实验材料与仪器
试剂盒：
1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
血清碱性磷酸酶活性测定
授课教师：
实验目的
1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定 的临床意义
基本概念
酶活性：即酶催化化学反应的能力。
酶的活性通常以活性单位表示。
它反映在规定的条件下，酶促反应 在单位时间内（秒、分或小时）生 成一定量的产物（mg、μg 、μmol） 或消耗一定量的底物所需的酶量。
——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺 乏症等。
Katal单位：1Katal指在规定条件下， 每秒钟转化1mol底物的酶量。 1Katal=60×106IU
本实验以血清在37℃，pH为10的
条件下，与AKP底物液作用30min， 每生成1mg酚所需的酶量为1个酶
活性单位。
实验原理
碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下
催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和
磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安
基本概念
酶活性单位是衡量酶数量的尺度， 同一种酶由于实验方法、测定条件 不同，酶活性单位的规定也不同。
在相同测定条件下，酶活性单位越 大，表示酶的含量越高，酶促反应 速度越快。

预混型BCIP/NBT溶液Premixed BCIP/NBT Solution华越洋----------------------------------------------介绍：华越洋预混型BCIP/NBT溶液是在BCIP/NBT底物显色试剂盒的基础改良而得的。

特点：含有BCIP和NBT两种成分的混合液，不需混合和稀释，直接使用，十分方便。

在碱性磷酸酶存在时形成暗紫色沉淀，具有和其他AP底物（包括分开提供的BCIP/NBT溶液）一样的灵敏度。

稳定，使用精心优化的溶剂，在低温条件下可以保存一年。

可用于Western Blot。

运输及保存常温运输和保存（避光），有效期一年。

自备试剂Western印迹膜洗膜液或TBST缓冲液。

使用方法按常规方法进行Western印迹膜杂交，直到跟二抗-AP复合物保温这步结束。

用Western印迹膜洗膜液洗印迹膜5次，每次至少1分钟。

注意：可以用TBST缓冲液代替Western印迹膜洗膜液。

用水迅速冲洗一次。

将印迹膜转移到本产品中（每cm2印迹膜需要0.1mL 本产品），室温平缓摇晃5-30分钟显色。

37℃可加速反应。

细心观察蛋白条带的颜色变化，显色到满意程度后（一般需要20分钟，具体跟蛋白浓度密切相关）迅速将印迹膜转移到盛有超纯水的托盘中摇晃，终止显色反应。

数分钟后需要换水，共三次。

用吸水纸吸干膜上的水分，照相或扫描处理后避光干燥保存印迹膜。

BCIP/NBT反应原理BCIPNBTBCIP被碱性磷酸酶水解后形成一个中间体。

这个中间体被异构化以后的产物与NBT 反应生成白色的中间体二聚体和NBT-蓝紫色结晶物。

碱性磷酸酶(ALP)测定标准操作程序1.摘要碱性磷酸酶（ALP）存在于成骨细胞、干细胞、白细胞、肾、脾、胎盘、前列腺和小肠内。

测定血清或肝素化血浆中的碱性磷酸酶活力，做临床辅助诊断用。

2.适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中碱性磷酸酶（ALP）的活力。

3.职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定碱性磷酸酶（ALP）活力的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。

4.检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的碱性磷酸酶（ALP）试剂盒采用的是AMP缓冲液法。

5.原理在AMP的缓冲环境下，磷酸对硝基苯在碱性磷酸酶的作用下，可以水解成磷酸盐和对硝基苯酚。

在一定底物浓度范围内,磷酸对硝基苯的水解产物对硝基苯酚会引起405nm处吸光度的上升，其上升速率与血清中碱性磷酸酶的活力成正比。

−→−+OH−−磷酸盐对硝基苯酚磷酸对硝基苯碱性磷酸酶+26.仪器日立7600自动生化分析仪7.试剂7.1试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2试剂瓶内主要成分：R1：AMP缓冲液（PH10.50）、乙酸镁；R2：AMP缓冲液（PH8.85）、磷酸对硝基苯、乙酸镁。

AMP：2-氨基-2-甲基-1-丙醇7.3试剂稳定性：试剂在2-8℃避光保存，有效期1年。

试剂工作液在2-8℃避光保存，可稳定4周，15-25℃可保存稳定4天。

7.4试剂准备：试剂为即用式。

8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。

按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。

8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。

每日在测定前做一次质控。

该质控品为干粉包装，在2-8℃冰箱可稳定到失效期，使用前用5ml去离子水复溶，待质控物充分溶解（大约30分钟）后使用。

临床意义
1. 鉴别细菌性感染(增高)与病毒性感染(减低) ； 2. 鉴别慢粒(减低)和类白血病反应(显著增高)； 3.慢粒经治疗病情缓解时活性恢复正常，急变
时活性增强，有助于对病情判断； 4. 急粒时活性减低，急淋时活性增高； 5. 再障时活性增强，PNH时活性减低。
其他细胞基本呈阴性反应。
结果判断
阴性：胞浆内无沉淀物（无色） 阳性：胞浆内出现红色沉淀物
阳性率： 积分计算：观察100个成熟中性粒细胞，将每
个细胞的记分相加，即得积分。
正常人的NAP活性正常值：
中性粒细胞阳性率：68~99.5%（ 84.1% ） 阳性积分为： 30~130分
注意事项
1. 涂片应新鲜，染好片即看； 2. 低温固定，细胞不易破坏； 3. 基质液须新鲜配制； 4. 应作阴、阳性对照。
步 骤(固定、显示、复染)
1. 新鲜涂片滴加固定液（4℃）30秒，待干； 2. 将Ⅰ液置入Ⅱ液混合成为基质液。将涂片
置入，37℃温育45分钟，连缸流水冲洗 数分钟，取出待干； 3. 苏木素复AP主要存在于中性成熟粒细胞（中性 杆状核和分叶核细胞），呈阳性反应， 严重的化脓性感染时，晚幼阶段也可见 有阳性反应。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色
实验要求：
掌握中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原 理、操作、注意事项、结果判断、正常血 细胞染色反应及临床意义。
原 理：
中性粒细胞内的碱性磷酸酶在碱性环 境下，水解α－磷酸萘酚钠，产生α－萘 酚。后者与重氮剂偶联形成有色沉淀物，沉 淀物的显色深浅与碱性磷酸酶活性成正比。
试剂：
1. NAP 固定液：含甲醇、甲醛等 2. NAP Ⅰ液：含固紫B等 3. NAP Ⅱ液：含丙二醇、磷酸萘酚钠盐等 4. 苏木素复染液：