饲料研究FEED RESEARCH NO .5,2011
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综述
荷叶中黄酮提取及测定方法的研究进展
邓源喜 李 妍 许 晖 孙兰萍安徽蚌埠学院生物与食品工程系
收稿日期：2011 - 01 - 26
基金项目：2010年度院级自然科学研究项目（2010ZR12）通信作者：邓源喜
荷叶系睡莲科植物莲的叶片，除了含有糖类、蛋白质、脂类等营养成分外，还含有多种生物活性物质。
因此，其在食品及药品方面均有较广泛的应用。
荷叶黄酮类成分是荷叶中含有的一类重要的药理活性物质。
许多研究表明：叶中的黄酮类成分具有抗氧化、抗自由基、调血脂、抑菌和抗病毒等多种生理活性功能。
对荷叶中黄酮类物质的化学成分、提取、分离和纯化及测定方法的国内外研究，旨在为荷叶黄酮类物质的进一步研究提供参考。
1 荷叶黄酮类物质的化学成分研究
黄酮类物质指具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，是以C 6-C 3-C 6结构为基本母核的天然产物，常以游离态或与糖结合成甙的形式存在，可分为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类和黄烷酮类等。
广义的范围还包含查耳酮、嗅酮 、异黄烷酮及茶多酚。
荷叶中黄酮类化合物主要是荷叶苷，其次是槲皮素、异槲皮素等，且槲皮素多以结合苷的形式存在。
此外，关于双黄酮类的原花青素、黄烷酮类的无色花青素与无色翠雀花素等方面的研究也有所报道。
田娜通过分离纯化荷叶的乙醇/水提取物，并通过光谱解析鉴定，得到了金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素4种黄酮类单体物质，其中紫云英苷是首次从荷叶中分离获得的。
张赟彬等用高速逆流色谱（HSCCC）分离纯化荷叶提取物，结合薄层层析(TLC)和颜色反应，分析结果表明：分离得到的2种化合物均为黄酮醇类化合物，分别为槲皮素-3-丙酯和山奈酚。
韦红对分离纯化后得到的荷
叶黄酮制品，采用高效液相色谱（HPLC）分析其中组成，并对未知组分进一步分离纯化，通过紫外光谱(UV)、HPLC 和核磁共振(NMR)等手段分析，结果显示出，荷叶中含有芦丁和棚皮素，其中芦丁为首次从荷叶中分离获得。
吕静对经大孔树脂分离、重结晶和纯化得到的荷叶黄酮类成分进行结构分类鉴定和分析，最后分离得到异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷。
王玲玲等将荷叶乙醇提取物经大孔树脂分离后，采用各种柱色谱法进行分离纯化,根据理化性质及光谱数据鉴定结构，结果分离鉴定了8个黄酮类化合物分别为，异鼠李素、山奈酚、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、紫云英苷、柯伊利素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷和金丝桃苷；其中化合物异鼠李素、槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷和柯伊利素-7-O-β-D-葡萄糖苷为首次从荷叶中分离得到。
另外，古山春夫采用大孔吸附树脂、聚酰胺柱、Sephadex LH-20柱和有机溶剂法对荷叶提取液进行分离纯化，利用化学方法结合HPLC、UV、X-射线单晶衍射（MS）和NMR 等波谱技术对化合物进行结构研究，从pH8提取液中分离出3种黄酮类化合物，分别为槲皮素3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷、异槲皮苷和槲皮素，其中槲皮素3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷为首次在荷叶中发现。
2 荷叶黄酮类物质的提取、分离纯化及测定
方法研究
2.1 荷叶黄酮类物质的提取
黄酮类化合物一般易溶于碱水，酸化后又可沉淀析出。
其原因：一是由于黄酮酚羟基的酸性；二
DOI:10.13557/ki.issn1002-2813.2011.05.001
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是由于黄酮母核在碱性条件下开环，形成2’-羟基查耳酮，极性增大而溶解。
目前，荷叶黄酮类物质的提取方法主要有热水提取法、乙醇/水溶剂提取法、超声波法和微波协同萃取法。
游离的黄酮类化合物一般难溶于水，易溶于甲醇、乙醇和乙醚等有机溶剂，而黄酮甙一般易溶于热水、甲醇、乙醇和吡啶等有机溶剂。
荷叶中的黄酮类化合物即属于甙类，所以可采用热水提取。
陈海光等研究了采用热水浸提荷叶黄酮类物质的工艺，通过正交试验确定其水提的最佳工艺条件：提取温度为80 ℃，提取时间为1.5 h，固液比1：30，黄酮提取得率为1.57 %。
黄酮体的甙元不溶于水，只能溶于乙醇等有机溶剂。
因此，采用水提法不能将荷叶中的黄酮甙元提取出来,而采用乙醇/水溶剂提取法可以提高其浸提率。
钟先锋等研究了其最佳渗提条件：渗提固液比为1：25，乙醇质量浓度65 %，渗提温度为35 ℃，渗提时间为2.5 h。
李强得出荷叶黄酮的最佳浸提条件：料液比1：30，浸提温度80 ℃，乙醇溶液质量浓度70 ％，浸提时间2 h。
在最佳浸提条件下对荷叶浸提3次，荷叶黄酮含量达到36.19 mg/g。
另外，江慎华等对乙酸乙酯、正己烷萃、正丁醇和水4种不同极性萃取组分的总黄酮含量分别进行了测定研究，结果显示，不同极性萃取组分总黄酮含量存在较大的差别，且乙酸乙酯萃取组分的含量最高，为（894.45±41.75）mg/g。
蒋益虹通过正交试验并结合人工神经网络，优化了荷叶黄酮提取的工艺条件，提高了黄酮的浸提率，减少了生产成本，降低了能耗。
其优化工艺为固液比1：30，乙醇质量浓度50 %，提取温度75 ℃，提取时间1 h。
超声波提取是利用超声波的空化作用来加速植物有效成分的浸出，从而加快提取速度和提高提取率的。
赵骏等研究利用超声法提取荷叶黄酮苷，结果表明：料液比1：25，超声处理40 min，黄酮苷收率为9.2 %。
微波协同萃取技术是近几年发展较快且应用较多的一种新工艺。
欧阳明采用微波协同萃取技术，即以乙醇水溶液结合微波照射浸提荷叶黄酮，结果
显示，以60 %乙醇水溶液作提取剂，固液比1：30、微波照射1.5 min、浸提2.5 h，荷叶黄酮物质的浸出最多。
赵骏等也研究了采用微波法协同萃取荷叶黄酮，研究表明：以微波功率80 W，乙醇体积
比60 %，微波时间30 min，料液比1：25为工艺条件，黄酮苷的收率高达10.68 %。
但是也有结果显示，在一定功率下，随着微波时间的延长，荷叶黄酮物质的萃取率会迅速上升，如时间过长也可能会造成黄酮类物质的分解。
靳素荣等研究表明：以乙醇体积比50 %、微波2 min、微波功率420 W 和料液比1：30，在此工艺条件下黄酮的提取率为4.08 %。
徐曌分别采用溶剂热提取法、微波辅助法的提取法和超声法3种方法研究了荷叶黄酮类物质的最佳提取工艺，结果黄酮的提取率分别为4.74 %、4.08 %和4.85 %。
可见，3种提取方法相比，超声法提取荷叶黄酮类物质的提取率较高。
2.2 荷叶黄酮类物质的分离纯化
荷叶中的槲皮素多以结合苷的形式存在，所以测定水解后的槲皮素含量可作为荷叶中黄酮类成分的质量评价指标。
近年来，荷叶黄酮类物质的分离纯化主要采用TLC 法、大孔吸附树脂法和高速逆流色谱法。
邬晓鸥等研究采用TLC 法鉴别荷叶中的黄酮苷元，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(5：4：1)展开，5 %的三氯化铝乙醇溶液显色，放置紫外光灯(365 nm)下检视，结果发现，荷叶中叶绿素含量较高，在紫外光下显数个较强红色荧光斑点，对黄酮苷元的检出影响较大，后来采用氯仿-石油醚混合溶液脱色后，可消除其影响。
张蕾研究了采用大孔树脂富集法分离荷叶黄酮类物质，结果表明：AB-8型大孔吸附树脂对荷叶黄酮有较好的吸附分离性能，经过AB-8型大孔吸附树脂的精制，荷叶黄酮的含量达到59.31 %。
韦红通过静态吸附—解吸试验，研究了从HZ-801、HZ-802、HZ-803和HZ-806 这4种树脂中筛选出HZ-806大孔吸附树脂对荷叶黄酮进行纯化处理，结果显示，产品纯度由28.97 %提高到了89.04 %。
欧阳明通过试验也证实：以pH 9，荷叶黄酮质量浓
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度≤25 g/L的提取液，在4.7 BV/h流速下过DA201树脂柱，再用4.5 BV/h流速的丙酮洗脱处理，荷叶黄酮类物质可以被较好的分离纯化。
单斌将荷叶黄酮提取物经离心、过滤、减压蒸馏和调pH等反复处理后经AB-8大孔树脂柱进行富集和洗脱，最后得到2种黄酮混合物：50 %乙醇洗脱部分，占总黄酮量约6 %，纯度约为40 %；70 %乙醇洗脱部分占总黄酮量约90 %，经真空干燥后得棕黄色粉末，纯度为84.43 %。
李彩侠等分别采用3种方法对荷叶提取物进行分离纯化，并结合TLC和颜色反应对各分离组分跟随鉴定，研究结果显示：HSCCC分离效果最好，SephadexLH.Zo柱层析分离效果次之，硅胶柱层析分离效果最差;荷叶提取物经高速逆流色谱分离纯化，可以得到2种黄酮醇类单体。
2.3 荷叶黄酮类物质的测定方法
目前，国内外对荷叶总黄酮含量的分析测定方法无公开普遍的质量控制标准，一般采用分光光度法（比色法）和HPLC法。
分光光度法是对3,5位羟基含量较多的黄酮类成分的测定，采用在亚硝酸盐存在时, A1(NO3)3在碱性条件下与黄酮形成络合物,在一定波长下有最大吸收峰的特点, 以芦丁为标准溶液进行紫外分光光度法的比色分析测定的。
因黄酮结构在碱性溶液中稳定性差，且操作繁琐，樊淑彦等研究了利用黄酮类成分与KAc-AlCl3体系反应形成络合物分的特点，通过在紫外波长414.2 nm处进行比色法分析，结果显示：荷叶总黄酮的含量为5.08 %，平均回收率为101.2 %，RSD=2.41 %(n=5)。
该方法对组成相对稳定的体系而言，作为简便和快捷的量性分析手段是可行的，但是在杂质较多的情况下，荷叶中的杂质与黄酮类成分的结合物增加了测定的吸光度,使化学吸光法测得的荷叶黄酮浸提物含量偏高。
HPLC法是通过荷叶浸提液的HPLC图显示而测定的。
因黄酮类成分结构多样,很难逐一分析,故采用酸水解法先将黄酮苷水解为黄酮苷元后,用HPLC法测定其苷元含量,以槲皮素为标样折换成具体含量。
古山春夫研究采用HPLC测定各化合物在提取液中的含量，pH8提取液中的槲皮素3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷、异槲皮苷和槲皮素的含量分别为158.39、131.68和93.69 μg/mL(提取液)。
邬晓鸥等以甲醇-0.4 %磷酸溶液(48：52)为流动相，流速1 mL/min，检测波长为360 nm，并以槲皮素绘制标准曲线，在0.025 6～0.512 μg范围内呈良好线性关系。
在此条件下测定5批荷叶黄酮的含量，分别为0.609 %、0.528 %、0.612 %、0.654 %和0.535 %。
周兰香等以甲醇-0.4%磷酸(1：1)的流动相、检测波长360 nm、流速1 mL/min、进样量20 μL和室温为HPLC的色谱条件，吸取一定量酸水解的浓缩浸提液与槲皮素对照品溶液各20 μL进样，测定荷叶黄酮的含量为1.183 %，平均回收率为98.12 %，RSD=1.12 % (n=5)；后来经过将其与分光光度法的结果进行比较，结果分光光度法测的总黄酮含量4.43 %，比HPLC 的分析数据明显要高，分析原因可能与分光光度法有杂质干扰及HPLC法是单组分分析对照，不能全面反应总黄酮含量有关。
由此可见，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH体系与黄酮形成络合物的化学吸光分析法, 简便快捷,线性关系好,条件一致时,可比性强,结合HPLC分析数据进行修正可作为定量分析的参考依据,这为探索最佳提取工艺和中间指标
3 结语
我国荷叶资源十分丰富，从荷叶中提取的黄酮类物质安全，无毒无害。
目前，黄酮类化合物是国内外植物化学在食品及医药保健领域研究的一大热点。
随着人们对荷叶黄酮类物质研究的不断深入，荷叶黄酮的提取、分离纯化及测定技术的工艺条件将更加成熟，荷叶黄酮类物质的综合应用也将更加广泛。
通信地址：安徽省蚌埠市曹山路1866号蚌埠
学院生物与食品工程系 233000
饲料研究FEED RESEARCH NO.5,2011。
