荧光原位杂交ppt课件

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重物 支持平台
玻璃板
吸水纸
湿滤纸 膜 胶 湿滤纸 湿滤纸桥
20×SSC
毛细管虹吸法Southern转膜示意图
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玻璃容器 24
5. 探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法
制备探针、标记。
6. Southern杂交
（1） 预杂交 封闭膜上所有能与DNA结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）4～6小时
⑵ 液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放
在液体中进行杂交反应。
两种杂交形式的基本原理都是一样的。
从发展历史来看,先有液相杂交,后有固—液相杂交.
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四、核酸分子杂交的过程—DNA的变性与复性
1.变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸
碱或紫外线照射，可以导致两条DNA链之间的氢键断
裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、
如尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核
酸分子。
除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主
要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易变性，而
AT含量高的DNA容易变性。另外,环状DNA比线性DNA难于变性.
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2.复性
DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链DNA分
（2） 杂交 （过夜）
7. 杂交结果的检测
（1） 放射线标记——放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；
（2） 非放射线标记——直接显出杂交带，进行检测。
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②
③ ①
分子杂交实验过程 .
目录
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பைடு நூலகம் 射 自 显 影 照 片

常用探针类型 — 重复序列探针
重复序列探针的结合位点是基因组中多拷 贝的短重复碱基对序列（例如着丝粒和端 粒探针）所在的染色体区域。 着丝粒常常是A-T丰富区，而端粒已知含有 TTAGGG序列。由于重复序列相对容易制 备和分辨率较高（0.5Mb），这种FISH被 普遍用于筛查一般的染色体非整倍体、亚 端粒缺失和标记染色体。
杂交流程
a.两要素：
探针和靶序列 b.标记探针
直接标记和间接标记
c.变性 探针和靶序列成为单链 d.混合杂交 e.间接标记探针需连接 荧光基团的步骤
FISH
荧光标记的DNA探针 （200-500bp）
荧光原位杂交特点

与其它原位杂交技术相比，FISH的优点：
①经济安全，快速方便； ②敏感性高，特异性强，背景低； ③宜于多靶杂交，对同一标本同时进行多个探针杂 交，不同的探针可以显示不同的荧光颜色； ④使用G带玻片可作出回顾性分析；

结合技术相关检测项目
染色体病快速产前诊断（FISH、qPCR、 BoBs） 产前单基因病诊断 SNP Array 检测 某些代谢病的产前诊断

项目意义

较羊水染色体分析，FISH技术可以确定13、18、21、X、Y的染色体 数目信息，缓解唐筛阳性患者或高龄孕妇精神负担；缓解医生核型分 析工作压力，能够有针对性的对样本进行处理。
工作基础
探针 商品化探针 原位杂交仪 Luminex xMAP 液相芯片检测平台

工作基础
工作人员 1）项目负责人 刘红卫，男，妇产科实验室技术负责人，毕业 于四川大学生物工程系遗传学专业，临床遗传优 生专业副主任医师，丰富的技术操作和管理能力。 2）项目组成员 赵少志，男，检验师，四川大学华西医院医学 遗传学硕士，中国遗传医学中心、医学遗传学国 家培训中心学员。

2. 杂交条件
（1） 杂交液 ① 钠盐（SSC液）： ↑杂交效率 （5×,4×,2×SSC液） ② 甲酰胺： ↓杂交所需温度（50%） ③ 硫酸葡聚糖： ↑探针有效浓度 ④ 牛血清白蛋白和载体DNA或RNA等： ↓背景 （ 阻断探针与组织非特异结合）
2. 杂交条件
（2） 探针浓度 探针浓度影响杂交速度
底物:NBT/BCIP 报告分子:AP 抗体
第一节 原位杂交技术的原理
使含有特异序列、经过标记的核酸单链即 探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸 单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免 疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在 细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
原位杂交技术的原理
一、 核酸分子杂交
（一）探针 （二）标记 （三）靶核酸分子 （四）原位分子杂交
二、杂交体的探测
使标记的杂交体在光镜或电镜下可见 （一）免疫细胞化学方法：
非放射性标记物
（二）放射自显影方法 放射性标记物
（一）免疫细胞化学方法
依据免疫细胞化学原理显示探针标记物
外加抗原
可以标记在核酸探针上，并能够被抗体结合。
抗原抗体反应+显色反应
外加生物素
可以标记在核酸探针上，并能够结合亲和素。
光镜或电镜水平
原位杂交技术的应用
对特定生理或病理条件下从DNA到mRNA到 蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分 析，是研究基因表达强有力的手段。
如细胞学,产前诊断,肿瘤,病毒学等，特别是将肿瘤的病因学、发病 学、诊断学和治疗学等方面的研究提高到基因水平。
原位杂交技术
第一节 原位杂交技术的原理 第二节 原位杂交方法
2. 杂交条件
（4）pH pH在5-9范围内，杂交体形成不受影响 常用缓冲液pH为6.5-7.5

END
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
原位杂交技术原理及其应用
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
Байду номын сангаас
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。

原位杂交技术原理及其应用讲解学习
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
Байду номын сангаас60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左