黄芪总黄酮的改良提取方法

第２５卷第２期　２０１０年４月　川北医学院学报　

ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　Ｎ０ＲＴＨ　ＳＩＣＨＵＡＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＣＯＬＬＥＧＥ　Ｖｏ１．２５．Ｎｏ．２　

Ａｐｒ・２０１０　１０３　

黄芪总黄酮的改良提取方法木　

胥正敏　，陈建业‘，唐华英　，杨映雪　，张翔　，鄢佳程　

（１．川北医学院应用技术研究所；２．川北医学院药物研究所，四川南充６３７０００）　｜　警＿　

【摘要】目的：研究黄芪总黄酮（Ｔｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ，ＴＦＡ）的分离纯化方法。方法：以分析纯芦丁为标准，在　

２６０ｎｍ波长处检测黄芪粗提物、乙酸乙酯改良萃取法提取物和聚酰胺静态吸附法提取物的ＴＦＡ含量。结果与结论：乙酸乙　

酯改良萃取法提取物中ＴＦＡ含量高达７１．７％，而聚酰胺静态吸附法提取物中ＴＦＡ含量为２８．３％。　

【关键词】黄芪总黄酮；分离纯化；乙酸乙酯　

【文章编号】１００５—３６９７（２０１０）０２￣１０３—０３【中图分类号】Ｒ９６５．２【文献标识码】Ａ　

Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　

ＸＵ　Ｚｈｅｎｇ．ｍｉｎ　，ＣＨＥＮ　Ｊｉａｎ．ｙｅ。，ＴＡＮＧ　Ｈｕａ—ｙｉｎｇ　，ＹＡＮＧ　Ｙｉｎｇ．ｘｕｅ　，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｎｇ　，ＹＡＮ　Ｊｉａ．ｃｈｅｎｇ　

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｒｔｈ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ　

６３７０００，Ｃｈｉｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｏｆ　ａｓｔｒａｇａｌｕｓ（ＴＦＡ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：　

Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＴＦＡ　ｉｎ　ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｃｒｕｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｗｅｒｅ　ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ　

ｂｙ　ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　ｓｐｅｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　ａｔ　２６０ｎｍ，ｕｓｉｎｇ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｐｕｒｅ　ｒｕｔｏｓｉｄｅ　ａｓ　ａ　ｓｔａｎｄａｒｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ＴＦＡ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　

７１．７％ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｏｎｌｙ　２８．３％ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔａｔｉｃ　ｐｏｌｙａｍｉｄｅ　ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｅｘｔｒａｃｔ．　

【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｏｆ　ａｓｔｒａｇａｌｕｓ；Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　

黄芪含有多种生物活性成分，黄芪总黄酮（Ｔｏ－　

ｔａｌ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ，ＴＦＡ）就是黄芪的重要生　

理活性物质之一。近年来研究表明，ＴＦＡ具有抗氧　

化、抗损伤、抗突变、抗肿瘤等多种生物学效应…，　

为ＴＦＡ的临床应用拓展了广阔的空间。中药有效　

成分的常见分离方法有层析法和化学萃取法，如聚　

酰胺柱层析、硅胶柱层析、树脂柱层析　及乙醇萃　

取、丙酮萃取及乙酸乙酯萃取等　。中药有效成分　

的层析分离与化学分离各有优劣，尚无两种分离方　

法的比较研究报道。本研究拟比较聚酰胺层析与改　

良乙酸乙酯分离两种方法对ＴＦＡ得率和纯度的影　

响，探讨ＴＦＡ的最佳分离提取方法。　

基金项目：四川省科技厅重点项目（０５ＳＧ１８５９）、四川省科　技厅应用基础项目（２００６Ｊ１３—０３１）　作者简介：胥正敏（１９７８一），女，四川雅安人，硕士研究　生，主要从事分子药理学研究。　通讯作者：鄢佳程教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｃｙａｎ０８４１＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｎ．ＣＵ　收稿日期：２０１０一ｏｌ一２２　１材料和方法　

Ｉ．１　ＴＦＡ的传统乙醇粗提法：将干燥川产膜荚黄芪　

干燥根１０００克粉碎，经４０目筛成粗粉，按ｌｇ：１０ｍｌ　

的比例用９０％乙醇浸泡７２小时，其间不时搅拌、过　

滤、收集浸提液。将过滤后的浸渍黄芪根粗粉按１：１　

体积比加入９０％乙醇，用数控超声波清洗器（江苏　

昆山市超声仪器有限公司）于８０￣Ｃ水浴中超声萃取　

３０分钟，过滤、收集提取液。再将经超声提取的黄　

芪粉末均匀装入渗滤桶中，按１：１体积比加人９０％　

乙醇，搅拌均匀后渗滤，流出速度约４ｍｌ／ｍｉｎ，收集　

流出液。最后，将三种方法收集的乙醇提取液混匀，　

于室温下静置五天，收集上层液，去掉最底层析出　

物　。用滤纸过滤醇提取液，将滤液用旋转蒸发仪　

（ＢｎｃｈｉｈｅａｔｉｎｇｂａｔｈＢ４９０）浓缩至５１６ｍｌ得提取浓缩　

液，后者继续浓缩至干，得ＴＦＡ粗提物，称重后测定　

ＴＦＡ含量。　

１．２　ＴＦＡ的乙酸乙酯改良萃取法：取黄芪原料　

１

０００克，按前述的方法得到提取浓缩液。用三蒸水　１０４　第２５卷第２期　

２０１０年４月　川北医学院学报　Ｖｏ１．２５。Ｎｏ．２　

ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＮＯＲＴＨ　ＳＩＣＨＵＡＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ　ＣＯＬＬＥＧＥ　Ａｐｒ．２０１０　

按１０：ｌ的比例稀释浓缩液，再将稀释液和石油醚按　

１：１的比例混合均匀，随后将混和液加入分液漏斗中　

静置分层，弃上层红棕色油状液体，收集下层溶　

液　，旋转蒸发干燥后得到黄芪粗提物。按照１ｇ粗　

提物：３ｍｌ水饱和乙酸乙酯的比例加入水饱和乙酸　

乙酯，充分混匀萃取ＴＦＡ。收集上层乙酸乙酯，用　

１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ调节ｐＨ至ｌ０并充分混匀，静置收集　

下层含ＮａＯＨ的碱性液体，加盐酸调节ｐＨ至３。如　

上法，再按照１ｇ粗提物：３ｍｌ乙酸乙酯的比例加入　

水饱和乙酸乙酯进行二次萃取，合并两次乙酸乙酯　

萃取液，将其浓缩、干燥后得到固体ＴＦＡ提取物，称　

重并测定ＴＦＡ含量。　

１．３　ＴＦＡ的聚酰胺静态吸附法：取黄芪原料１０００　

克，按前述的方法得到ＴＦＡ粗提物，精确称取１．０ｇ　

ＴＦＡ粗提物，用乙醇溶解后，加入到已经处理好的聚　

酰胺层析柱中，放入３７℃恒温摇床中振摇２４小　

时　。用三蒸水洗柱，直至用斐林试剂定性检测流　

出液不显色为止。再分别用１倍聚酰胺体积的　

５０％、７０％和９０％乙醇梯度洗脱　，直至用氨液熏　

蒸后紫外光２５４ｎｍ下检测不到ＴＦＡ为止　。收集、　

合并洗脱液，经旋转蒸发仪浓缩得ＴＥＡ提取物。称　

重并测定ＴＦＡ含量。　

１．４标准曲线的制作：将芦丁标准品（成都曼思特生　

物科技有限公司）用甲醇配制成０．００８ｍｇ／ｍｌ、　０．０１６ｍｇ／ｍｌ、０．０２４ｍｇ／ｍｌ、０．０３２ｍｇ／ｍｌ、０．０４０ｍｇ／ｍｌ　．　

０．０４８ｍｇ／ｍｌ等不同浓度梯度的芦丁标准液，用　

ＴＵ１９０１紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责　

任公司）扫描检测２６０ｎｍ波长处的吸光度（Ａ）［９，１ｏ１，　

以吸光度（Ａ）对浓度（Ｃ）做线性回归、绘制标准曲线，　

得到回归方程［ｃ］＝一０．００３２９＋０．７４３１２［Ａ］（ｒ＝　

０．９９９７７）。结果表明，芦丁标准品在该检测浓度范围　

内有良好的线性关系。　

１．５供试品溶液的制备与含量测定：分别精确称取　

黄芪乙醇粗提物、乙酸乙酯改良萃取法提取物和聚　

酰胺柱静态吸附法提取物，用甲醇溶解定容，具体操　

作与标准曲线制作方法相同。　

２　结　果　

在芦丁标准曲线条件下，测得不同方法所得提　

取物中ＴＦＡ的含量结果见表１，乙酸乙酯改良萃取　

法与聚酰胺静态吸附法两种分离方法所得ＴＦＡ的　

得率结果见表２。结果显示，乙醇粗提物、聚酰胺静　

态吸附分离物与乙酸乙酯改良萃取物中ＴＦＡ的含　

量分别为３．７％、２８．３％和７１．７％。以乙酸乙酯改良　

萃取物中ＴＦＡ的含量最高；然而就ＴＦＡ的得率而　

言，乙酸乙酯萃取法为０．４４％、聚酰胺静态吸附分　

离法为１．１２％，以后者为高。　

表１　不同方法提取物中ＴＦＡ的含量　

３讨论　

ＴＦＡ是黄芪的重要药理成分之一，分离提取方　

法较多，主要有层析分离法、高效液相色谱分离法、　

普通溶剂萃取法与超临界流体萃取法等　。层析　

法分离ＴＦＡ，易受层析柱性质、层析柱装填介质的稳　定性及层析条件等因素的影响，这些影响因素不易　

调控；高效液相色谱与超临界流体萃取法分离ＴＦＡ，　

所需仪器设备昂贵、成本高、获得的样品量少，主要　

用于少量高纯度ＴＦＡ的分离纯化，不适宜作大量　

ＴＦＡ的分离提取；普通溶剂萃取法分离ＴＦＡ，虽可用　

于大量ＴＦＡ的分离提取，但提取物中ＴＦＡ的含量偏　第２５卷第２期　２０１０年４月　川北医学院学报　

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低、杂质较多。本实验对ＴＦＡ的乙酸乙酯萃取法进　

行了原理上的改良，在乙酸乙酯萃取的基础上，利用　

ＴＦＡ碱溶酸沉的化学性质，先将ｐＨ值调至碱性除　

去碱不溶性杂质，再将ｐＨ值调至酸性除去酸溶性　

杂质，经过简单调节乙酸乙酯萃取液的ｐＨ值即可　

得到纯度较高的ＴＦＡ。同时，实验不需高效液相色　

谱等昂贵精密仪器，仅需渗滤装置、分液漏斗、紫外　

分光光度计等简单设备，成本低廉、操作简便，可用　

于ＴＦＡ的大量生产。　

实验比较了聚酰胺静态吸附法与改良乙酸乙酯　

萃取法分离提取物中ＴＦＡ的含量与最终得率。结　

果表明，黄芪乙醇粗提物经聚酰胺静态吸附法分离　

后，ＴＦＡ含量由３．７％提高到２８．３％；经改良乙酸乙　

酯萃取法分离后，ＴＦＡ含量由３．７％提高到７１．７％。　

据报道　，黄芪根中黄芪异黄酮的含量为　

３．５４ｍｇ／ｇ，黄芪醇含量为０．４９ｍｇ／ｇ，此结果和我们　

用改良乙酸乙酯萃取法分离得到的ＴＦＡ得率比较　

接近。改良乙酸乙酯萃取法分离的ＴＦＡ纯度比聚　

酰胺静态吸附法所得的ＴＦＡ纯度高２．５倍，而后者　

的得率比前者高２．５倍，说明聚酰胺静态吸附法提　

取的ＴＦＡ中尚存不少杂质。由此可见，改良乙酸乙　

酯萃取法得到的药物不仅ＴＦＡ纯度高、成本低、耗　

时短，而且分离工艺简单，为大量生产较高纯度的　

ＴＦＡ提供了一条方便快捷的途径，为黄芪药物资源　

的精细加工与开发利用奠定了基础。　【参考文献】　

［１］　汪德清，田亚平，向　兰．黄芪总黄酮生物活性作用的化学成　

分基础研究［Ｊ］．军医进修学院学报，２００６，２７（１）：１３—１５　

［２］　郭雪峰，岳永德．黄酮类化合物的提取分离纯化和含量测定方　

法的研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２００７，３５（２６）：８０８３—８０８６　

［３］　徐莲英，陶建生，冯　怡，等．中药制剂发展的回顾［Ｊ］．中成　

药，２０００，２２（Ｉ）：６—２１　

［４］　唐课文，周春山，钟世安，等．聚酰胺树脂对茶多酚和咖啡因吸　附选择性研究［Ｊ］．光谱学与光谱分析，２００５，２３（１）：１４３—１４５　

［５］　张福海，马丽娟．黄芪乙酸乙酯层有效成分的分离及鉴定　

［Ｊ］．中医药信息。２００７，２４（３）：４５—４６