何首乌肝毒性物质基础探索研究

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 何首乌肝毒性物质基础探索研究 作者：杨敏 刘婷 冯伟红 回连强 李娆娆 刘晓谦 陈安家 李春 王智民 来源：《中国中药杂志》2016年第07期

[摘要]通过观察何首乌中蒽醌类成分对HepG2细胞的细胞毒作用，并通过精密肝切片技术对细胞毒成分进行验证，探讨何首乌致肝毒性的物质基础。运用MTT法检测何首乌中游离蒽醌、结合蒽醌及柰类共11个单体成分对HepG2细胞的毒性。将有明确细胞毒的成分与大鼠肝切片共同培养6 h后制备肝组织匀浆，通过BCA 法测定匀浆液中蛋白含量，连续监测法测定并计算每1 μg蛋白中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ谷氨酰氨基转肽酶（GGT）和乳酸脱氢酶（LDH）的漏出率，以考察这些成分对肝组织的毒性作用。细胞试验结果显示，只有大黄酸、大黄素、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷和大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷显示一定的细胞毒作用，其IC50分别为7107，12562，24227，40232 μmol·L-1，而其他7个化合物的毒性很小。肝切片试验结果显示，大黄酸400 μmol·L-1组能引起肝切片ALT，AST，LDH漏出率的显著升高（P

[关键词]何首乌；蒽醌类成分；肝细胞毒性；精密肝切片技术；肝毒性物质基础 [Abstract]By observing the cytotoxic effects of anthraquinones on HepG2 cell and using the precisioncut liver slices technique to authenticate the cytotoxic constituents， the paper aims to explore the material basis of Polygonum multiflorum root to cause liver toxicity Firstly， MTT method was used to detect the effect of 11 anthraquinone derivatives on HepG2 cell Then， the clear cytotoxic ingredients were cocultured with rat liver slices for 6h respectively， and the liver tissue homogenate was prepared BCA method was used to determine the content of protein in the homogenate and continuous monitoring method was used to monitor the leakage of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， gammaglutamine amino transpeptidase （GGT） and lactate dehydrogenase （LDH） The toxic effect of these ingredients on liver tissue was tested by calculating the leakage rate of the monitored enzymes As a result， rhein， emodin， physcion8OβDglucopyranoside and physcion8O（6′Oacetyl）βDglucopyranoside showed cytotoxic effects on HepG2 cell and their IC50 values were 7107， 12562， 24227， 40232 μmol·L-1 respectively， but the other 7 compounds are less toxic and their IC50 values can not be calculated The precisioncut liver slices tests showed that rhein group of 400 μmol·L-1 concentration significantly increased the leakage rate of ALT， AST and LDH （P

[Key words]Polygonum multiflorum root； anthraquinones； hepatoxicity； precisioncut liver slices technique； hepatoxic constituents

doi：10.4268/cjcmm20160721 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 何首乌始载于唐元和七年（公元813年）李翱《何首乌录》[1]，为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便、补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效[2]，在医疗、保健及美容方面应用极其广泛。近年来何首乌及相关制剂引起肝毒性的报道日益增多[37]，其安全性问题引起了广泛的关注。何首乌导致肝毒性的原因到底是外源性因素还是内源性因素，迄今尚无令人信服的结论。从内源性因素看，主流观点认为是其中的某些化学成分或其代谢物对肝细胞可能有一定毒性。文献报道显示，何首乌醇提物和水提物均可造成肝损伤[810]，且醇提物的毒性相对较大[1113]。何首乌中主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类及磷脂类等化学成分[14]。与水提物相比，醇提物中的蒽醌类成分较多[1516]；故而现阶段多认为“蒽醌致毒”[1719]，进而聚焦于游离蒽醌上，如大黄素、 大黄酸作为主要贡献者[18]；用LCMS研究肝脏L02细胞对大黄素的摄取和蓄积时发现，大黄素可进入细胞质，并在细胞中蓄积之后产生毒性作用[19]；通过肝细胞凋亡发现，制首乌组及大黄酚组肝细胞凋亡指数与空白对照组比较有明显增加，从而得出大黄酚有可能是导致肝细胞凋亡的主要成分的结论[20]。

与上述结论矛盾的是，大量数据显示“生首乌毒性大于制首乌”[2123]，而制首乌中的游离蒽醌含量又远远高于生首乌，蒽醌苷却远远低于生首乌[24]；若“游离蒽醌致毒”的话，逻辑上制首乌的肝毒性应大于生首乌，与事实不符；再者，大黄的蒽醌含量远高于何首乌，为何其毒性较低，也侧面说明“游离蒽醌致毒”一说的依据不足。此外，虽有零星报道何首乌中结合蒽醌（大黄素8OβD葡萄糖苷[25]）对肝细胞的作用，但至今未见肝毒性报道，因此“蒽醌苷类致毒”一说也存在较大疑问。

为此，作者对何首乌主要蒽醌类成分进行细胞毒性筛选，通过观察游离蒽醌及其苷对HepG2细胞作用来筛选有肝细胞毒作用的成分，并从构毒关系上找出规律；再通过精密肝切片技术对有确切细胞毒的成分进行验证，以确认“蒽醌致毒”的真实性，为何首乌临床安全用药提供依据。

1材料 大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素（中国食品药品检定研究院，批号分别为110796201017，110757200206，110795201007）；大黄酚8OβD葡萄糖苷，大黄素1OβD葡萄糖苷，决明酮8OβD葡萄糖苷（成都克洛玛生物科技有限公司，批号分别为150114，141211，150302）；大黄素甲醚（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号D00414072）；大黄素，大黄素8OβD葡萄糖苷，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷，大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷由本实验室自制获得，通过NMR和MS鉴定其结构，HPLC检测其纯度均大于98%。化学结构见图1。

MEM培养液（美国Gibco公司，LotNo 1707776）；胎牛血清（FBS）（美国Gibco 公司，Lot No 1414426）；DMEM培养液（美国 Gibco公司，LotNo 8115143）；025% TrypsinEDTA（美国Gibco 公司，LotNo 1638591）；PBS（Solarbio公司，LotNo 20150408）；二甲基亚砜（DMSO）和MTT为Solarbio公司产品。天门冬氨酸氨基转移酶试龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 剂盒、丙氨酸氨基转移酶试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒、γ谷氨酰氨基转肽酶试剂盒（北京万泰德瑞诊断技术有限公司，批号分别为GG5101A，GG5104A，XJ5105B，GG5103A）；琼脂糖（英国OXOID limited 公司，批号84867402）；BCA法微量蛋白测试盒 （南京建成生物工程研究所，批号20151204）。

Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪，HERA Cell CO2培养箱 （德国），超净工作台 （北京冠鹏净化设备有限责任公司）；BCD286超低温冰箱（博西华家用电器有限公司）；Startorious BT125D电子分析天平（赛多利斯科学仪器）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；纯水仪（美国Millipore公司）；DSZ5000x倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司）；低速离心机（上海手术器械厂）；1000 Plus Vibracome 振荡切片机（英国），Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪（美国），东芝TBA40FR全自动生化分析仪。

HepG2 细胞（人肝癌细胞）购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。 SD大鼠，雄性，体重180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK（京）20120001。

2方法 21细胞毒性试验 211药品配制分别精密称取大黄素27 mg，芦荟大黄素 27 mg，大黄酚25 mg，大黄素甲醚28 mg，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷45 mg，大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷49 mg，大黄素1OβD葡萄糖苷43 mg，大黄酸28 mg，大黄素8OβD葡萄糖苷43 mg，大黄酚8OβD葡萄糖苷42 mg，决明酮8OβD葡萄糖苷41 mg，各加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL 溶解，备用。在无菌、避光条件下将配好的母液用含10% FBS的MEM培养液稀释成所需浓度，分别装入灭菌后的 EP管中，混匀。其中，大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷、大黄素甲醚8O（6′O乙酰基）βD葡萄糖苷、大黄素1OβD葡萄糖苷7个成分的母液经倍比稀释后分别配制成浓度为400，100，25，625 μmol·L-1的样品溶液进行测定。大黄酸、大黄素8OβD葡萄糖苷、大黄酚8OβD葡萄糖苷和决明酮8OβD葡萄糖苷4个成分的母液经倍比稀释后分别配制成浓度为400，100，25，625，156，039 μmol·L-1的样品溶液进行测定。以上样品溶液中DMSO的终浓度均为04%。