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右旋糖苷修饰酵母蔗糖酶条件的筛选及修饰酶性质的研究

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第30卷第4期2009年10月 华南农业大学学报JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity Vol.30,No.4Oct.2009

　收稿日期:2008207217

　作者简介:伍志权(1982—)男,硕士;通讯作者:黄卓烈(1950—)男,教授,硕士,E2mail:zhuolieh@scau.edu.cn

　基金项目:国家自然科学基金(10074016)

右旋糖苷修饰酵母蔗糖酶条件的筛选及修饰酶性质的研究

伍志权1,2,黎春怡3,麦小珊2,郭诗静2,黄卓烈2(1佛山市中南农业科技有限公司检测中心,广东佛山528000;2华南农业大学生命科学学院,

广东广州510642;3茂名职业技术学院,广东茂名525000

)

摘要:以低分子右旋糖苷(Dextran)为修饰剂,选用L

16(45)正交试验方案,研究了不同修饰条件对酵母蔗糖酶

(Yeastinvertase)化学修饰效果的影响以及修饰前后酶的性质变化.结果表明,pH510、20℃、反应8h为最佳的修

饰条件.与天然酶相比,修饰酶的酶比活力、糖含量、酶活力回收率分别提高5617%、35105%和14161%,蛋白含量下降22166%,氨基修饰率为39155%.酶学性质研究表明,修饰后酶的最适pH在410～510范围内,最适温度55～60℃,在pH315缓冲液中稳定性上升,在pH615缓冲液中稳定性下降,在60℃缓冲液中稳定性下降.动力学研究表明,修饰后酶的Km和vmax均上升,光谱分析表明,修饰后酶的构型构象均发生变化.

关键词:酵母蔗糖酶;右旋糖苷;化学修饰中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:10012411X(2009)0420048205

YeastInvertaseChemicallyModifiedbyDextranandItsEnzymeProperties

WUZhi2quan1,2,LIChun2yi3,MAIXiao2shan2,GUOShi2jing2,HUANGZhuo2lie2(1TestCenter,FoshanZhongnanAgriculturalTechnologyLimitedCompany,Foshan528000,China;

2CollegeofLifeScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China;3MaomingVocationalandTechnologicalCollege,Maoming525000,China)

Abstract:Dextranwasusedasthemodifyingreagentforthechemicalmodificationofyeastinvertase.Inordertofindanoptimumwayforchemicalmodification,theeffectsofdifferentmodificationconditionwerestudiedthroughorthogonalcomparison.TheorthogonalanalysisshowedthattheoptimumconditionforchemicalmodificationwastodotheexperimentinthesolutionofpH5.0atthetemperatureof20℃for8h.Thespecificenzymeactivity,polyhydratecontentofthemodified2enzymeandtheactivityreservalra2tiowereincreasedby5617%,35105%and14161%,respectively1However,theproteincontentofmodi2fied2enzymewasdecreasedby22166%,andtheratioofaminomodificationwas39155%.ThestudyofzymologicalpropertiesshowedthattheoptimalpHwasattherangeof410-510,theoptimaltemperaturerangewas50-60℃.Thestabilityofmodified2enzymeatpH315wasincreased,butthestabilityatpH615wasdecreased.Thethermostabilityat60℃wasalsodecreasedcomparedwiththatofyeastinvertase.KineticsanalysisshowedthatKmandvmaxofmodified2enzymewasincreased.Thespectralanalysisshowedthattheconfigurationandconformationofmodified2enzymewerequitedifferentfromthatofyeastinvert2ase.

Keywords:yeastinvertase;dextran;chemicalmodification 酶化学修饰可以提高酶的稳定性和抵抗蛋白质变性剂的能力,为酶在工业上的应用提供更加广阔的前景.同时,化学修饰改善蛋白质(酶)和多肽药物在临床应用过程中的一些不良性质,弥补了天然酶的一些不足,并赋予了一些优良性质,从而显示药用蛋白酶化学修饰的良好应用前景.然而,目前国内外对酶化学修饰的研究主要偏向于医药用酶,如木瓜蛋白酶[1]、天门冬酰胺酶[2]等化学修饰的研究,对于工业用酶化学修饰的研究不多.近年来国内外对酵母蔗糖酶化学修饰的研究极少.为此,本文以低分子的右旋糖苷为修饰剂,选用了L

16(45)正交试验方

案,探索不同修饰条件对酶化学修饰效果的影响以及修饰前后酶的性质变化,为酵母蔗糖酶的进一步研究利用提供理论依据.

1　材料与方法1.1　试验材料酵母蔗糖酶(Yeastinvertase,EC3.2.1.26)纯酶、2,4,6-三硝基苯磺酸水溶液(Trinitrobenzenesul2fonicacid,TNBS),购于美国Sigma公司.右旋糖苷(Dextran,平均相对分子质量为5000)购于深圳汉邦

多糖生物科技有限公司.考马斯亮蓝G-250购于美国Fluka公司,其他试剂为国产分析纯试剂.

1.2　修饰条件的筛选本试验选用L

16(45)正交试验方案对修饰条件

进行优化,正交试验因素条件设计如表1所示.

表1　正交试验因素Tab.1　Factoroforthogonalcomparisontest水平θ/℃t

修饰/h

pH

1444.022085.0330166.0445247.0

1.3　右旋糖苷的活化称取500mg右旋糖苷和125mg高碘酸钠溶于10mL蒸馏水中,4℃避光搅拌反应18h,用800μL乙二醇中止反应,4℃下静置2h

[3]

.取8mL上述混

合液,用Sephadex2G15凝胶层析柱(2cm×20cm

)

脱盐,4℃避光进行,用蒸馏水洗脱,流速为018mL・min-1,每5min在部分收集器上收集1管,每管4mL,用Fehling试剂检测含糖管,用w=2%的AgNO3检查脱盐效果,用硫酸-苯酚法测定活化的

右旋糖苷含量[4].

1.4　酶活力测定酶活力测定参照Huang等[5]的方法进行改进,

酶促反应体系pH415,反应温度55℃,反应时间10min,反应总体积为211mL.用DNS法[6]测定生

成的还原糖量.在上述反应条件下,将酶每分钟催化水解蔗糖产生1mg还原糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U).蛋白质含量的测定参照Bradford

[7]

的方法,以牛血清白蛋白为标准.糖含量测定参照杨晓华等[8]的方法,以葡萄糖为标准.氨基残留率的测定采用TNBS法[9],相同蛋白质浓度的酶液在修饰前

后D335nm之比即为氨基残留率.根据公式:氨基修饰率=1-氨基残留率,计算氨基修饰率.

1.5　酶的最适pH、最适温度、pH稳定性和热稳定性的测定酶的最适pH、最适温度、pH稳定性和热稳定性的测定参照Gómez等[10]的方法.酶的动力学测定参照余冰宾[11]研究酵母蔗糖酶动力学和动力学参数的方法,蔗糖的浓度设置为10、15、20、25、30、35和40

mmol・mL-1,每处理设2个重复,每重复设3个平行样.1.6　紫外吸收光谱测定酶液的蛋白质质量浓度为0125mg・mL

-1

,以

pH415缓冲液为对照,测定其紫外吸收光谱,波长190～400nm.荧光发射光谱测定:酶液的蛋白质质量浓度为0125mg・mL-1,在激发波长280nm条件下,测定其荧光发射光谱.

数据统计和方差分析用SPSS1310软件进行.方差分析中,F<91280表示差异不显著,91280500

表示差异显著,F>291500表示差异极显著.

2　结果与分析2.1　右旋糖苷修饰酵母蔗糖酶条件的筛选本试验综合考虑了反应体系中温度、反应时间、pH、温度与反应时间的交互作用的影响,试验结果见表2.极差分析结果表明,不同因素对修饰效果的影响为:修饰时间>温度>pH>温度×反应时间.

方差分析结果(表3)表明,反应时间对修饰效果影响差异极显著,温度和pH对修饰效果影响差异显著,

而温度与反应时间的交互作用对修饰效果影响差异不显著.

通过正交试验(表2)可以得到右旋糖苷修饰酵母蔗糖酶的最佳试验方案:即反应体系的pH为510,反应温度为20℃,反应时间为8h.以此方案进行实验,加入活化的右旋糖苷和蔗糖酶各25mg,同时,反应中添加01855g蔗糖作为酶保护剂.

94　第4期 伍志权等:右旋糖苷修饰酵母蔗糖酶条件的筛选及修饰酶性质的研究

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实验一 蔗糖酶活力测定

实验一 蔗糖酶活力测定

实验一蔗糖酶活力测定一、目的要求了解蔗糖酶的性质及3,5–二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活力的实验原理，熟练掌握其测定方法。

二、实验原理蔗糖酶（sucrase, EC 3.2.1.26）又称转化酶，蔗糖在其作用下，水解为D–葡萄糖与D–果糖。

酵母细胞含丰富的蔗糖酶（胞内酶），细胞破壁后释放出来的蔗糖酶可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是还原糖，其含量可通过3,5–二硝基水杨酸比色法测定，从而度量酶活力的大小。

蔗糖酶活力定义为：在35℃实验缓冲液条件下，每3min释放1mg还原糖的酶量为1酶活单位。

由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活，所以可用碱终止酶解反应。

3,5–二硝基水杨酸定糖法实验原理：利用3,5–二硝基水杨酸溶液和还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在520nm波长处有最大吸收峰，在一定范围内其吸光度与还原糖含量呈线性关系，可用于还原糖含量测定。

三、试剂和仪器（一）试剂1、3,5–二硝基水杨酸试剂（DNS）。

甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%NaOH，并用水稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g NaHSO3。

乙液：称取255 g酒石酸钾钠置于300 mL 10%NaOH中，再加入880 mL 1%3,5–二硝基水杨酸溶液。

将甲、乙两溶液混合即得到颜色呈黄色的使用液，贮于棕色瓶中，室温下放置7–10天后使用。

1、葡萄糖标准使用液（1mg/mL）：称取干燥的葡萄糖0.1000 g，溶于水并定溶至100 mL。

2、5%蔗糖溶液：称取5.00 g蔗糖用pH5.5 0.1mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置成100mL。

3、1mol/L NaOH。

(二)仪器1、电热恒温水浴锅。

2、721分光光度计。

1、秒表或手表。

四、操作方法1、标准曲线制备使用1cm比色皿，在520nm波长条件下，以试剂空白条零，测定各管吸光值。

用坐标纸绘制标准曲线；或用回归法计算求出以A520nm值为自变量，葡萄糖含量(mg)为因变量的直线方程。

酵母蔗糖酶的纯化及其化学修饰

酵母蔗糖酶的纯化及其化学修饰

第 ２ 卷 第 ６期 ９
２１ ０ ０年 １ １月
食 品 与 生 物 技 术 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｏ ｄ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄ Ｂｉｔｃ ｎ ｌｇ ｏ ｒ ａ ｆＦ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｏｅ ｈ ｏｏ ｙ
Ｖｏ ． ９ Ｎｏ ６ １２ ．
ＮＯ ． Ｖ ２ ０ ０１
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蔗糖酶的分离提纯

蔗糖酶的分离提纯

蔗糖酶的分离提纯【实验目的】1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。

2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。

【实验原理】蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。

蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。

它所催化的反应是：H OH OH H蔗糖+H OH OH H葡萄糖 果糖蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。

在微生物中，酵母中的含量很丰富。

在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。

我们实验室的研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。

从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。

【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂(1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲CH 2OHH OHHHOHCH 20H液；(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器(1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴；(4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表【实验操作】一、葡萄糖浓度标准曲线的制作1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。

重组右旋糖酐酶的表达、纯化及性质研究

重组右旋糖酐酶的表达、纯化及性质研究

重组右旋糖酐酶的表达、纯化及性质研究望魁甲;陈帅;卢大儒;朱化星;王笃强;廖远平;史秀娇;周加义;王晓;王海凤;王丁力;王英明【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2018(004)002【摘要】将LipomycesstarkeyiCGMCC 2.1390菌株的DEX基因进行PCR扩增并克隆至表达载体pPICZαA上,将重组质粒转化至Pichia pastorisX33细胞中进行甲醇诱导分泌表达.质粒转化至Pichia pastorisX33细胞中,经1％甲醇诱导72h 表达重组蛋白,培养基上清中DEX浓度和酶活力分别为14.3mg/L、25648U/L.重组蛋白经过两步层析纯化后,纯度为90％,酶活力回收率为58.4％,比活力为7130U/mg.重组DEX最适反应温度为35℃,最适反应pH值为5.0,酶在低于40℃、pH3.0～8.0稳定.以右旋糖酐20kDa为底物,酶的Km值为6.2×10-4mol/L,Vmax 值为4.0×10-3mol/min·L;以右旋糖酐70kDa为底物,酶的Km=7.4×10-5mol/L,Vm ax=3.0×10-3mol/min·L.Zn2+对酶活力有微弱促进作用,Ca2+对酶活力有轻微抑制.10％Sucrose有利于提高重组DEX的保存稳定性.【总页数】6页(P30-35)【作者】望魁甲;陈帅;卢大儒;朱化星;王笃强;廖远平;史秀娇;周加义;王晓;王海凤;王丁力;王英明【作者单位】吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;复旦大学生命科学学院,上海 200433;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;复旦大学生命科学学院,上海 200433;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;复旦大学生命科学学院,上海 200433;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222;吴江近岸蛋白质科技有限公司,江苏苏州 215222【正文语种】中文【中图分类】Q556+.2【相关文献】1.重组酶Xar的表达纯化及性质研究 [J], 王锐丽;叶兆伟;薛业敏2.重组水稻α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 李苏红;朱旻鹏;李拖平3.重组人糜蛋白酶表达、纯化和性质研究 [J], 刘晓;李素霞4.甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究 [J], 傅国平;崔中利;徐玮;吴旭平;李顺鹏5.来源于P.bacterium 1109的甘露醇脱氢酶的重组纯化及酶学性质研究 [J], 逯付之;徐炜;吴昊;张文立;光翠娥;沐万孟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。