第二章 工业微生物产生菌的分离筛选

工业微生物菌种的分离与筛选来源：青岛海博一、微生物工业对菌种的要求一、微生物工业的生产水平由三个要素决定：生产菌种的性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备;其中生产菌种的性能是最重要的因素;二、微生物工业对菌种的要求是：1菌株高产,在较短的时间内发酵产生大量发酵产物的能力;2在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近的副产品及其他产物;3生长繁殖能力强,较强的生长速率,产孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力;4能够高效地将原理转化为产品;5能利用广泛的原材料,并对发酵原料成分的波动敏感性小;6对需要添加的前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;7在发酵过程中产生的泡沫要少;8具有抗噬菌体的能力；9遗传稳定性,二、工业用微生物菌种的来源及选育一微生物菌种的来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品和分离筛选：1是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；2从大自然中采集样品分离；3从一些发酵制品中分离筛选目的菌株;当前发酵工业所用菌种总趋势是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种;二微生物工业菌种的分离1、野生菌株的分离、筛选过程1新菌种分离与筛选的步骤菌种分离的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节：以温度适中,雨量不多的秋初为好;采土方式：在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考;为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离;②标本预处理④纯种分离：采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落;⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件,通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种;还要对菌种进行发酵性能测定,⑥毒性试验：据有的国家规定,微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外,其他微生物作为食用,均需通过两年以上的毒性试验;2、菌种的分离方法1施加选择性压力分离法主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同,如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物生长,而不利于其他种类微生物的生存,以达到使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的;如可以控制培养时的氧,可将好氧微生物和厌氧微生物分开；通过控制温度,可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH,可将嗜酸、嗜碱微生物分离等;在分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加选择性;如在分离放线菌和细菌时,可加入抗真菌抗生素；分离真菌时,可加入抗细菌药物; 2随机分离方法有些微生物的产物对筛选没有直接的选择性指示作用,因此常采用随机分离方法分离;A、抗生素产生菌的分离抗生素产生菌的分离常用抑菌圈法;实验必须用工具菌：采用抗生素的敏感菌,传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草杆菌;Ｂ、抗肿瘤药物产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离常用方法：生化诱导法、SOS生色检测法、DNA修复能力突变株;原理是利用DNA的损伤,微生物发生突变;B1、生化诱导法：将大肠杆菌的lacZ基因连接在λ噬菌体的PL启动子下,当DNA损伤时,诱发λ阻遏物CI分解,PL启动子启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的存在;B2、SOS生色检测法：利用当DNA损伤时,可活化yecA蛋白,进而分解噬菌体的阻遏蛋白,再引起sifA基因启动lacZ基因转录,测定表达的ß-半乳糖苷酶活性,来检测药物的存在;Ｃ、生长因子产生菌的分离以氨基酸产生菌为例,介绍筛选方法;首先将待试菌接入加了抗真菌的化合物如亚胺环己酮的分离培养基中生长,然后采用影印法,将菌落复印到能支持氨基酸产生菌生长的培养基中,培养2-3天后,用紫外线杀司长好的菌落,再往此平板上面铺一层相应营养缺陷型菌株菌悬液,培养16小时后,被杀死的氨基酸产生菌的菌落周围应有一检测菌的生长圈;3目的微生物分离A、根据形态筛选突变株B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等;①透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基混浊;能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈,圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力;该法在分离水解酶产生菌时采用较多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈;在分离某种产生有机酸的菌株时,也通常采用透明圈法进行初筛;在选择性培养基中加入碳酸钙,使平板成混状,将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养,由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解,形成清晰的透明圈,可以轻易地鉴别出来;分离乳酸产生菌时,由于乳酸是一种较强的有机酸,因此,在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用,还有酸中和作用;②变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来;如筛选果胶酶产生菌时,用含%果胶为惟一碳源的培养基平板,对含微生物样品进行分离,待菌落长成后,加入%刚果红溶液染色4h,具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈;在分离谷氨酸产生菌时,可在培养基中加入溴百里酚蓝,它是一种酸碱指示剂,变色范围在～,当pH在以下时为黄色,以上为蓝色;若平板上出现产酸菌,其菌落周围会变成黄色,可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌;③生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌;工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株;将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养,若某菌株能合成平板所需的营养物,在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈;如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌如与不含嘌呤的琼脂混合倒平板,在其上涂布含菌样品保温培养,周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌;④抑菌圈法：常用于抗生素产生菌的分离筛选,工具菌采用抗生素的敏感菌;若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质,如抗生素等,便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,很容易被鉴别出来;实验十从自然界中分离筛选微生物菌种1 目的1学习并掌握优良曲霉菌的分离原理和方法;2学习工掌握酸乳中乳酸菌的分离原理和方法;2 原理从自然界中分离筛选微生物菌种,是我们获得优良新菌种最基本、最主要的方法,因此,食品工业菌种的分离筛选是一项重要的、长期而繁重的工作;自然界存在着各种各样的微生物,尤其是土壤中微生物种类齐全,是微生物的大本营;因此可以从土壤中分离到几乎所有微生物;另外,不同的自然界环境中生存的微生物优势菌种也不同;各种食品、农副产品等营养组成不同,从中可以分离出不同的微生物;食品工业菌种常用的分离源有被污染的生产或科研菌种、生产中长期使用的菌种、发酵食品用菌种、动物肠道菌群、经各种育种方法处理过的微生物材料和自然界菌种样品;自然界的微生物是混杂生存的,要从中分理出一种微生物,不仅需要考虑分离源应含有较多数量的目的菌,还要在分离操作中使之与其他菌种相互分开;对于样品中含量较低的菌处,要针对其生物学特点合理设计分离方法,如富集培养、选择培养、利用其特殊的生理反应产生特定的生长现象等,以便于从大量杂菌中选出目的菌种;从混杂群体中分离特定微生物的常用方法有：控制分离培养基的营养成分、控制培养基的pH值、添加抑制剂、控制培养温度、控制空气条件、对样品进行特殊处理等;常用的纯种分离方法有平板划线分离法、简单平板分离法、稀释分离、涂布分离法、毛细管分离法、显微操作单细胞分离法等;本实验将采用稀释法和涂布法对目的微生物进行分离筛选;优良曲霉菌的分离采用透明圈法,即先用淀粉琼脂培养基培养样品,由于糖化酶的作用,长出的菌落周围的淀粉被水解,遇碘后呈无色透明圈而平板的其他处呈蓝色;一般来讲,透明圈的直径越大,该菌的糖化力越强;可根据透明圈的大小筛选出糖化力强的菌株;酸乳中乳酸菌的分离采用溴甲酚绿BCG牛乳营养琼脂平板分离法;溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色,在碱性环境中呈蓝色;在分离培养基中加处溴酚绿指示剂后呈蓝绿色,乳酸菌在该培养基中生长并分解乳糖,产生乳酸,使菌落呈黄色,菌落周围的培养基也变为黄色;乳酸可用纸上层析法鉴别;3材料样品黑曲霉种曲、酸奶;器具及其他用品平皿、三角瓶、涂布器、试管、玻璃珠、纱布;培养基及试剂2%淀粉察氏培养基、BCG牛乳培养基、L碘液、10%牛乳培养基、无菌生理盐水;4 流程优良糖化酶菌株的分离与筛选融化培养基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→培养观察→滴加碘液→挑菌落→接种→培养→糖化酶活力测定→菌种保存酸乳制品中的乳酸菌的分离制培养基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→培养观察→挑菌落→接牛乳管→培养观察→传代培养→挑选凝乳管→乳酸测定→菌种保存5 步骤优良糖化酶菌株的分离与筛选1融化淀粉察氏培养基,稍冷后倒平板与斜面数个;2取种曲少许,加入10mL带玻璃球的无菌生理盐水的三角瓶中,用力振荡打散孢子团粒,使之形成均匀的孢子悬浮粒;然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中;3将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7,取后3个稀释度的稀释液各,于淀粉察氏培养基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿,30℃培养1~2d;5性能测定：测定各菌落的糖化酶活力;酸乳制品中的乳酸菌的分离1制备BCG牛乳营养琼脂培养基;①称取脱脂奶粉10g,溶于50mL水中,加入%溴甲酚绿酒精溶液,压力下灭菌20min;②另取琼脂2g,溶于50mL水中,加酵母膏1g,溶解后调pH值至,压力下灭菌20min;③趁热将上述两液以无菌操作混合均匀,倒平板6个,待凝固后,置37℃培养24h,若无杂菌生长,即可使用;2将样品以10倍稀释法稀释至10-7,取其中10-7、10-6 2个稀释度的稀释液各~,分别置于上述各营养平板上,用无菌涂布器依次涂布2至3个皿,置43℃培养48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基亦为黄色者初步定为乳酸菌;3将典型菌落转至脱脂乳发酵管,43℃培养8~24h,若牛乳管凝固,无气泡,呈酸性,镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色呈阳性,则将其连续传代若干次,43℃培养,挑选出在3~4h能凝固的乳管,保存备用;4乳酸菌的鉴定及生物量的测定;6 结果1描述黑曲霉分离株的形态特征及其分生孢子头的生态;2绘制所分离的乳酸菌形态图,并记录结果;7 思考题1为什么溶解样品的瓶内要加入玻璃珠2说明用透明圈直径与菌株淀粉酶产量有何关系3哪些情况能够引起凝乳。

工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求(一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。

其中生产菌种得性能就是最重要得因素。

(二)、微生物工业对菌种得要求就是:(１)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力;(２)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物;(3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力;(4)能够高效地将原理转化为产品;(５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小;(６)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;(7)在发酵过程中产生得泡沫要少;(8)具有抗噬菌体得能力;(9)遗传稳定性,二、工业用微生物菌种得来源及选育(一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选:(1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;(２)从大自然中采集样品分离;(3)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株、当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。

(二)微生物工业菌种得分离1、野生菌株得分离、筛选过程(１)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下:标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。

采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—1５cm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。

为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离、②标本预处理④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落、⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。

工业微生物菌种的【2 】分别与筛选起源：青岛海博一.微生物工业对菌种的请求(一).微生物工业的临盆程度由三个要素决议：临盆菌种的机能.发酵及提纯工艺前提.临盆装备.个中临盆菌种的机能是最重要的身分.（二）.微生物工业对菌种的请求是：（1）菌株高产,在较短的时光内发酵产生大量发酵产物的才能;（2）在发酵进程中不产生或少产生与目标产品邻近的副产品及其他产物;（3）发展滋生才能强,较强的发展速度,产孢子的菌种应当具有较强的产孢子才能;（4）可以或许高效地将道理转化为产品;（5）能应用普遍的原材料,并对发酵原料成分的波动迟钝性小;（6）对须要添加的前体物资有耐受才能,并且不能将这些前体物资作为一般碳源应用; （7）在发酵进程中产生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌体的才能;（9）遗传稳固性,二.工业用微生物菌种的起源及选育（一）微生物菌种的起源一般经由过程以下几个门路收集菌种.采集样品和分别筛选：（1）是依据材料直接向有科研单位.高级院校.工场或菌种保藏部门索取或购置;（2）从大天然中采集样品分别;（3）从一些发酵成品平分别筛选目标菌株.当前发酵工业所用菌种总趋向是从野生菌转向变异菌,天然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种.（二）微生物工业菌种的分别1.野生菌株的分别.筛选进程（1）新菌种分别与筛选的步骤菌种分别的流程如下：标本采集→标本材料的预处理→富集造就→菌种初筛→菌种复筛→机能判定→菌种保藏①采样采样季候：以温度适中,雨量不多的秋初为好.采土方法：在选好恰当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛入干净的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记载采样时光.地点.情形前提等,以备查考.为了使土样中微生物的数目和类型尽少变化,宜将样品慢慢分批寄回,以便实时分别.②标本预处理④纯种分别：采用划线分别法.稀释分别法等纯化办法获取单菌落.⑤高产菌株的筛选：这一步是采用与临盆邻近的造就基和造就前提,经由过程三角瓶的容量进行小型发酵实验,获得合适于工业临盆用菌种.还要对菌种进行发酵机能测定,⑥毒性实验：据有的国度划定,微生物中除啤酒酵母.脆壁酵母.黑曲霉.米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性实验外,其他微生物作为食用,均需经由过程两年以上的毒性实验.2.菌种的分别办法（1）施加选择性压力分别法主如果应用不同种类的微生物其发展滋生对情形和养分的请求不同,如温度.pH.渗入渗出压.氧气.碳源.氮源等,工资控制这些前提,使之利于某类或某种微生物发展,而不利于其他种类微生物的生计,以达到使目标菌种占优势．而得以快速分别纯化的目标.如可以控制造就时的氧,可将好氧微生物和厌氧微生物离开;经由过程控制温度,可将嗜热微生物和非嗜热微生物离开;控制pH,可将嗜酸.嗜碱微生物分别等.在分别造就基中也可以参加不同的抗生素或试剂来增长选择性.如在分别放线菌和细菌时,可参加抗真菌抗生素;分别真菌时,可参加抗细菌药物.（2）随机分别办法实验十从天然界平分别筛选微生物菌种1 目标（1）进修并控制优秀曲霉菌的分别道理和办法.（2）进修工控制酸乳中乳酸菌的分别道理和办法.2 道理从天然界平分别筛选微生物菌种,是我们获得优秀新菌种最根本.最重要的办法,是以,食物工业菌种的分别筛选是一项重要的.长期而沉重的工作.天然界消失着各类各样的微生物,尤其是泥土中微生物种类齐备,是微生物的大本营.是以可以从泥土平分别到几乎所有微生物.别的,不同的天然界情形中生计的微生物优势菌种也不同.各类食物.农副产品等养分构成不同,从中可以分别出不同的微生物.食物工业菌种常用的分别源有被污染的临盆或科研菌种.临盆中长期应用的菌种.发酵食物用菌种.动物肠道菌群.经各类育种办法处理过的微生物材料和天然界菌种样品.天然界的微生物是混淆生计的,要从平分理出一种微生物,不仅须要斟酌分别源应含有较多半量的目标菌,还要在分别操作中使之与其他菌种互相离开.对于样品中含量较低的菌处,要针对其生物学特色合理设计分别办法,如富集造就.选择造就.应用其特别的心理反响产生特定的发展现象等,以便于从大量杂菌中选出目标菌种.从混淆群体平分别特定微生物的常用办法有：控制分别造就基的养分成分.控制造就基的pH值.添加克制剂.控制造就温度.控制空气前提.对样品进行特别处理等.常用的纯种分别办法有平板划线分别法.简略平板分别法.稀释分别.涂布分别法.毛细管分别法.显微操作单细胞分别法等.本实验将采用稀释法和涂布法对目标微生物进行分别筛选.优秀曲霉菌的分别采用透明圈法,即先用淀粉琼脂造就基造就样品,因为糖化酶的感化,长出的菌落四周的淀粉被水解,遇碘后呈无色透明圈而平板的其他处呈蓝色.一般来讲,透明圈的直径越大,该菌的糖化力越强.可依据透明圈的大小筛选出糖化力强的菌株.酸乳中乳酸菌的分别采用溴甲酚绿（BCG）牛乳养分琼脂平板分别法.溴甲酚绿指导剂在酸性情形中呈黄色,在碱性情形中呈蓝色.在分别造就基（pH6.8）中加处溴酚绿指导剂后呈蓝绿色,乳酸菌在该造就基中发展并分化乳糖,产生乳酸,使菌落呈黄色,菌落四周的造就基也变为黄色.乳酸可用纸上层析法辨别.3材料3.1 样品黑曲霉种曲.酸奶.3.2 器具及其他用品平皿.三角瓶.涂布器.试管.玻璃珠.纱布.3.3 造就基及试剂2%淀粉察氏造就基.BCG牛乳造就基.0.02mol/L碘液.10%牛乳造就基.无菌心理盐水.4 流程4.1 优秀糖化酶菌株的分别与筛选熔化造就基→倒平板→打散孢子团粒→梯度稀释→涂布平板→造就不雅察→滴加碘液→挑菌落→接种→造就→糖化酶活气测定→菌种保存4.2 酸乳成品中的乳酸菌的分别制造就基→倒平板→梯度稀释→涂布平板→造就不雅察→挑菌落→接牛乳管→造就不雅察→传代造就→遴选凝乳管→乳酸测定→菌种保存5 步骤5.1 优秀糖化酶菌株的分别与筛选（1）熔化淀粉察氏造就基,稍冷后倒平板与斜面数个.（2）取种曲少许,参加10mL带玻璃球的无菌心理盐水的三角瓶中,用力振荡打散孢子团粒,使之形成平均的孢子悬浮粒.然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中.（3）将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7,取后3个稀释度的稀释液各0.2mL,于淀粉察氏造就基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿,30℃造就1~2d.（5）机能测定：测定各菌落的糖化酶活气.5.2 酸乳成品中的乳酸菌的分别（1）制备BCG牛乳养分琼脂造就基.①称取脱脂奶粉10g,溶于50mL水中,参加1.6%溴甲酚绿酒精溶液0.07mL,0.075MPa压力下灭菌20min.②另取琼脂2g,溶于50mL水中,加酵母膏1g,消融后调pH值至6.8,0.1MPa压力下灭菌20min.③趁热将上述两液以无菌操作混淆平均,倒平板6个,待凝固后,置37℃造就24h,若无杂菌发展,即可应用.（2）将样品以10倍稀释法稀释至10-7,取个中10-7.10-6 2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL,分别置于上述各养分平板上,用无菌涂布器依次涂布2至3个皿,置43℃造就48h,如消失圆形稍扁平的黄色菌落及其四周造就基亦为黄色者初步定为乳酸菌.（3）将典范菌落转至脱脂乳发酵管,43℃造就8~24h,若牛乳管凝固,无气泡,呈酸性,镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色呈阳性,则将其持续传代若干次,43℃造就,遴选出在3~4h能凝固的乳管,保存备用.（4）乳酸菌的判定及生物量的测定.6 成果（1）描写黑曲霉分别株的形态特点及其分生孢子头的生态.（2）绘制所分别的乳酸菌形态图,并记载成果.7 思虑题（1）为什么消融样品的瓶内要参加玻璃珠？（2）解释用透明圈直径与菌株淀粉酶产量有何干系？（3）哪些情形可以或许引起凝乳？。

工业生产菌的筛选步骤
工业生产菌的筛选步骤一般包括以下几个环节：
标本采集：这是第一步，需要从各种可能的环境或样本中收集微生物。

采集标本的原则是，样品来源越广，获得新菌种的可能性越大。

同时，需要了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类及其生理特征，以便更好地选择采样地点和方式。

标本材料预处理：收集到的样本需要进行适当的处理，以便于后续的微生物分离和纯化。

这一步通常包括样本的破碎、稀释、过滤等操作。

富集培养：为了提高目标微生物的浓度，通常需要进行富集培养。

这一步通过提供有利于目标微生物生长的环境条件，使其数量增加，便于后续的分离和筛选。

菌种初筛：在富集培养后，需要对微生物进行初步的筛选。

这一步通常基于微生物的某些特定生理特征或代谢产物进行，如抗菌活性、酶活性等。

性能鉴定：初筛得到的菌种需要进一步进行性能鉴定，以确定其是否满足工业生产的要求。

这一步通常包括对微生物的生长速度、产物产量、稳定性等方面的评估。

菌种保藏：最后，对于筛选得到的优良菌种，需要进行妥善的保藏，以便于后续的研究和生产使用。

这些步骤可能需要反复进行和优化，以获得最适合工业生产
的菌种。

工业微生物菌种得分离与筛选来源:青岛海博一、微生物工业对菌种得要求(一)、微生物工业得生产水平由三个要素决定:生产菌种得性能、发酵及提纯工艺条件、生产设备。

其中生产菌种得性能就是最重要得因素。

(二)、微生物工业对菌种得要求就是:(1)菌株高产,在较短得时间内发酵产生大量发酵产物得能力;(2)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近得副产品及其她产物;(3)生长繁殖能力强,较强得生长速率,产孢子得菌种应该具有较强得产孢子能力;(4)能够高效地将原理转化为产品;(５)能利用广泛得原材料,并对发酵原料成分得波动敏感性小;(6)对需要添加得前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用;(7)在发酵过程中产生得泡沫要少;(8)具有抗噬菌体得能力;(9)遗传稳定性,二、工业用微生物菌种得来源及选育(一)微生物菌种得来源一般通过以下几个途径收集菌种、采集样品与分离筛选:(1)就是根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;(2)从大自然中采集样品分离;(３)从一些发酵制品中分离筛选目得菌株。

当前发酵工业所用菌种总趋势就是从野生菌转向变异菌,自然选用转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组得定向育种。

(二)微生物工业菌种得分离1、野生菌株得分离、筛选过程(1)新菌种分离与筛选得步骤菌种分离得流程如下:标本采集→标本材料得预处理→富集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能鉴定→菌种保藏①采样采样季节:以温度适中,雨量不多得秋初为好。

采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5—１５ｃm处得土约10g,盛入清洁得牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。

为了使土样中微生物得数量与类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。

②标本预处理④纯种分离:采用划线分离法、稀释分离法等纯化方法获取单菌落。

⑤高产菌株得筛选:这一步就是采用与生产相近得培养基与培养条件,通过三角瓶得容量进行小型发酵试验,获得适合于工业生产用菌种。

工业微生物产生菌的分离筛选（二）富集（enrichment）培育是在目的微生物含量较少时,依据微生物的生理特点,设计一种选择性培育基,制造有利的生长条件,使目的微生物在最适的环境下快速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,以利分别到所需要的菌株.富集培育主要依据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以掌握.一般可从以下几个方面来进行富集.一、掌握培育基的养分成分微生物的代谢类型非常丰富,其分布状态随环境条件的不同而异.假如环境中含有较多某种物质,则其中能分解利用该物质的微生物也较多.因此,在分别该类菌株之前,可在增殖培育基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源.那些能分解利用的菌株因得到充分的养分而快速繁殖,其他微生物则由于不能分解这些物质,生长受到抑制.当然,能在该种培育基上生长的微生物并非单一菌株,而是养分类型相同的微生物群.富集培育基的选择性只是相对的,它只是微生物分别中的一个步骤.现举两例,如要分别水解酶产生菌,可在富集培育基中以相应底物为惟一碳源,加入含菌样品,给目的微生物以最佳的培育条件（pH、温度、养分、通气等）进行培育.能分解利用该底物的菌类得以繁殖,而其他微生物则因得不到碳源无法生长,菌数渐渐削减.此时分别将得到所需的微生物.又如要分别耐高渗酵母菌,由于该类菌在一般样品中含量很少,富集培育基和培育条件必需严密设计.首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样.富集培育基为5%～6%的麦牙汁,30%～40%葡萄糖,pH3～4,在20～25℃温度下进行培育,可以达到富集的目的.在富集培育时,还需依据微生物的不同种类选用相应的富集培育基,如淀粉琼脂培育基通常用于丝状真菌的增殖,配方为（%）：可溶性淀粉4,酵母浸膏0.5,琼脂2,pH6.5～7.0.在配制时要特殊留意酵母浸膏加量,过多会刺激菌丝生长,而不利于孢子的产生.依据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点,可通过连续富集培育的方法分别降解高浓度污染物的环保菌.如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培育,待底物完全降解后,再以肯定接种量转接到新奇的含苯胺的富集培育液中,如此连续移接培育数次.同时将苯胺浓度逐步提高,便可得到降解苯胺占优势的菌株培育液,采纳稀释涂布法或平板划线法进一步分别,即可得到能降解高浓度苯胺的微生物.移种的时间既可依据底物的降解状况,也可通过微生物的生长状况确定.如在分别环己烷降解菌时,样品经环己烷为惟一碳源的培育基富集后,培育液由原来的无色变为浑浊的乳白色.同时锥行瓶壁上也可观看到微生物的生长状况.此时可以2%的接种量移入新奇的富集培育基中连续培育.连续富集培育的方法虽耗时较长,有时甚至需要6～7个月,但效果较好.通过该方法分别DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌,也都取得了满足的结果.二、掌握培育条件在筛选某些微生物时,除通过培育基养分成分的选择外,还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特别要求加以掌握培育,达到有效的分别目的.如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5）,霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）.因此,富集培育基的pH值调整到被分别微生物的要求范围不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.分别放线菌时,可将样品液在40℃恒温预处理20分钟,有利于孢子的萌发,可以较大的增加放线菌数目,达到富集的目的.筛选极端微生物时,需针对其特别的生理特性,设计相宜的培育条件,达到富集的目的.一般所筛选的微生物通常是好氧菌,但有时也需分别厌氧菌.因严格厌氧菌不仅可省略通气、搅拌装置,还可节约能耗.这时除了配置特别的培育基外,还需预备特别的培育装置,制造一个有利于厌氧菌的生长环境,使其数量增加,易于分别.三、抑制不需要的菌类在分别筛选的过程中,除了通过掌握养分和培育条件,增加富集微生物的数量以有利于分别外,还可通过高温、高压、加入抗生素等方法削减非目的微生物的数量,使目的微生物的比例增加,同样能够达到富集的目的.从土壤中分别芽孢杆菌时,由于芽孢具有耐高温特性,100℃很难杀死,要在121℃才能彻底死亡.可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h,杀死不产芽孢的菌种后再进行分别.在富集培育基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长,对革兰阴性无抑制作.分别厌氧菌时,可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂,它能使培育基氧化还原电势下降,造成缺氧环境,有利于厌氧菌的生长繁殖.筛选霉菌时,可在培育基中加入四环素等抗生素抑制细菌,使霉菌在样品的比例提高,从中便于分别到所需的菌株；分别放线菌时,在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml,以及丙酸钠10g/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长.另外据报道,重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用,也可用于选择分别放线菌.在分别除链霉菌以外的放线菌时,先将土样在空气中干燥,再加热到100℃保温1h,可削减细菌和链霉菌的数量.分别耐高浓度酒精和高渗酵母菌时,可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间,杀死非目的微生物后再进行分别.对于含菌数量较少的样品或分别一些稀有微生物时,采纳富集培育以提高分别工作效率是非常必要的.但是假如按通常分别方法,在培育基平板上能消失足够数量的目的微生物,则不必进行富集培育,直接分别、纯化即可.。

工业微生物产生菌的分离筛选【3】在分离以氯化物为氮源的细菌时，把浸透了KCN溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生的HCN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每天用新制备的浸湿KCN的滤纸更换，培养一段时间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易得到分解氰化物的菌株。

由于塑料工业的发展，环境中到处都有各种高分子包装废弃物，这些污染物多为不溶于水的高分子化合物，获得其降解菌株较为困难。

通常采用富集法进行筛选，如日本的小野胜道教授以低浓度聚乙烯作为富集培养基对土壤微生物进行驯化，分离到了三种能降解聚乙烯的细菌。

在淀粉塑料的降解试验中，采用加富土壤淹埋法，筛选到的降解微生物主要是霉菌与放线菌。

这可能是因为丝状体更容易深入共混物内部生长。

尤其是膜料中的聚乙烯和淀粉分布并非均匀，由于聚乙烯的流动性好，因而在吹塑过程中膜表面的聚乙烯含量偏高，使细菌在初期很难降解这类共混物，所以在降解菌的研究方面应着重考虑霉菌与放线菌。

除驯化培养进行降解菌的筛选外，还可采用阶段式筛选法。

如在分离聚乙二醇降解菌时，可先筛选能分解乙二醇、丙二醇或聚乙二醇结构相似的含两个醚键的三甘醇的微生物，再从中筛选能降解聚乙二醇的菌株，也能达到较好的效果。

除寻找能够降解废旧塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代现有塑料。

目前降解塑料有光降解、光-生物降解、纤维素类生物降解塑料等。

有些生物降解塑料是以简单的物理共混工艺，将淀粉填充到聚乙烯等树脂内，淀粉可以被微生物分解，但树脂分子骨架在很长时间内仍分解不了，反而为废弃塑料的回收增加了困难。

而一些聚脂类高分子由于具有和微生物本身可合成的聚β-羟基丁酯（PHB）相类似的结构，无毒，且能在酸、碱和微生物条件下完全降解，同时具有良好的塑性，用途宽广的多。

用微生物发酵法生产的聚β-羟基脂肪酸（polyhydroxyalkanoic acid,PHAs）也成为研究生物降解塑料的热点，其中利用真氧产碱杆菌（Alcaligtnes eutrophus）合成PHB的研究最多。

工业微生物产生菌的分离筛选（四）各种微生物对养分要求和培育条件是不同的,在分别筛选时若在这两个方面加以调整掌握,就能获得更好的分别效果.1. 培育基的养分成分各种微生物对碳源、氮源要求各异,有的对养分还有特别的要求,事先了解被分别微生物的养分要求,从而设计一个合理快速的分别培育基,能够收到事半功倍的效果.放线菌是生产抗生素和酶制剂的重要来源.在选择分别放线菌时,通常采纳改良的HV琼脂培育基、土豆-胡萝卜水汁液培育基和淀粉琼脂培育基能取得较好的效果.但不同菌种对养分要求差别很大,如奴卡氏菌在有氧条件下用一般培育基即可分别到,而以色列放线菌则在有CO2存在且有相宜培育基的状况下才能正常生长繁殖.筛选水解酶产生菌时,通常利用以底物为惟一碳、氮源的平板进行分别,如以淀粉为碳源的培育基可鉴定菌落能否产生淀粉酶；一种含纤维素粉为碳源的分别培育基,可以鉴别纤维素酶产生菌；用含有酪蛋白为有机氮源的平板培育基,可以鉴别蛋白酶的产生菌.纯种分别时,把以上琼脂平板置于相宜的温度培育肯定的时间,如具有产生水解酶力量的菌株,便在菌落四周形成水解圈或呈色圈,依据圈的大小可初步推断酶活力强弱.测定水解圈直径与菌落直径之比,把比例大的菌落移入斜面保藏,供进一步筛选.2. 培育基的pH细菌、放线菌的生长繁殖对pH一般要求偏碱,霉菌和酵母菌要求偏酸.因此,分别培育基的pH应当调整到被分别微生物要求范围.这不仅有利于自身生长,也可排解一部分不需要的菌类.例如,分别柠檬酸产生菌的黑曲霉,就是利用调整培育基的酸碱度获得胜利的.其分别方法是：取红芋粉醪20%、柠檬酸 10%～20%配成培育液,调整pH2.0～2.5,以肯定量的培育基和土样匀称混合,用毛细吸管点种在平皿内事先掩盖的无菌滤纸上（2～3层）,于30℃培育,这样可以分别到产生柠檬酸的黑曲霉.分别碱性蛋白酶和碱性脂肪酶产生菌时,可以把培育基调到pH9～11,在此范围内不宜生长的微生物被抑制,这对分别本身起到浓缩作用.大多数水解酶的生长最适pH基本相近,而酶的作用pH未必与产酶pH相同.培育基的pH要结合养分成分和培育条件来考虑.由于微生物在生长繁殖过程中,由于代谢作用会产生酸性或碱性产物,pH发生变化,微生物生长受到抑制.一般培育基中碳氮比（C/N）高者,培育后倾向于酸性,反之则倾向于碱性.无机盐的性质也会影响pH变化,（NH4）2SO4是生理酸性无机氮源,其中NH4+被菌体利用,留下SO42-,培育液变成酸性.而NaNO3是生理碱性氮源,其中NO3-被菌体分解利用后,剩余Na+,使培育液变成碱性.如发酵过程缺氧,则代谢向有机酸合成方向进行,pH下降.为了维持培育基的PH,一般要加磷酸盐,如K2HPO4、KH2PO4,使培育基具有肯定的缓冲力量.假如培育液中的酸碱变化很大,磷酸盐的缓冲容量不足以调整pH变化,则可适当加入碳酸钙,以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类,使培育基的pH能保持在恒定的范围内.此外,在分别霉菌时,加几滴乳酸不仅可以维持肯定酸碱度,而且可以抑制细菌的生长.3. 排解不需要的菌类实行调整pH的方法来抑制非目的微生物的生长,虽然能起到肯定的作用,但并不是对全部的菌类都有效.有些细菌和放线菌同样可以在酸性环境下生长,而个别的霉菌,也同样可以在中性或偏碱的培育基中生长.为了更有效地抑制非目的微生物的生长,要加入一些专一性的抑制剂.（1）分别细菌时,在培育基中加入浓度为50U/ml制霉菌素,可以抑制霉菌和酵母菌的生长.（2）分别放线菌时,在样品中加入0.05%十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的生长,还能激活放线菌孢子的萌发.加入氟哌酸（5mg/L）+ 制霉菌素（50mg/L）+ 青霉素（0.8mg/L）也可以有效地抑制细菌和真菌,而不影响放线菌的生长.（3）分别霉菌和酵母菌时,在培育基中加入青霉素、链霉素和四环素各30U/ml,可以抑制细菌和放线菌生长.（4）分别根霉和毛霉时,由于这些微生物的菌丝易扩散成片,难以得到纯化的菌落,通常在培育基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝扩散,使菌落长得小而紧密.一般用于分别单一目的微生物的培育基中均含有抑制其他微生物的抑制剂,这些专用的抑制剂在小型试验室配制较麻烦,现已有成品供应,只要直接加入基础培育基即可.如氨苄西林,主要用于分别亲水气单孢菌.4. 掌握培育温度掌握培育温度,也是一种获得目的微生物的有效措施.各类微生物生长温度不同,从大范围来看,可分三大类：一类是高温微生物,最适温度在50～60℃.假如要分别这类菌可将分别培育基置于50～60℃温度下培育,能抑制一些嗜冷、中性微生物生长,可以有效地分别到高温菌类.其次类是中温微生物,它们的最适生长温度是20～40℃,超过50℃,就停止生长.这类微生物最为常见,、数量都占首位.工业发酵微生物绝大多数都属于此类.其中不同类群微生物对温度又有所差别,一般细菌、放线菌最适温度为25～37℃,霉菌和酵母最适温度为20～28℃.第三类为低温微生物,它们的最适温度为15℃或更低.当从样品中分别各种菌类时,分别置于自身最适温度下培育也可大体上抑制另一些微生物的生长.当分别某些特别产物的微生物时,对温度的选择还需考虑某些内在的关系,如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时,由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高,其凝固点越低,即细胞在较低温度下仍能表现出活力,因此在低于正常温度10℃下分别效果最好.。