fda人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点

单克隆抗体(McAb)制备注意事项(一) 免疫动物的选择用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物，因为免疫动物品系和骨髓瘤细胞种系越远，融合的杂交瘤细胞越易发生免疫排斥反应，越不稳定。

目前使用的瘤细胞系，仍限于小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞系，其中多来源于纯系BALB/c小鼠，所以要选择该系小鼠用作免疫动物，一般认为，为了减少盲目性，融合前，应测定免疫小鼠的抗体反应性，如果呈阳性，可供融合用，那些对特定抗原不产生血清抗体的小鼠，得不到特异的杂交瘤细胞。

一般选择8～12周龄，重约20g，健康无病的纯系小鼠，雌雄均可应用。

(二) 免疫方案1 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性。

同样浓度的抗原，若含有较多的杂质，会明显影响抗体的产生，并为杂交瘤细胞分泌抗体的筛选带来麻烦，获得所需的分泌特异抗体的杂交瘤细胞的机率也低。

2 免疫小鼠一次免疫务必同时免疫几只小鼠，以免小鼠中途死亡。

每次注入抗原后，次日，小鼠会出现全身反应，体温升高、盗汗、耸毛等，此时对室温和饲养均需注意，以防小鼠死亡。

在融合前末次静注或腹腔注射时，谨防速发型过敏反应发生，而导致小鼠死亡。

3 不同抗原的免疫方法可溶性抗原，在初次免疫用明矾沉淀抗原100μg与2×109灭活百日咳杆菌混合皮下注射，间隔4～6周，用盐水抗原100～200μg 加强免疫，3天后取脾作融合；细胞抗原免疫，用2×107个细胞注入小鼠腹腔，间隔2～3周，再重复一次，3周后用同样数量细胞注入小鼠腹腔，3天后取脾作融合。

除上述常规免疫方法外，近年来还建立了脾内免疫法及体外细胞免疫法。

脾内免疫是将抗原直接注入小鼠的脾脏，具有抗原用量小及免疫周期短的优点；体外细胞免疫，是将抗原加入于体外培养的淋巴细胞中，使之形成免疫细胞。

(三) 融合剂PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格。

浓度越高，对细胞的毒性越大。

以40%～50%的浓度为宜，pH值以80～82促融率最高。

单克隆抗体的制备、纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。

二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。

将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。

四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。

一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。

B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。

例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。

单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定一、实验目的：单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。

了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。

二、实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。

将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。

只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

三、试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。

四、操作方法：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。

A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。

一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml～0.4ml，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。

B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。

例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。

单克隆抗体高三知识点单克隆抗体是一类由单一种克隆的细胞分泌的抗体，其具有特异性和高亲和力的特点。

现在让我们来了解一下高三生物单克隆抗体的一些重要知识点。

一、单克隆抗体的概念单克隆抗体是指通过将与特定抗原结合的淋巴细胞与癌症细胞融合，从而获得一种能够识别与之融合的抗原的抗体。

二、制备单克隆抗体的步骤1. 抗原注射：将目标抗原注射到小鼠体内。

2. 细胞融合：分离与抗原结合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞，使它们融合成为杂交瘤细胞。

3. 杂交瘤细胞筛选：利用杂交瘤细胞的克隆性，将其培养于选择性培养基中，筛选出能够产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。

4. 杂交瘤细胞培养：将筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞克隆培养，并收集细胞培养液。

5. 检测单克隆抗体：使用不同的方法对单克隆抗体进行检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）等。

三、单克隆抗体的应用1. 生命科学研究：单克隆抗体可以用于研究细胞分子组成、细胞信号传导途径、蛋白质相互作用等。

2. 临床诊断：单克隆抗体可以用于检测疾病标志物，如癌胚抗原、风湿因子等，提高疾病的早期诊断率。

3. 药物研发：单克隆抗体具有特异性和高亲和力，可以作为药物靶点，用于治疗肿瘤、自身免疫病等疾病。

4. 蛋白质纯化：单克隆抗体可以用于纯化目标蛋白质，提高纯度和产量。

四、单克隆抗体的优势和局限性1. 优势：单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，能够准确识别目标抗原，具有较低的交叉反应性。

2. 局限性：制备单克隆抗体的过程较为复杂和耗时，制备成本较高；同时，单克隆抗体可能存在较长的保护期，需要定期验证。

五、常见的单克隆抗体药物1. 曲妥珠单抗（Rituximab）：用于治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病等。

2. 重组人源化抗EGFR单抗（Cetuximab）：用于治疗表达高表皮生长因子受体的转移性结直肠癌等。

3. 格列卫单抗（Trastuzumab）：用于治疗表达高表皮生长因子受体2的早期和转移性乳腺癌等。

人单克隆抗体制备一、引言人单克隆抗体是由一种单一的免疫细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。

与传统的多克隆抗体相比，人单克隆抗体具有更好的一致性和稳定性，因此在医学研究和临床应用中具有重要意义。

二、制备方法人单克隆抗体的制备可以通过以下步骤完成：1. 免疫原选择：选择与目标疾病相关的适当免疫原，如病毒、细菌、肿瘤抗原等。

2. 免疫动物免疫：将免疫原注射到合适的动物体内，如小鼠、大鼠等，以激发免疫反应。

3. 混合细胞免疫：从免疫动物中获取免疫细胞，如B细胞，与骨髓细胞融合，形成杂交瘤细胞。

4. 杂交瘤细胞筛选：使用选择性培养基筛选出能够产生目标抗体的杂交瘤细胞。

5. 单克隆细胞扩增：将合适的杂交瘤细胞注射到小鼠或裸鼠体内，获得单个克隆的杂交瘤细胞。

6. 抗体表达和纯化：将单克隆细胞培养并收集上清液，通过亲和层析、离子交换层析等技术纯化目标抗体。

三、应用领域人单克隆抗体在医学领域有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 治疗：人单克隆抗体可以用于治疗各种疾病，如癌症、自身免疫性疾病等。

通过与靶标分子结合，抑制病理过程或刺激免疫系统，达到治疗效果。

2. 诊断：人单克隆抗体可以作为诊断试剂，用于检测疾病的标志物或特定分子。

例如，通过检测血清中的特定抗体可以判断是否感染某种病原体。

3. 研究工具：人单克隆抗体可以作为研究工具，用于研究特定分子的功能、相互作用等。

例如，可以使用单克隆抗体来检测蛋白质在细胞中的定位和表达水平。

4. 药物研发：人单克隆抗体也可以作为药物研发的载体。

通过将药物结合到抗体上，可以提高药物的靶向性和稳定性，减少副作用。

四、发展前景人单克隆抗体制备技术的不断发展，为医学研究和临床治疗带来了巨大的机遇。

随着基因工程和生物技术的进步，越来越多的人单克隆抗体将被制备出来，并在各个领域得到广泛应用。

然而，人单克隆抗体的制备过程还存在一些挑战和限制。

例如，制备过程中可能出现杂交瘤细胞的不稳定性和纯化困难等问题。

单克隆抗体制备常见问题分析一、前言1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。

虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题。

我本人就是其中一个，由于是第一次做单抗，所以过程中遇到了很多困难，终于在前几天得到了几株阳性克隆。

鉴于此，我将单克隆抗体制备的整个过程贴出来，同时搜索了园子里面一些战友的求助帖以及一些经典的应助帖，希望能对将要或是正在从事这项研究的战友们有些帮助。

二、动物的免疫选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。

一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。

下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10,,0.5ml ip (腹腔内注射)? 2,3周后第二次免疫1×10,,0.5ml ip? 3周后加强免疫(融合前三天) 1×10,,0.5ml ip或iv(静脉内注射)?取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂:福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫Ag 1,50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射? (一般0.8,1ml 0.2ml,点)?3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip? (ip剂量不宜超过0.5ml)?3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip? (5,7天后采血测其效价，检测免疫效果)?2,3周后加强免疫，剂量50,500μg为宜，ip或iv?3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如?将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。

Guideline on development, production, characterisation and specification formonoclonal antibodies and related products,EMA/CHMP/BWP/532517/20081、研发阶段1.1 结构应阐明抗体在作用机理、生物活性和稳定性方面的结构特征，至少包括抗体的免疫化学属性（例如亲和力，组织交叉反应，同种型[isotype]，同种异型[allotype]）的合理性，效应子功能对抗体活性的重要性和效应子功能的完整性。

谨慎考虑可能在患者身上产生抗体反应的风险，特别当单抗与人Ig不是高度同源时，或者在抗体结构上鉴定出潜在的免疫原性表位时。

这可能会导致临床不良反应和/或改变治疗潜能。

1.2 细胞系生产单抗的细胞基质应为稳定、连续的单克隆细胞系。

应阐明选用该细胞系的理由，说明与其他途径相比该细胞系有能力生产出预期的产品。

重组DNA技术获得的细胞基质应遵循“Production and Quality Control of medicinal products derived by recombinant DNA technology”(3AB1A)，以及相关的ICH指导原则Q5A (viral safety)，Q5B (expression constructs)和Q5D (cell substrates)。

分离单克隆细胞系前的过程，如细胞融合、病毒转化、噬菌体展示筛选所用的基因库、体内和体外技术等内容无需太详细描述。

但关乎产品安全性和有效性的信息，如氨基酸和翻译后修饰等对免疫原性或效应子功能有影响的改变、外源试剂和潜在污染物的使用等，需要提交充分的资料来评价单克隆细胞系的同一性和纯度。

慎重考虑通过细胞融合或转化获得的永生化人/非人B淋巴细胞作为单克隆细胞系。

以人B淋巴细胞作为母细胞系会带来传染性病原体（包括变异型克雅氏病[variant Creutzfeldt-Jakob disease，vCJD]和EB病毒）的传播隐患。

高效生产单克隆抗体注射液的关键环节单克隆抗体注射液的生产是一项复杂而关键的过程，涉及多个环节。

以下是高效生产单克隆抗体注射液的关键环节的描述。

1. 靶抗原选择和制备选择合适的靶抗原对于生产高效的单克隆抗体注射液至关重要。

靶抗原应具有高免疫原性和充分具有代表性，以确保最佳的抗原特异性和抗体效价。

靶抗原的制备通常涉及基因工程技术，如重组蛋白表达和纯化。

2. 免疫原注射和免疫反应注射适量的免疫原进入实验动物体内，触发免疫反应是生产单克隆抗体注射液的关键步骤之一。

在此过程中，需要合理选择实验动物，例如小鼠。

合理的免疫程序和免疫途径的选择也是确保免疫反应的关键因素。

3. B细胞的融合和筛选在免疫反应后，需要从小鼠体内获取B细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

这些杂交瘤细胞能够持续产生单克隆抗体，具有较高的稳定性。

随后，通过细胞筛选方法，筛选出具有高亲和力和高特异性的杂交瘤细胞。

4. 单克隆抗体的大规模培养和纯化经过筛选后的杂交瘤细胞被大规模培养以产生足够的单克隆抗体。

培养过程中需要合理设计培养基和细胞培养条件，以促进细胞扩增和抗体产生。

此外，为了提高抗体的纯度，需要利用亲和层析或离子交换层析等技术进行抗体的纯化。

5. 抗体结构的鉴定与表征在生产单克隆抗体注射液的过程中，需要对实验得到的抗体进行结构的鉴定与表征。

例如，利用ELISA、Western blot和质谱等技术对抗体的亲和力、特异性、稳定性和纯度进行分析。

这些分析结果能够确保抗体的质量和一致性。

6. 制剂和灭菌在生产过程的最后阶段，需要对单克隆抗体进行适当的制剂和灭菌处理，以确保抗体的稳定性和无菌性。

制剂通常包括稀释液的选择、浓度的调整和合适的保存条件等方面。

灭菌操作则可以保证抗体产品不受细菌和真菌等污染物的影响。

7. 质量控制与质量验证生产单克隆抗体注射液的最后一个环节是质量控制与质量验证。

通过多种分析和检测方法，对抗体产品的质量特性进行评估和验证，以确保其符合相关的标准和规范。