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西洋参病害土壤细菌和真菌的分离与拮抗菌株的筛选鉴定邓华宁指导教师：孙艳（陕西师范大学生命科学学院，陕西西安，710119）摘要：为了寻找解决西洋参连作障碍的生物防治方法，我们分离出4年生西洋参病害土壤里的真菌和细菌，依据形态学特征，我们得到15株真菌，并用马丁氏培养基斜面保存，得到114株细菌并保种于甘油里，在4℃冰箱保存，初筛是用细菌的发酵液来检测细菌是否抑制真菌的生长，具体的做法是在真菌培养皿中涂布上真菌孢子悬液，然后将培养基过中心均匀划分为6个区域，每个区域内用打孔机打出8mm直径的小孔，其中5个里面注入不同细菌的发酵液，剩下的一个小孔注入蒸馏水作空白对照，通过此抑菌实验筛选出具有抑制真菌生长的细菌有：C1抑制P7，C11、B2抑制P6，A40抑制C1，A14、B45、B28抑制J3，A22抑制J4，C14抑制J6，A5抑制J10，将产生拮抗效果的细菌和真菌进行种类鉴定，细菌采用16sRNA比对的方法进行鉴定，真菌采用ist比对的方法进行鉴定；上述结果将会为西洋参产业化生产扫清障碍，也会帮助到种植西洋参的农民，当然，也对菌种种类的鉴定和作用机理的探索打好了基础。
关键字：西洋参；拮抗菌；筛选西洋参（Panax quinquefolium L.）属于五加科人参(P anax)属植物，多年生草本或木本植物，根部呈梭子形，根表面光滑细腻并显浅黄色，平均长度为25cm，切成参片有透喉效果，切面光滑且有纹理。
能较好的生长于海拔1000米左右的山坡，散射光能更好的促进其生长，沙子含量高的土壤是其适宜的生长地[1]。
最早发现于威斯康辛州（美国）的森林地带，加拿大南部与中国都生长着一些。
西洋参植株根部人参皂苷含量最高[2-3]，在我国河北、北京、陕西和山东等地已形成规模化种植[4]，具有调节中枢神经、提高免疫力、抗肿瘤、保护心血管系统等作用[5]。
近年来西洋参的市场需求量不断增大，但其种植方面问题突出，深受连作障碍困扰[6]。
土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告学院：生命科学学院班级： 2013级生科2班组长：刘瑜 2013506076组员：汤界世 2013506070李宇秀 2013506071于淑婷 2013506075陈洁作 2013506079郑国梁 2013506083 2015年10月15日一、实验目的1、了解采集土样的要求和方法。
2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。
3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。
4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。
二、实验原理土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。
一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。
若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。
然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。
由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得放线菌。
放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。
其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。
基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。
基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。
气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。
孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。
螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。
孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。
根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。
三、实验材料试剂与仪器设备1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g）2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.42）其他：10ml无菌水、重铬酸钾3、仪器设备：干热高压锅、电热炉、超净工作台、生化培养箱、离心、摇床、电子天秤、采土铲、细目筛、药勺、称量纸、试管架、记号笔、打孔器、镊子、圆滤纸片、1ml吸管、无菌漏斗、培养皿、大烧杯（500ml）、涂玻棒、接种环、酒精灯、试管四、实验步骤1.1土壤样品的采集：在待测田块上，若田块面积小于50㎡，则按对角线三点采样，否则按对角线五点采样。
拮抗性放线菌的筛选实验心得
对峙培养筛选拮抗性放线菌时因多次向平板中移入菌片，很容易受杂菌污染，所以无菌操作至关重要；滤器使用前一定要检查气密性，针筒活塞下压并能自动弹回恢复，则气密性良好；否则抗生素过滤除菌不完全会有杂菌污染；得到的所有菌株都要妥善保藏，以免关键时刻无法找到，影响实验进度；减压蒸馏提取抗生素时，控制旋转薄膜蒸发器温度在45-50℃之间，否则温度太高抗生素遇高温易降解；萃取时注意油相与水相是否分离完全，分液时将水相彻底排除干净；测定MIC时，滤纸片浸泡时间要一致，而且滤纸片的距离也要相当，否则测定值不准确。
每次实验课所需器材和药品。
菌种：放线菌制片：插片法培养，培养了4天的平板培养物10个，每皿插15片。
米酒酵母斜面培养物或平板培养物：2天，6支(皿)黑曲霉平板培养物：72h，6皿米根霉平板培养物：72h，6皿青霉平板培养物：48h，5皿。
土壤拮抗放线菌S-5210-6的筛选及其初步分类鉴定疏秀林;安德荣;张勤福;马驰【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2004(032)012【摘要】从秦岭山区不同海拔、不同植被类型土壤中分离出750株放线菌,对其进行皿内琼脂平板、放线菌发酵液及拮抗菌单胞菌的拮抗性筛选.结果表明,S-5210-6号菌株对稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum leonard)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)、番茄早疫病菌(Altermaria solani)、小麦白粉病菌(Erysiphe graminis)8种供试病原真菌具有强烈的拮抗和溶菌作用,根据其形态特征、培养特征、生理生化特征及细胞壁化学成分分析,确定其归属于链霉菌属(Streptomyces).【总页数】5页(P57-60,64)【作者】疏秀林;安德荣;张勤福;马驰【作者单位】西北农林科技大学,植保学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,植保学院,陕西,杨凌,712100;西安海浪生物研究所,陕西,西安,710000;西安海浪生物研究所,陕西,西安,710000【正文语种】中文【中图分类】S154.38+3【相关文献】1.药用植物土壤中拮抗放线菌的分离、筛选及初步鉴定 [J], 潘争艳;傅俊范;刘博;周如军;王慧2.高放射土壤中拮抗放线菌菌株的筛选及鉴定 [J], 李阳;李健强;宋素琴;王静;楚敏3.土壤拮抗放线菌的筛选及YYHS-2菌株的分类 [J], 孙丹凤;杨翔华;朴玉华4.展青霉素产生菌拮抗放线菌的分离、筛选与初步鉴定 [J], 朱从会;师俊玲;杨保伟;令贞民;王瑞5.一株辣椒内生拮抗放线菌的筛选及初步鉴定 [J], 黄军;曾艳;蔡长平;毕世宇;黄彬彬;郭照辉;刘清术因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
土壤拮抗放线菌的分离、筛选及鉴定闫建芳;刘秋;刘志恒;胡树仁;曲蕾蕾;樊慧梅;王福妹【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2006(000)003【摘要】从辽宁及新疆土壤中分离到293株放线菌,筛选出对瓜类枯萎病菌有拮抗作用的放线菌菌株69株,其中高拮抗活性菌株13株.通过对13株拮抗放线菌的培养特征、形态特征、细胞壁组分分析表明,属于链霉菌属的8株,属于链轮丝菌属的4株,属于放线多孢菌属的1株.链霉菌属与链轮丝菌属的细胞壁类型均为Ⅰ型,放线多孢菌属的细胞壁类型为Ⅳ型.【总页数】3页(P78-80)【作者】闫建芳;刘秋;刘志恒;胡树仁;曲蕾蕾;樊慧梅;王福妹【作者单位】沈阳农业大学植物保护学院,辽宁,沈阳,110161;大连民族学院生物工程系,辽宁,大连,116600;大连民族学院生物工程系,辽宁,大连,116600;沈阳农业大学植物保护学院,辽宁,沈阳,110161;大连民族学院生物工程系,辽宁,大连,116600;大连民族学院生物工程系,辽宁,大连,116600;沈阳农业大学植物保护学院,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学植物保护学院,辽宁,沈阳,110161【正文语种】中文【中图分类】Q939.13【相关文献】1.药用植物土壤中拮抗放线菌的分离、筛选及初步鉴定 [J], 潘争艳;傅俊范;刘博;周如军;王慧2.水霉拮抗放线菌的分离、筛选与鉴定 [J], 陈飘;罗玉双;张永丽;杨敏;张紫根3.人参病原菌拮抗放线菌的分离筛选与鉴定 [J], 史册;韩梅;张一鸣;郭双双;杨利民4.茶炭疽病拮抗放线菌的分离筛选与鉴定 [J], 刘红艳;李维;向芬;周琳;丁玎;曾振;周凌云5.凤丹根腐病拮抗放线菌的分离筛选及鉴定 [J], 王雪;王冉;王晔;丁东玲;位诗棋;郑艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拮抗放线菌菌株FS-4发酵工艺筛选拮抗放线菌菌株FS-4是一株具有较强拮抗活性的菌株，对多种植物病原真菌具有抑制作用。
要想将其应用于植物病害的防治，首先需要解决的问题就是菌株的发酵工艺。
本文将重点对拮抗放线菌菌株FS-4的发酵工艺进行筛选，以期为其在农业生产中的应用奠定基础。
一、菌株特性拮抗放线菌菌株FS-4是从自然界中分离得到的一株拮抗活性较强的微生物菌株，具有较高的抗病活性。
经过初步的鉴定和筛选，确定了其为一株优质的拮抗放线菌菌株，有望成为一种潜在的生物农药资源。
为了更好地发挥其拮抗活性，需要对其进行深入的研究和开发利用。
而要进行菌株的深入研究和利用，首先要解决的问题就是菌株的发酵工艺，只有通过良好的发酵工艺，才能够大规模地生产出所需的拮抗活性物质。
二、发酵培养基的筛选发酵培养基是影响微生物发酵生长和代谢产物生成的重要因素之一，合适的培养基可以提供足够的营养物质和生长条件，从而促进微生物的生长和代谢过程。
为了确定拮抗放线菌菌株FS-4的最佳发酵培养基，本研究在初步的试验基础上，筛选了多种不同成分的培养基，包括液体培养基和固体培养基。
通过对不同培养基中菌株生长繁殖情况和拮抗活性物质产量的比较，最终确定了最佳的发酵培养基组成，为后续的发酵工艺提供了重要的基础。
三、培养条件的优化培养条件的优化对于微生物的发酵生产至关重要，包括温度、pH值、发酵时间和搅拌速率等因素。
在本研究中，我们通过单因素试验和正交试验的方法，对拮抗放线菌菌株FS-4的发酵条件进行了系统的优化。
通过对不同培养温度、不同初始pH值、不同发酵时间和不同搅拌速率下菌株生长和代谢产物生成的影响进行比较，最终确定了最佳的发酵条件，为进一步的大规模发酵生产提供了重要的参考。
四、发酵工艺的建立在优化发酵条件的基础上，我们建立了拮抗放线菌菌株FS-4的发酵工艺，包括预处理、接种、发酵、分离和提取等环节。
通过对每个环节的工艺参数进行合理的设计和调整，最终建立了一个高效稳定的发酵工艺，实现了对菌株生长和拮抗活性物质产量的有效控制和提高。
第33卷 第1期西北农林科技大学学报(自然科学版)V o l.33N o.1 2005年1月Jour.of N o rthw est Sci2T ech U niv.of A gri.and Fo r.(N at.Sci.Ed.)Jan.2005拮抗放线菌的筛选培养基与筛选方法研究Ξ高 鹏,薛泉宏,常显波,封 晔(西北农林科技大学资源环境学院,陕西杨凌712100) [摘 要] 从黄土高原人工植被土壤中分离得到若干放线菌,研究了从中筛选的50株拮抗性放线菌在不同培养基上对8种供试靶标菌的拮抗性。
结果表明:①在黄豆粉琼脂和玉米粉琼脂培养基上,放线菌生长较好,在PDA 和高氏1号琼脂培养基上生长次之。
玉米粉和黄豆粉琼脂均可作为拮抗性放线菌的筛选培养基。
②反向放置琼脂块是筛选拮抗性放线菌的一种有效且可靠的方法。
③筛选拮抗性放线菌时,制备琼脂块的培养时间应控制在8～12d,培养时间过长将会导致拮抗作用减弱。
④筛选得到的50株供试放线菌中对辣椒疫霉、黄瓜枯萎菌、棉花枯萎菌、西瓜枯萎菌、青霉、假丝酵母、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌有拮抗性的放线菌株数分别为27,26,33,36,35, 29,35和20株。
[关键词] 放线菌;培养基;拮抗菌筛选;拮抗性试验[中图分类号] Q939.92 [文献标识码] A[文章编号] 167129387(2005)0120059205 放线菌能产生多种抗生素。
拮抗性放线菌的筛选是新医药和新农药开发的重要基础性工作。
拮抗性放线菌的筛选培养基通常采用黄豆粉琼脂培养基[1～5],但有时发现在其他培养基上,有些放线菌的拮抗圈远大于黄豆粉琼脂培养基。
目前,对黄豆粉琼脂培养基以外的抗生素产生菌筛选培养基研究很少[6],为了寻求更适合于拮抗性放线菌筛选的培养基和琼脂块放置方法,本试验初步研究了培养基种类、琼脂块放置方式及培养时间对50株拮抗性放线菌的拮抗性,旨在探索拮抗性放线菌筛选的适宜培养基与筛选方法。
药用植物土壤中拮抗放线菌的分离、筛选及初步鉴定
潘争艳;傅俊范;刘博;周如军;王慧
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2007(000)003
【摘要】从五味子、穿山龙、人参等19份辽宁药用植物土壤样品中共分离到放线菌272株,采用对峙培养法筛选到对穿山龙黑斑病病原菌有拮抗性菌株38株,复筛结果表明:菌株LJG66,SWJ225,SWJ211对人参锈腐病病原菌,穿山龙黑斑病病原菌,草莓灰霉病病原菌抑菌效果均较好.其中,SWJ225的96 h发酵液对穿山龙黑斑病抑菌圈直径可达到30 mm.经初步鉴定,3株放线菌均属链霉菌属.
【总页数】3页(P67-68,95)
【作者】潘争艳;傅俊范;刘博;周如军;王慧
【作者单位】沈阳农业大学,植物保护学院,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,植物保护学院,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,植物保护学院,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,植物保护学院,辽宁,沈阳,110161;沈阳农业大学,植物保护学院,辽宁,沈
阳,110161
【正文语种】中文
【中图分类】S476+.1
【相关文献】
1.土壤拮抗放线菌的分离与筛选效果研究 [J], 刘炳源;周晶
2.药用植物麦冬土壤中拮抗放线菌的分离和筛选 [J], 裴冬丽;张红岩;刘苗;李成伟
3.缙云山土壤拮抗放线菌的分离、筛选与发酵条件优化 [J], 张攀;陈林;彭玉梅;马冠华;孙现超
4.展青霉素产生菌拮抗放线菌的分离、筛选与初步鉴定 [J], 朱从会;师俊玲;杨保伟;令贞民;王瑞
5.柑橘溃疡病土壤拮抗放线菌的分离及菌株A16初步鉴定 [J], 姚廷山;周常勇;胡军华;冉春;李鸿筠;刘浩强
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土壤拮抗放线菌的分离与筛选效果研究刘炳源;周晶【摘要】针对青海地区不同类型的土壤进行放线菌的分离、筛选。
结果表明，10-3倍土壤稀释浓度为分离放线菌的最佳土壤稀释浓度；重铬酸钾是一种高效、方便、廉价的杂菌抑制剂，共筛得102株形态各异的放线菌，有32株菌分别对9种指示菌有较强的拮抗性，26株对不同细菌有较强抑菌活性，6株对真菌有抑菌活性，其中第24号放线菌对不同的指示菌的拮抗性最好。
%Actinomycetes in different types of soil from Qinghai Area were isolated and screened. The results showed that the best soil diluted concentration for separating Actinomyces was 10-3 times. Heavy chromic acid potassium was a kind of high efficient,convenient,inexpensive,mixed bacteria inhibitors,and 102 strains Actinomycetes with different morphology were screened,in which32 strains had stronger mineralocorticoid resistance on 9 indication bacteria respectively ,26 strains had a inhibitor on different bacteria ,6 strains had antibacterial activity on fungus ,the mineralocorticoid resistance of 24th Actinomycetes was the best for different instructions.【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2013(000)017【总页数】3页(P225-226,228)【关键词】放线菌;分离;拮抗性;筛选【作者】刘炳源;周晶【作者单位】曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜 273165;曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜 273165【正文语种】中文【中图分类】Q939.13+2农用抗生素作为生物农药，以其高效、低毒、无残留等优点在农作物病虫害防治中发挥着重要作用[1-2]。
拮抗放线菌菌株FS-4发酵工艺筛选随着抗生素的广泛应用，许多细菌基因已经产生了耐药性，这使得许多感染疾病的治疗变得越来越困难。
因此，需要寻求新的抗生素来治疗这些耐药细菌引起的感染疾病。
拮抗放线菌菌株FS-4是一种由土壤细菌分离得出的抗生素菌株。
它能产生可用于治疗耐药菌的抗生素，因此对于生命科学研究来说具有极大价值。
然而，在FS-4菌株的发酵过程中，存在一些问题，如培养条件、培养物配方等，这些问题会导致抗生素的产量低下的问题。
为了解决这个问题，需要对FS-4菌株的发酵工艺进行筛选。
发酵工艺筛选是一种通过逐步改变发酵参数来优化菌株的生长和代谢，从而达到最优化产量的方法。
本文将探讨使用发酵工艺筛选FS-4菌株的过程，并优化发酵参数，以提高菌株的生长和抗生素产量。
首先，要确定FS-4菌株的生长要求。
通常，这包括培养基成分、菌落大小、温度和pH。
为了确定FS-4菌株的最佳生长条件，可以使用不同的发酵培养基来进行试验。
在这个过程中，我们可以改变培养基的成分，包括碳源和氮源的含量、无机盐和微量元素，从而找到最适合FS-4菌株生长的培养基。
其次，需要优化FS-4菌株的发酵温度。
温度是影响微生物生长和代谢的主要因素之一，高温和低温都会影响细胞的代谢活性。
为了确定FS-4菌株最适合的温度，可以使用不同的温度进行试验，了解最适合FS-4菌株生长和代谢的温度范围。
最后，需要寻找激素、碳源、氮源以及催化剂等可以提高FS-4菌株生物产量的添加剂。
这些添加剂的选择应基于FS-4菌株的生长要求和代谢途径。
在进行筛选过程中，需要收集样品并进行菌落计数、COD、溶氧率、PH、细胞容积等测试，以评估FS-4菌株的生长率和代谢过程。
通过对收集的数据进行统计分析并比较，可以选择最佳的发酵条件，从而达到最大化FS-4菌株的生长和抗生素产量的目的。
综上所述，拮抗放线菌菌株FS-4的发酵工艺筛选是一种优化生产抗生素的重要方法。
在这个过程中，需要对FS-4菌株的生长需求、发酵温度、pH和添加剂等方面进行筛选和优化，在最佳条件下提高菌株的生长和抗生素生产量，为治疗耐药性细菌感染提供更多的可能。
黄瓜白粉病拮抗放线菌的筛选、鉴定及活性评价
王海利;张晓慷;王滢秀;蒋爱忠;韩金涛;左伯军;张新刚
【期刊名称】《世界农药》
【年(卷),期】2022(44)6
【摘要】为了获取对黄瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)具有一定拮抗作用的放线菌,对黄瓜根际土壤放线菌进行筛选鉴定及活性评价。
结果为从黄瓜根际土壤中共分离出放线菌108株,其中一株对黄瓜白粉病菌具有较高拮抗活性(放线菌SDNY-40)。
该放线菌上清液原液施用后7 d和14 d对盆栽黄瓜白粉病防效分别达到了95.7%和87.9%。
利用分子生物学及系统进化树进行分类鉴定,发现其与紫色链霉菌属(Streptomyces sp.)为同一种属。
通过对SDNY-40上清液进行室内盆栽防效测定,发现其对黄瓜白粉病菌具有较好的防效,具有生防潜力。
【总页数】6页(P35-39)
【作者】王海利;张晓慷;王滢秀;蒋爱忠;韩金涛;左伯军;张新刚
【作者单位】山东省农药科学研究院
【正文语种】中文
【中图分类】TQ455
【相关文献】
1.黄瓜白粉病拮抗细菌 Bs-18的筛选与鉴定
2.番茄灰霉病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及其活性评价
3.番茄灰霉病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及其活性评价
4.黄瓜
白粉病拮抗细菌的筛选与鉴定及其防病机理5.黄瓜白粉病拮抗细菌的筛选鉴定及其生防效果
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土壤拮抗放线菌S-5210-6活性产物抑菌谱及其作用机制为了明确拮抗性放线菌S-5210-6在植物病害生物防治中的实用价值,并为其后续的生防制剂的研发提供科学依据,在离体条件下采用生长速率法和抑菌圈法和在活体条件下采用盆栽法对其活性产物的抑菌谱进行测定.结果表明,在离体条件下S-5210-6活性产物对病原细菌具有选择性抑制作用,对供试的病原真菌均有较强的抑制作用;在温室条件下,对专性寄生病原菌黄瓜霜霉病菌,不仅能阻止其菌丝的入侵,而且对已侵入的菌丝有很好的治疗作用.采用生长速率法和孢子萌发法对S-5210-6菌株活性产物作用机制进行了研究,结果表明,S-5210-6菌株活性产物不仅能强烈抑制病原菌菌丝的生长和分生孢子的萌发,而且经S-5210-6活性产物处理的病原菌菌丝和初萌发的分生孢子,接种寄主植物后,其致病性明显减弱,病斑的扩展减慢,且致病性的减弱程度与活性产物的浓度呈正相关关系.苹果腐烂病菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及发酵条件的优化苹果腐烂病是由V alsa mali Miyable et Y amada引起的一种真菌性病害。
中国于1916年在辽宁南部发现该病,1948-1949年及1960年曾两度在辽南地区大流行,造成了严重的经济损失。
随着化学农药引起的环境污染以及人们公认的3R(抗性、残毒、再猖獗)问题的出现,利用自然环境中的拮抗微生物防治植物病害愈来愈受到人们的重视。
本文旨在从广东省中山市采集的土样中分离、筛选出对苹果腐烂病菌有较强拮抗作用的放线菌,并对拮抗菌株进行初步鉴定及对其发酵条件进行研究,以期为苹果腐烂病的防治提供新的解决方案。
主要研究内容及结果如下: 1对从广东省采集的土样进行热处理及化学处理,以降低常规放线菌的出现几率,然后通过稀释平板法对原土样及处理土样同时进行分离,共获得放线菌293株。
其中,未处理、热处理及苯酚处理的土样分离得到的菌株数量分别为214、22、57株,试验结果表明,经过一定处理的土样分离得到菌株的数量明显减少,同时稀有放线菌的数量可能有所增加。
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定一、培养基1 放线菌培养基高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
黄豆粉固体培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，过滤保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂15g，H2O 1000mL，初始pH7.0。
放线菌发酵培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始pH7.0。
2 放线菌形态及培养特征研究用培养基察氏培养基（ISP1）：蔗糖30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。
麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽膏10.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。
燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片20g（加1000mL 水煮20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL），微量盐溶液1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。
甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。
无机盐淀粉培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，CaCO32.0g，(NH4)2SO42.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，pH 7.4。
马铃薯培养基：去皮马铃薯块200g（1000 毫升水，80℃煮１小时，然后离心或过滤得上清液），葡萄糖20g，pH 7.4。
营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5.0g，H2O 1000mL，pH 7.4（亦可补加葡萄糖10g）。
葡萄糖-天门冬酰胺培养基：葡萄糖10g，L-天门冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g，牛肉膏2g，H2O 1000mL，pH 7.2。
3 测定生理生化特性供试培养基淀粉水解测定培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO45.65g，NaCl 0.5g，KNO31g，MgCO31g，琼脂15g，H2O 1000mL，pH 7.2~7.4。
纤维素水解培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，H2O1000mL。
滤纸条（5cm×0.8cm）灭菌20 分钟。
（pH7.0～7.2）明胶液化培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，H2O 1000mL，明胶灭菌10min，pH7.0（灭菌3 次，每次20min，灭菌后立即浸入冷水中冷却。
）牛奶凝固与胨化培养基：脱脂牛奶1000mL，CaCO30.02g，pH 7.2~7.4，间歇灭菌三次（脱脂牛奶的制备：取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心（3000r/min，10min）脱脂，除去上层油脂，即得脱脂牛奶）。
石蕊溶液配制：称取2.5g 石蕊浸泡在100ml 蒸馏水中过夜，使石蕊充分溶解，然后过滤备用。
石蕊牛奶的制备：2.5％的石蕊液与脱脂牛奶以4：100（V/V）比例混合，牛奶呈紫丁香色，分装于试管中，灭菌备用。
接种前抽检灭菌是否彻底。
硫化氢产生测试培养基（柴斯钠培养基）：蛋白胨10g，柠檬酸铁0.5g，K2HPO41g，琼脂15g ，H2O 1000mL，pH 7.2。
黑色素产生培养基：酪氨酸（L-Tyr）1g，酵母膏1g，NaCl 8.5g，琼脂20g，H2O1000mL，pH 7.2。
硝酸盐还原试验培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，NaCl0.5g，H2O 1000mL，A 溶液：对氨基苯磺酸0.5g，醋酸（80％醋酸，加2 倍水稀释）150mL；B 溶液：二苯胺0.1g，H2O 20mL)二苯胺试剂（二苯胺0.5 g 溶于100 mL 浓硫酸中，用20 mL 蒸馏水稀释）碳源利用培养基：（NH4）2SO4 2.64g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgS04.7H2O 0.5g，CuSO4.5H2O 0.0064g，FeSO4.7H2O 0.0011g，MnC12.4H2O 0.0079g，ZnsO4.7H2O 0.00l5g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL。
二、实验操作步骤1拮抗菌的形态鉴定1）菌株形态学特征观察采用插片法，将菌株接种到高氏一号培养基（固体培养基）中盖玻片与培养基的内侧交界线上，置于28℃培养7、14、28 d。
用无菌镊子小心取出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在洁净载玻片上直接镜检。
2）菌株的培养特征观察将菌株接种到察氏琼脂、葡萄糖-天门冬素琼脂、酵母膏-麦牙浸膏琼脂(ISP2)、燕麦片琼脂（ISP3）、无机盐淀粉琼脂(ISP4)、甘油-天门冬素琼脂（ISP5）、马玲薯琼脂，置于28℃培养，分别在7、14、28 d 后观察其孢子链、气生菌丝体颜色（即孢子链未形成前的颜色）、基质菌丝体的颜色和是否产生可溶性色素。
取成熟期的颜色特征为其培养特征，作为定种的依据。
2 菌株的生理生化特性的测定1）明胶液化试验在明胶培养基表面(斜面)接种鉴定菌，28℃下培养30d，在第5、10、20、30d各观察一次。
观察前放入冰箱冷却20分钟。
以液化时间的早晚及程度为依据，确定液化的快慢和强弱。
每个菌株3次重复。
2）淀粉酶的测定将菌种接种于淀粉培养基平板上，采用点接法，培养10天或20天后往培养基表面倒入碘液，如有淀粉酶产生，即将淀粉变成糊精或利用吸收，遇到碘液不变成蓝色，却形成透明圈;圈的大小表示淀粉酶产生的强弱。
如不产生淀粉酶，则菌落周围部位遇碘时呈蓝色。
3）硝酸盐还原将待测菌接种于硝酸盐液体培养基中，置28℃培养箱中培养7d，14d。
以不接种作空白培养液对照。
在干净的空试管或白色盘中倒入少许培养液，再各加1滴A液和B液，在对照管中同样加入A、B液各1滴。
当培养液中滴入A，B液后，若溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等，表示有亚硝酸盐存在，硝酸盐反应阳性。
如无红色出现，则可加入1-2滴二苯胺试剂，此时如果成蓝色，则表示培养液中仍有硝酸盐存在而无亚硝酸盐反应，则还原作用为阴性。
若不成蓝色，表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都己还原成其它物质，仍按阳性对待。
该反应是在较为厌氧的条件下进行的，所以分装培养液时液面易高些。
由于亚硝酸盐可以是硝酸盐还原最终产物，也可以是整个还原过程的中间产物，而且各种菌还原速度相差较大，所以培养18~24h的第一次观察应及时。
4）牛奶石蕊试验在脱脂的牛乳中加l%的石蕊指示剂，分装试管，在115℃条件下灭菌IOmin。
接种放线菌后培养，定期观察6周。
5）H2S的产生将菌株接种到含柠檬酸铁的有机斜面上，置28℃培养10d左右(视菌苔生长成熟为宜)观察结果。
若培养基中出现黑褐色沉淀，表示试验为阳性。
反之，不变色者为阴性。
6）纤维素水解试验配制适合放线菌生长而不含碳源的合成基础培养液，分装试管后，以滤纸作纤维素(碳源)，把其切成宽1cm、长6cm的滤纸条，加入试管中，一半浸在液内，一半露在液外，将菌株接种在液外一段滤纸条上，置28℃培养30d后观察。
若该菌能将滤纸条分解成一团松散的纤维，或使之折断者为阳性，说明该菌株产生纤维素酶。
反之，滤纸无变化者为阴性。
7）产黑色素实验将菌株接种到黑色素形成培养基，28℃培养4～5 d，若出现黑色表明具有酪氨酸酶活性，反之则没有。
8）碳源利用实验碳源利用基础培养基经高压灭菌后，无菌操作加入各种无菌碳源。
本实验采用的碳源为：D-果糖，D-木糖，D-半乳糖，D-甘露醇，L-阿拉伯糖，肌醇，L-鼠李糖，D-葡萄糖，蔗糖，棉子糖。
各种碳源的灭菌采用乙醚法——称取一定量的碳源干品，装在已灭菌的烧瓶内，然后加足量乙醚，置与通风开启的超净工作台内，直到乙醚挥发干，之后再加无菌水配成10%的溶液。
使用时按比例加到灭过菌的基础培养基中使其最终浓度为1%。
此外还需要一个未加含碳化合物的碳源利用基础培养基作为空白对照。
4 16SrDNA序列分析1）供试菌株的活化将试菌株分别配成菌悬液涂布于高氏一号平板上，28℃培养7d左右，菌丝生长茂盛时即可用于提取DNA。
2）菌株DNA的提取①将供试菌菌丝小心刮下来置于研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末状，将粉末装入1.5rnL 灭菌离心管中，并加入600ulDNA提取液。
②摇匀，65℃水浴1h。
③从水洛锅中取出离心管，于12200rpm离心10min，取上清液于另一离心管中。
④加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)抽提细胞蛋白，并充分摇匀(10min)后，于12200rpm离心5min，吸取上清液于一新的离心管中，重复此步骤1一2次。
⑤把上层水相转入1.5mL离心管管中，加入0.6倍体积的冰异戊醇轻轻混匀，沉淀DNA，置于一20℃冷冻过夜。
⑥12200rpm下离心15min，小心弃掉上清液。
用70%乙醇，100%乙醇各清洗一次，除去残余的杂质。
⑦在超净工作台下吹干DNA沉淀。
加入10µlTE缓冲液，于-20℃保存待用。
DNA的检测。
3）采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA(l)稀释缓冲液的制备:取5倍TBE缓冲液l00mL，配制成1xTBE稀释缓冲液，待用。
(2)胶液的制备：:称取0.32g琼脂糖，置于100mL三角瓶中，加入30mL 1xTBE稀释缓冲液，加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。
加热过程中不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时盖上封口膜，以减少水分蒸发。
(3)胶板的制备:将电泳胶槽平放，插上梳子，梳齿下缘与胶槽底面保持1~左右的空隙。
在冷却至50~60℃的琼脂糖胶液中加入Goldview染色剂，充分混匀至不烫手后将琼脂糖倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。
半小时后拔出梳子。
将胶槽放入电泳槽内，然后向槽内加入l x TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。
注意排除气泡。
(4)加样:取3µL Marker，5ul DNA与3µL 溴酚蓝溶液混匀，用移液枪小心加入样品槽内。
