荧光原位杂交演示文稿

荧光原位杂交实验步骤嘿，咱今儿个就来讲讲这荧光原位杂交实验步骤哈！这实验呢，就像是一场精心编排的舞蹈，每一个步骤都得踩准点儿。

先说说样本准备吧，这就好比是给舞蹈演员选好合适的服装和道具。

得把样本处理得妥妥当当的，不能有一点儿马虎。

要是样本没弄好，那后面的步骤可就都白搭啦！你说这重要不？接下来是探针标记，这就像是给舞蹈演员化上独特的妆容，让他们在舞台上更加耀眼。

得把探针标记得精准无误，这样才能在后续的过程中准确找到目标呀。

然后就是杂交啦！这就好像是舞蹈演员们在舞台上开始尽情舞动。

要让探针和样本完美结合，就像舞者之间的默契配合一样。

这可不是随随便便就能做到的哟！杂交之后还得进行洗涤，这就好比是舞蹈结束后给演员们清理一下身上的汗水和灰尘。

把那些多余的、不需要的东西都洗掉，只留下最精华的部分。

再之后就是检测啦！这就像是观众们在欣赏舞蹈表演，要能清楚地看到演员们的精彩表现。

通过检测，我们才能知道实验的结果到底怎么样。

最后是分析数据，这就像是对舞蹈表演进行评价和总结。

看看哪些地方做得好，哪些地方还需要改进。

这一步可不能小瞧，它能让我们不断进步呢！你想想看，要是在实验过程中有一步没做好，那不就跟舞蹈中有人跳错了步子一样明显吗？所以啊，每一个步骤都得仔仔细细、认认真真地去做。

做这个实验就跟盖房子似的，每一块砖都得放稳了，房子才能坚固。

咱可不能图快就马马虎虎地做，那最后肯定得出问题呀！这荧光原位杂交实验可是个精细活儿，得有耐心、有细心，还得有那么点儿小技巧。

咱可不能小看了这些步骤，它们就像是一个个小环节，串起来才能完成这个大实验。

就像那句话说的，“千里之行，始于足下”，咱得一步一个脚印地把这实验做好。

总之呢，这荧光原位杂交实验步骤可都不简单，每一步都得用心去对待。

只有这样，咱才能在实验中取得好的结果，才能真正领略到科学的魅力呀！你说是不是这个理儿？。

荧光原位杂交（FISH）综述摘要本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。

关键词：荧光原位杂交;1.发展荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。

荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。

1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。

2.原理通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。

由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。

原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。

所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。

只有这样染色体DNA才能与探针杂交。

变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。

3.关于探针的发展早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。

灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。

如果使用低辐射能的放射性标记物，如3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。

FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）1.实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。

掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。

荧光原位杂交步骤
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲荧光原位杂交这档子事儿的步骤哈。

首先呢，你得准备好你的样本，这就好比要做饭得先有食材呀！样
本处理得精细妥当，这可是基础中的基础呢。

然后呢，就是探针的准备啦。

这探针就像是一把钥匙，得找对了才
能打开那扇神秘的知识大门哟！精心挑选和制备合适的探针，那可不
能马虎。

接下来呀，就是杂交啦！把样本和探针放在一起，让它们亲密接触，就好像一场浪漫的约会，得让它们好好相处，产生奇妙的反应呢。

这
过程可得小心翼翼，温度啦、时间啦，都得把握得恰到好处，不然可
就搞砸咯！
再之后呢，就是洗去那些多余的东西啦。

就跟咱洗脸似的，把那些
不需要的脏东西洗掉，只留下最精华的部分。

这一步可不能随便，得
仔仔细细地洗干净。

然后呢，就是检测啦！看看杂交的效果怎么样，是不是达到了我们
想要的结果。

这就跟验收成果一样，满心期待着能有个好的呈现。

最后呀，就是分析数据啦！这可需要咱瞪大了眼睛，仔细去琢磨、
去研究。

就好像侦探在找线索一样，从那些数据里找出我们需要的信息。

你想想啊，这荧光原位杂交就像是一场精心编排的舞蹈，每个步骤
都是一个优美的动作，只有每个动作都做到位了，这场舞蹈才能精彩
绝伦呀！咱可不能在任何一个步骤上掉以轻心，不然怎么能得到准确
又可靠的结果呢？
所以啊，朋友们，要想把荧光原位杂交做好，就得一步一步慢慢来，就像盖房子一样，一砖一瓦都得垒好咯！咱得用心去对待每一个环节，这样才能在科学的海洋里畅游无阻呀！你们说是不是这个理儿呢？。

硕士学位论文荧光原位杂交技术及其在环境领域内应用Fluorescence in situ hybridization technology and its application inthe field of environment作者姓名： **学科、专业：环境科学与工程学号： ********指导教师： ***完成日期： /3/26大连理工大学Dalian University of Technology摘要荧光原位杂交（FISH）是当代分子生物学及基因工程中广泛应用新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。

总结了某些实验核心环节操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面应用做了综述。

运用FISH技术在环境样品上直接原位杂交，不但可以测定不可培养微生物形态特性及丰度，并且可原位分析它们空间及数量分布。

并且展望了FISH技术将来。

核心词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH）is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle，process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps，and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples，can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms，but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology；Probe；Environmental microbes；monitoring目录摘要............................................................................................. 错误!未定义书签。

荧光原位杂交实验（FISH）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

1实验方法原理：荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。

目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。

FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。

由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。

与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。

实验四荧光原位杂交实验一、实验目的1.掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作；2.熟练掌握荧光显微镜的使用方法；3.掌握Image J软件进行图像融合的方法；4.理解荧光原位杂交技术的应用。

二、实验原理核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测。

两条互补的核苷酸单链在特定条件下退火形成异质双链；应用荧光标记的探针与待检测材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可悲检测的杂交双链核酸。

在显微镜下观察并记录结果。

本实验所用探针是位点特异性标记探针GSP myc，是由SpectrumOrange （552/576）直接标记的荧光DNA探针，长度为200bp，能识别8号染色体的着丝粒部位的α卫星序列。

三、实验器材和试剂防脱载玻片（premiere公司），医用砂轮，20×20mm盖玻片，橡皮胶，平板加热器，杂交盒，恒温水浴锅，玻璃染色缸，香柏油，荧光显微镜拍照系统，MYC基因扩增检测试剂盒。

四、实验步骤1.样品处理1）取细胞培养悬液5ml（107 cell）,2000rpm离心5min，去上清；2）加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min；3）37℃水浴箱低渗30min；4）加固定液2ml，吹打混匀，室温预固定10min；5）2000rpm离心5min，去上清；6）沉淀加固定液5~10ml，吹打混匀，-20℃冰箱静置30min；7）2000rpm离心5min，去上清。

2.制片1）取一张干净的载玻片，用砂轮在背面划“一”标记，尽量在中间或靠下端标记；2）加50ul固定液重悬细胞，取4ul悬液滴加到载玻片上的标记位置，室温晾干；3）平板加热器上烤片，60℃30min，显微镜下观察细胞密度；4）PBS洗涤3min；5）1%多聚甲醛室温固定10min；6）PBS洗涤3min；7）70%、90%、100%梯度乙醇脱水2min；8）取出玻片，室温晾干。

荧光原位杂交（FISH）前处理实验步骤详解及案例分析FISH样本前处理真的头疼样本本身的差异，实验多因素的影响都可能会影响杂交效率导致探针信号不佳别着急今天小编以乳腺癌FFPE样本为例从实验步骤的原理入手为你梳理FISH实验前处理实验步骤标本要求1. 标本的类型（1）手术切除标本；（2）粗针穿刺活检标本；（3）麦默通活检标本；（4）大于100个癌细胞的细胞学标本。

2. 标本的固定所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定（1h内）。

固定时应将标本每隔5～10mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。

固定液量与所浸泡组织的比例应足够。

固定时间以6～72h为宜。

3. 固定液类型3.7%中性（磷酸缓冲）甲醛固定液。

4. 切片厚度以4～5μm为宜。

——对标本的要求来源于《乳腺癌HER2检测指南（2019版）》。

需要注意：1.标本固定的两个时间点很关键。

一要及时固定（1h内）。

固定不及时，细胞发生自溶，DNA降解，DAPI下观察，标本呈现核很浅，甚至有糜烂现象，信号无或缺失严重。

二要注意固定时间以6～72h为宜。

对于小的穿刺标本，建议固定6-24小时，而手术切除的大标本以24小时以上为佳。

2.切片厚度影响。

切片太薄（实际厚度<3um），容易消化过，且信号出现很大比例的丢失，影响结果判读（图1）；切片太厚（实际厚度>5um），难于消化，容易出现高背景，信号层面增多影响观察判读（图2）。

图1 切片太薄FFPE样本杂交图（HER2探针，Ｘ1000倍）图2 切片太厚FFPE样本杂交图（HER2探针，Ｘ1000倍）实验步骤分解1. 玻片预处理1.1 玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；【使组织细胞紧紧粘附，后续洗涤等处理时不至于脱落；烤片后立即脱蜡，可减短脱蜡时间、增强脱蜡效果，烤片不短于两小时。

】1.2 取出玻片，将其放入二甲苯中室温脱蜡30分钟；【相似相溶原理，可用环保试剂代替二甲苯。

】1.3 取出玻片，再将其放入另一缸二甲苯室温继续脱蜡10分钟；1.4 取出玻片，再将其放入无水乙醇中室温10分钟；【去除残留二甲苯。