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2006, Vol. 27, No. 03食品科学※基础研究30
参考文献：
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1997.收稿日期：2005-06-24 *通讯作者基金项目：国家自然科学基金(303710176)；高等学校博士点基金(2002037006)；江苏省自然科学基金(BK2003078)作者简介：黄明(1970-)
，男，博士，主要从事肉品质量控制研究。m-钙激活酶的分离纯化方法研究
黄 明，徐幸莲，马汉军，赵 莲，周光宏*
(南京农业大学 农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏 南京 210095)
摘 要：本试验对牛脾脏中的m-钙激活酶进行了分离纯化，以便进一步研究其动力学特性和在牛肉成熟中的作用。
对宰后30min牛肉匀浆后利用超高速冷冻离心、离子交换层析、疏水层析等技术，从中分离纯化出了m-钙激活酶，
测得其比活力为39.7U/mg。利用变性电泳对纯化后的样品进行了验证。
关键词：钙激活酶系统；m-钙激活酶；纯化
Study on the Purification of m-calpain
HUANG Ming，XU Xing-lian，MA Han-jun，ZHAO Lian，ZHOU Guang-hong*
(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture,
Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract ：This experiment was conducted for further investigation into m-calpain activity and its role in beef aging. Fresh yellow
cattle spleen (within 30min postmortem) was obtained and treated with procedures such as ultrahigh refrigeration homogenization,
ionic exchange chromatography, hydrophobic chromatography, etc. The resulted m-calpain with specific activity 39.7U/mg was
verified by way of SDS-PAGE
Key words：calpain system；m-calpain；purification
中图分类号：S879.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)03-0030-04
肉类动物屠宰后，在成熟过程中其食用品质特别是
嫩度会大大改善，很多学者认为这一过程和肉中自身的酶类有关系，特别是钙激活酶。钙激活酶有μ-钙激活
酶(μ-calpain)和m-钙激活酶(m-calpain)两种类型，属同31※基础研究食品科学2006, Vol. 27, No. 03
工酶，广泛存在于哺乳类动物的各种组织中[1,2]。肉中还存在钙激活酶的内源性的专一抑制蛋白(Calpastatin)，其和钙激活酶一起被称为钙激活酶系统(Calpain System)。在活体动物中，很多学者认为该系统与动物的肌肉生长发育有关，而在动物宰后则与肉的嫩度密切相关[3]。为了澄清肉的嫩化机理，有必要将钙激活酶和抑制剂一一分离纯化，并对分离后的成分进行研究。Koohmaraie[4]曾采用离子交换等手段对m-钙激活酶等三种成分进行了粗分离。而目前，国内对m-钙激活酶进行分离纯化的研究还鲜见报道。本研究旨在建立m-钙激活酶的分离方法，以便通过分析其动力学特性，为进一步研究肉的成熟机理和改善肉品质量提供理论依据。
1材料与方法
1.1仪器
低压层析系统 Pharmacia；匀浆器(B. BRAUN) 德
国；高速冷冻离心机(SCR20BC) 日立；电泳系统：
北京六一厂；pH计(PHS-3C) 上海雷磁厂；脱色摇床
南京大学实验仪器厂；紫外分光光度计(UV-754) 上
海；电子天平 上海第三仪器厂。
1.2试剂
DEAE Sephacel、Phenyl Sepharose、Butyl
Sepharose、TEMED Pharmacia公司；DEAE-TSK
Supelco公司；过硫酸铵(AP)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉
双丙烯酰胺(Bis)、十二烷基磺酸钠(SDS)、MES、
Casein-Hammerstein 美国USB公司；亮肽素
(Leupeptin)、苯甲基磺酰氟(PMSF) Roche公司；卵类
粘蛋白抑制剂(Ovomucoid)、Rective red 120-Agarose
Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.3试验方法
1.3.1钙激活酶系统的粗分离
钙激活酶系统的分离纯化流程见图1。取刚屠宰后
30min的黄牛脾脏，经修整后(300g)在4℃匀浆，匀浆时
加1L抽提液(pH8.3、100mmol/L Tris-HCl，10mmol/L
EDTA，0.05%MCE，100mg/L Ovomucoid，2mmol/L
PMSF，6mg/L Leupeptin)。然后离心(4℃、18000×g、
1.5h)，弃去沉淀，取上清。对上清蛋白进行硫酸铵分
级沉淀，取P0-45沉淀部分，用适量抽提液溶解后透析
(pH7.5、20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，0.1%
MCE)，再经超速冷冻离心(4℃、100000×g 1.5h)后，
将上清过DEAE-Sephacel离子交换柱(2.6×66cm)，该柱
要先用平衡缓冲液TEMA(4℃、pH7.5、20mmol/L Tris-
HCl，1mmol/L EDTA，0.1%MCE，1mmol/L NaN3)平
衡，上样后将杂蛋白洗脱至基线，然后用0～350mmol/
L NaCl的TEMA溶液线性梯度洗脱，在接收管中测μ-
钙激活酶、m-钙激活酶和钙激活酶抑制蛋白的活性，将
↓↓↓m-calpainμ-calpaincalpastatin↓Phemyl-Sepharose↓ReactiveRed-120Agarose↓DEAE-TSK↓纯m-calpain牛脾脏↓匀浆↓离心↓P0-45↓透析↓离心↓DEAE-Sephacel
图1 m-calpain的纯化流程图Fig.1 Schematic diagram showing the procedures used to purifym-calpain from at-death bovine spleen
得到的分别具有μ-钙激活酶、m-钙激活酶和钙激活酶
抑制蛋白的活性的收集液集合，再做进一步纯化。
1.3.2m-钙激活酶的纯化
将过DEAE-Sephacel柱分离到的具有m-Calpain活性
的样品上经130mmol/L NaCl的TEMA溶液平衡过的Phenyl
Sepharose疏水层析柱(2.6×33cm)，然后用平衡液洗去未
吸附蛋白，再用洗脱液(1mmol/L EDTA，0.1% MCE，
pH7.5)将目的蛋白洗脱。得到的具有m-calpain活性的样
品添加NaCl，使其浓度达到0.5mol/L，再上经平衡液
(含0.5mol/L NaCl的TEMA溶液)平衡过的Reactive-Red
120 Agarose柱(1.6×25cm)，经平衡液洗去未吸附蛋白
后，用洗脱液(pH8.5、10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L
EDTA，0.1%MCE)洗脱，将得到的样品再上经平衡液
(pH6.5、20mmol/L Tris-MES，1mmol/L EDTA，0.1%
MCE)平衡过的DEAE-TSK柱(1.6×15cm)，先用洗脱液
(pH6.5、20mmol/L Tris-MES，1mmol/L EDTA，0.1%
MCE，130mmol/L NaCl)洗去杂蛋白，然后用梯度为
