第3节植物原生质体培养

不被染色，死亡的被染上色。 • 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显
微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。
第2节、原生质体分离及纯化
四、影响原生质体分离的因素
➢ 从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质 体
➢ 但对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、 最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响
➢ 多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由于它的钝性及扩散 入原生质体的速度很慢的缘故，来保证一个稳定的渗透压
第2节、原生质体分离及纯化
➢ 叶肉细胞是常用的材料, 叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展 开的幼嫩叶片
➢ 愈伤组织或悬浮细胞，避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控 制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒
A
B
C
第2节、原生质体分离及纯化
2、酶液及酶解方法
➢ 用来分离植物原生质体的酶制剂 ➢ 纤维素酶、半纤维素酶：降解构成细胞壁的纤维素 ➢ 果胶酶：降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及细胞与细 胞分开 ➢ 酶解花粉母细胞和四分体小孢子时还要加入蜗牛酶 ➢ 离析酶（果胶酶）
➢ 纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶在0.1%-1%，但也有例外
第2节、原生质体分离及纯化
3.分离培养基
➢ 常用的配制分3 离渗原透生压质：体原酶生液质的体溶操 液作 以需 及要 洗涤在原一生定质渗体透的压溶存液在为下进行，
CPW液
分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原生质体的溶液为 盐成分为：
➢ CPW盐成分为
（3）分离原生质体
方法有二：
两步分离法
一步分离法
第2节、原生质体分离及纯化

Organogenesis
Somatic genetics
Protoplast system
Cell physiology
Cell fusion
Organelle, DNA uptake
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Cell cloning
意义
• 植物细胞育种中的核质替换 • 细胞质杂种的获得 • 远缘杂交创造新物种细胞 • 细胞器的互作研究
• 酚藏花红染色法（0.1%)
• 酚藏花红能使无活力的原 生质体染成红色，有活力 的原生质体不着色。
❖ 伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能 够摄取这种染料，活细胞不摄取。
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影响原生质体数量和活力的因素
• 供试材料及预处理方法 • 酶解条件：
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原生质体分离的方法
酶解分离法 机械分 离 法
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机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液
中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原 生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组 织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
• 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种 类受到限制。
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植物原生质体的分离和培养
Flash
❖ 材料预处理 ❖ 原生质体分离的方法 ❖ 原生质体纯化 ❖ 原生质体活力测定 ❖ 影响原生质体数量和活力的因素 ❖ 原生质体培养方法 ❖ 影响原生质体培养的因素 ❖ 原生质体再生过程
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用于分离原生质体的材料
材料预处理
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某 些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4℃处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才 能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体， 才能获得高产量。

第二节 细胞培养生产有用物质


ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ



许多生活物质，包括药物、染料、香料、色 素等来源于植物，属于植物次生代谢产物； 传统方法：植物种植，适当时间获取植物相 关部位，提取(溶剂法、蒸馏法)； 植物细胞培养成功，激发人们利用该体系， 作为有用物质的来源； 40年代后期，Bonner报道了银胶菊植物组织 培养物能产生橡胶； 30多种化合物在组织培养物中的积累等于或 超过其原植物的产量；
细胞生长动态
2. 连续培养



连续培养(continuous culture)是利用特制的培 养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式； 不断排掉用过的培养基，注人新鲜培养基， 容积保持恒定下，营养物质不断得到补充。 连续培养有封闭型和开放型之分 ① 封闭型 细胞经机械方法收集起来之后，又被放回到 培养系统中；细胞总量不断增加；
细胞生长与次生物质合成



用于次生产物生产的植物组织培养物类型， 通常有五种，组织培养，器官培养，再生器 官培养、细胞培养和混合类型 很多研究说明，生长迅速而未分化的细胞培 养物一般不积累或很少积累为其原植物所含 有的次生产物，它们的合成通常要求在形态 上和生化上有某种程度的分化，生长较缓慢 的组织中 细胞生长与次生物质合成矛盾必须得到完善 的解决；
悬浮细胞的优势



悬浮培养与固体培养比较有三个优点： 一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善 营养供应； 二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有 害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； 三是振荡培养可以适当改善气体的交换。
Callus Formation ….…
一、细胞的分离

[重点难点]组织培养的概念、组织培养的类型、特点和应用第一节组织培养的概念一、组织培养的概念是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。

二、组织培养的特点：取材少生长周期短繁殖率高。

人工控制条件管理方便三、培养的研究类型组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养等：第三节组织培养应用及展望一、快速繁殖种苗组织培养的快速繁殖，就是应用组织培养和细胞培养技术，快速繁衍珍稀濒危植物。

二、无病毒苗的培养三、在育种上的应用，。

四、工厂化育苗参考文献1、颜昌敬编著植物组织培养手册1990.1 上海科技出版社，2、朱建华主编植物组织培养实用技术2002.1 中国升量出版社3、梅家训、丁习武主编组培快繁技术及其应用2003.4 中国农业出版社4、李浚明编译．植物组织培养教程[第2版]．北京：2004.1中国农业大学出版社，[单元章节]第一章实验室及培养条件[教学目的]基本掌基握组织培养实验室的设计；熟练掌握实验仪器设备使用和培养基用湿热灭菌方法以及无菌操作技术。

[重点难点]的条件。

[教学方法]启发式；讲授；多媒体课件；演示。

[教学时数]2课时。

[教学内容]第一节实验室及基本操作一、实验室（一）准备室(repairing room)在准备室内要完成培养基制备、清洗与整理工作。

为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：大型工作台、药品柜、普通冰箱、电子分析天平和托盘天平、电蒸馏水器、磁力搅拌器、电炉或电饭锅、酸度计、高压灭菌锅等。

（二）接种室(transfering room)1、对接种室要求2、接种室的主要设备及用具（三）培养室(culturing room)培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。

培养材料放在培养架上培养。

培养条件:培养室一般保持在20-27℃左右，相对湿度以保持在70％-80％为好，一般需要每天光照10-16h。