雷帕霉素高产菌种和生产工艺技术
雷帕霉素（西罗莫司、Sirolimus、Rapamycin）雷帕霉素是新型大环内酯的抗排斥药物，是目前世界上最新的强效免疫抑制剂，临床上用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。它的免疫抑制活性比现行临床广泛使用的环孢素强数十倍，毒性低，用量小，且与环孢素有协同免疫抑制作用，临床上与环孢素联合使用。与环孢素和FK506（他克莫司）相比，西罗莫司是肾毒性最低的免疫抑制剂，且无神经毒性。美国已在全球80个中心进行1295例肾移植试验，效果显著，副作用极小。 抑制原理：可能通过阻断IL-2启动的T细胞增殖而选择性抑制T细胞，用于抗移植排斥反应。 由于美国生产的雷帕霉素在我国未能获得行政保护，故国内企业可以生产雷帕霉素。据了解，自2001年至今，SFDA已先后批准了7家企业生产雷帕霉素，其中浙江新昌制药厂、福建科瑞药业、杭州中美华东制药、华北制药科研开发公司4家为雷帕霉素原料药厂。获批准的雷帕霉素统一命名为“西罗莫司”。
市场情况:近年来，国产雷帕霉素口服制剂类抗排异药的销量迅速上升。有消息称，目前我国生产的环孢素A年产量已达2吨左右，而雷帕霉素产量则已超过环孢素。这是因为国内企业经过工艺革新，突破了生产雷帕霉素的技术壁垒。目前，四川宜宾韦希药业公司的雷帕霉素年产能力已达1吨。此外，天津新美科技公司也有一定的雷帕霉素原料药生产能力，产品不仅供应国内市场，还有少量出口至海外市场。估计国内雷帕霉素的总产能已达5吨(但实际产量可能没有那么多，因为药厂必须根据订单来制定产量)，这已大大超过国内开发上市较早的环孢素A的年产量。
目前生产工艺介绍:
菌种来源:美国
工艺水平:
生产上发酵单位1000-1200mg/L
发酵周期为192-204小时。
提取收率：45%
产品纯度：97-98%
生产规模：5吨罐
生产成本:约10000元/公斤
产品国内售价:约700000元/公斤
提供的服务：菌种；种子、发酵配方工艺，提炼工艺。
青霉素生产工艺 摘要：青霉素是一种重要的抗生素，在目前的制药工业中占有举足轻重的地位，生产规模非常大。通过数十年的完善，青霉素针剂和口服青霉素已能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病，增强了人类治疗传染性疾病的能力。研究和优化其生产工艺对人类健康有重要意义。 关键词;青霉素；生产工艺 抗生素在目前的制药工业中仍占有举足轻重的地位，尤其是下游半合成抗生素的发展，进一步刺激了上游的工业发酵。一些抗生素的工业生产规模非常大，如β-内酰胺类的青霉素、头孢菌素C，大环内酯类的红霉素、利福霉素，氨基环醇类的链霉素、庆大霉素。其它的一些抗生素，如林可霉素、四环素、金霉素、万古霉素等，单个发酵罐容积越来越大，100 m3的发酵罐被普遍采用，200 m3甚至更大容积的发酵罐经常可见报道。 抗生素的工业生产包括发酵和提取两部分。工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。种子和发酵培养基的常用碳源有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有机酸等，主要为菌体生长代谢提供能源，为合成菌体细胞和目的产物提供碳元素。有机氮源多用玉米浆、黄豆饼粉、麸质粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等，硫酸铵、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸铵则是常用的无机氮源。另外，培养基中还得添加无机盐、微量元素以及消沫剂，部分抗生素还得加入特殊前体，如青霉素的前体是苯乙酸，大环内酯类抗生素的前体是丙酸盐。发酵过程普遍补加一种碳源、氮源物质，如葡萄糖和硫酸铵。pH值通过流加氨水进行调节，很多抗生素在发酵中后期流加前体，对提高产量非常有益。抗生素发酵绝大多数为好氧培养，必须连续通入大量无菌空气，全过程大功率搅拌。发酵液的预处理，一般加絮凝剂沉淀蛋白，过滤去除菌丝体，发酵滤液的提取常用溶媒萃取法、离子交换树脂法、沉淀法、吸附法等提纯浓缩，然后结晶干燥得纯品。现在来介绍一下青霉素的生产工艺。 一、青霉素概述 青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。最初青霉素的生产菌是音符型青霉菌，生产能力只有几十个单位，不能满足工业需要。随后找到了适合于深层培养的橄榄型青霉菌，即产黄青霉（P. chrosogenum），生产能力为100U/ml。经过X、紫外线诱变，生产能力达到1000－1500U/ml。随后经过诱变，得到不产生色素的变种，目前生产能力可达66000－70000U/ml。青霉素是抗生素工业的首要产品。中国为青霉素（penicillin）生产大国，国内生产的青霉素，已占世界产量的近70%，国内较大规模的生产企业有华药、哈医药、石药、鲁抗，单个发酵罐规模均在100 m3以上，发酵单位在70000 U/ml左右，而世界青霉素工业发酵水平达100000 U/ml以上。 青霉素应用 临床应用：40多年，主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。 二、发酵条件下的生长过程
经典信号通路之PI3K-AKT-mTOR信号通路 PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与v．src和v．ras等癌基因的产物相关，且PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。由调节亚基p85和催化亚基p110构成。 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K活性的增加常与多种癌症相关。 PI3K磷 酸化磷脂酰肌醇PI(一种膜磷脂)肌醇环的第3位碳原子。PI在细胞膜组分中所占比例较小，比磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸含量少。但在脑细胞膜中，含量较为丰富，达磷脂总量的10%。 PI的肌醇环上有5个可被磷酸化的位点，多种激酶可磷酸化PI肌醇环上的4th和5th位点，因而通常在这两位点之一或两位点发生磷酸化修饰，尤其发生在质膜内侧。通常，PI-4,5-二磷酸(PIP2)在磷脂酶C的作用下，产生二酰甘油(DAG)和肌醇-1,4,5-三磷酸。PI3K转移一个磷酸基团至位点3，形成的产物对细胞的功能具有重要的影响。譬如，单磷酸化的PI-3-磷酸，能刺激细胞迁移(cell trafficking)，而未磷酸化的则不能。PI-3,4-二磷酸则可促进细胞的增殖(生长)和增强对凋亡的抗性，而其前体分子PI-4-磷酸则不 然。PIP2转换为PI-3,4,5-三磷酸，可调节细胞的黏附、生长和存活。
PI3K的活化 PI3K可分为3类，其结构与功能各异。其中研究最广泛的为I类PI3K, 此类PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基和一个催化亚基组成。调节亚基含有SH2和SH3结构域，与含有相应结合位点的靶蛋白相作用。该亚基通常称为p85, 参考于第一个被发现的亚型(isotype),然而目前已知的6种调节亚基，大小50至110kDa不等。催化亚基有4种，即p110α, β,δ,γ，而δ仅限于白细胞，其余则广泛分布于各种细胞中。 PI3K的活化很大程度上参与到靠近其质膜内侧的底物。多种生长因子和信号传导复合 物，包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、人生长因子(HGF)、血管位蛋白I(Ang1)和胰岛素都能启始PI3K 的启动 过程。这些因子启动受体酪氨酸激酶(RTK)，从而引起自磷酸化。受体上磷酸化的残基为异源二聚化的PI3Kp85亚基提供了一个停泊位点 (docking site)。然而在某些情况下，受体磷酸化则会介导募集一个接头蛋白(adaptor protein)。比如，当胰岛素启动其受体后，则必须募集一个胰岛素受体底物蛋白(IRS)，来促进PI3K的结合。相似的，当整连蛋白 integrin(非RTK)被启动后，粘着斑激酶(FAK) 则作为接头蛋白，将PI3K通过其p85停泊。但在以上各情形下，p85亚基的SH2和SH3结构域均在一个磷酸化位点与接头蛋白结合。PI3K募集到活化的受体后，起始多种PI中间体的磷酸化。与癌肿尤其相关的PI3K转化PIP2为PIP3。 PIP3作为锚定物(anchor) 许多蛋白含有一个Pleckstrin Homology(PH)结构域，因而可使其与PI-3,4-P2或PI-3,4,5-P3相结合。这种相互作用可以控制蛋白与膜结合的时间与定位，通过这种方式来调节蛋白的活性。蛋白与脂质间的这种相互作用亦可能引起蛋白构像的变化而改变蛋白的功能。PI3K启动的结果是在质膜上产生第二信使PIP3, PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT和PDK1(phosphoinositide dependent kinase-1)结合, 促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308导致AKT活化。其它PDK1的底物还包括PKC(蛋白激酶C)、S6K(p70S6)和 SGK(serum/glucocorticoid regulated kinases)。AKT, 亦称为蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效应物。AKT可分为3种亚型(AKT1、AKT2、AKT3或PKBα, PKBβ,PKBγ)，3种亚型的功能各异，但也有重迭。该家族主要有三个成员：AKT1，AKT2和AKT3。其中，Akt1通过抑制细胞凋亡过程参与了细胞生存途径，Akt1酶也能诱导蛋白质的合成途径，因此是一个重要的信号蛋白介导组织的生长。因为它可以阻止细胞凋亡，从而促进细胞的存活，AKT1参与了在许多类型的癌症发生。AKT2是胰岛素信号转导通路中的一个重要信号分子，而AKT3则是主要表达在脑部。它的启动机制是：PI3K可以被g蛋白偶联受体或者受
现代抗生素工业生产过程如下： 菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装 一、菌种 从来源于自然界土壤等，获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即称为菌种。菌种可用冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱(-190℃~-196℃)内保存。所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。如条件不足时，则沿用砂土管在0℃冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。一般生产用菌株经多次移植往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化以提高其生产能力。 二、孢子制备 生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌手续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5-7日或7日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的。为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大培养。 三、种子制备 其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大培养。或直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。在种子罐中培养时，在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶的菌丝，以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。接种量视需要而定。如用菌丝，接种量一般相当于0.1%—2%(接种量的%，系对种子罐内的培养基而言，下同) 。从一级种子罐接入 二级种子罐接种量一般为5%—20%，培养温度一般在25—30℃。如菌种系细菌，则在32—37℃培养。在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气。控制
中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制 2015年05月21日08:16来源：《中国科学报》 原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制 （记者朱汉斌、丁佳通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5月18日，相关成果在线发表于《自然·细胞生物学》杂志。 据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS细胞）具有正常的多能性。 据了解，2006年，日本科学家建立的iPS细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的iPS细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。 什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。 最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。
【研发前沿】 雷帕霉素衍生物的开发进展 栗东方，陈秀华? （上海医药工业研究院药理室，上海２００４３７） ?综述? 摘要：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）是很有希孥的抗肿瘤药物的新靶点，针对ｒｏＴＯＲ的小分子抑制剂已成为国内外药物研究的热点，目前已有药物获美国药品食品管理局批准上市。本文综述ｒｏＴＯＲ信号通路的研究进展，以及国外ｒｏＴＯＲ抑制剂的开发进展。 关键词：雷帕霉素：哺乳动物；雷帕霉素靶蛋白；抗肿瘤药物；信号通路 中图分类号：Ｒ９７９．１．９文献标志码：Ａ文章编号：１６７２—９１８８（２０１０）０１—００３１－０４ Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎａｎａｌｏｇｕｅｓ ＬＩＤｏｎｇ－ｆａｎｇ，ＣＨＥＮＸｉｕ－ｈｕａ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｍｍａｌｉａｎｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）ｉｓａｐｒｏｍｉｓｉｎｇｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｓ．ＳｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍＴＯＲｈａｖｅｂｅｃａｍｅａｈｏｔｓｐｏｔｉｎｔｕｌｎｏｒｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄｔｗｏｏｆｔｈｅｍｈａｖｅｂｅｅｎａｐｐｒｏｖｅｄｂｙｔｈｅＦＤＡ．ＴｈｉｓｒｅｖｉｅｗｄｅｓｃｒｉｂｅｄｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ，ａｓｗｅｌｌａｓｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｍＴＯＲｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒａｐａｍｙｃｉｎ；ｍａｍｍａｌｉａｎ；ｔａｒｇｅｔｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ；ａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕｇｓ；ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ 酪氨酸激酶主要分为受体型和非受体型，其中受体型酪氨酸激酶（ＲＴＫ）的两条下游信号通路，即Ｒａｓ．促分裂原活化蛋白酶（ＭＡＰＫ）信号通路和磷脂酰肌醇．３激酶／蛋白激酶Ｂ／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｐ１３Ｋ／Ａｈ，ｍＴｏＲ）信号通路，是抗肿瘤药物研发的潜在靶点。针对ｒｏＴＯＲ的小分子抑制剂——酪氨酸激酶抑制剂（ＴⅪ）的研究进展很快，已有雷帕霉素衍生物获美国食品药品管理局（ＦＤＡ）批准上市，如ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ于２００７年５月获ＦＤＡ批准用于晚期肾细胞癌（ＲＣＣ）治疗，依维莫司（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）于２００９年３月获ＦＤＡ批准用于治疗舒尼替尼或索拉菲尼治疗失败的晚期ＲＣＣ，同时也有多个关于ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ的临床研究正在进行。目前开发上市的药物克服了雷帕霉素溶解性和稳定性差的问题，有望成为新型抗肿瘤药物。国内有关研究报道尚不多， 收稿１３期：２００９－０７．１５；修回日期：２００９－１０－３０ 作者简介：栗东方，在读硕士研究牛，专业方向：肿瘤药理学。 通讯作者：陈秀华，研究员。硕士研究生导师，从事肿瘤药理学研究。 基金项目：“重大新药刨制”科技重大专项资助（项目编号： ２００９ＺＸ０９３０１－００７） ３ｌ本文就ｍＴＯＲ信号通路及雷帕霉素衍生物的研究开发进展作一综述。 １ｍＴＯＲ信号通路 酪氨酸激酶是与细胞增生分化密切相关的细胞信号转导通路的关键酶，其与肿瘤发生发展关系密切，其异常表达可直接导致肿瘤的发生，并与肿瘤转移、血管生成和对化疗的耐药有关。 ＲＴＫ是目前抗肿瘤药物潜在靶点研究的重点（已报道５８种）Ⅲ。其Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ信号通路中，Ｐ１３Ｋ可激活Ａｋｔ，并最终激活ｍＴＯＲ。ｍＴＯＲ是细胞生长增生的中心调控者旧４Ｊ，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调控。人体多种肿瘤细胞中可见ｍＴＯＲ通路的失调。 ｍＴＯＲ在细胞内以两种不同的复合物形式存在，即Ｃｌ和Ｃ２。已知的ｍＴＯＲ对肿瘤细胞生长、分化和代谢的作用均由Ｃｌ完成。Ｃ１促进蛋白质合成并抑制Ｐ１３刚Ａｋｔ通路的分子机制尚不明确，但很多肿瘤中Ｃ１通路活化，且Ｃ１对雷帕霉素及类似物敏感Ｈｏ。Ｃ１通过两种途径调节下游核糖体和 万方数据
青霉素生产工艺 摘要：青霉素是人类最早发现的一种极其重要的抗生素,其杀伤革兰氏阳性细菌的神奇功效在二战中挽救了众多士兵的生命。它的发现对药物学乃至整个人类发展的重要意义。本文将对青霉素的生产工艺及其提取进行深入的讲解。 关键词：青霉素生产工艺发酵提取 一、青霉素的生物学特性 青霉素类抗生素是β-内酰胺类中1种,在分类上属于A类，酶的活性位点 上有丝氨酸，又称活性位点丝氨酸酶，其作用机制是水解β-内酰胺类抗生素 的β-内酰胺环，使抗生素失去活性。由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁, 而人类只有细胞膜无细胞壁,故对人类的毒性较小,除能引起严重的过敏反应 外,在一般用量下,其毒性不甚明显,但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生 的酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾 盐、钠盐之分,钾盐不仅不能直接静注,静脉滴注时,也要仔细计算钾离子量,以 免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能,造成死亡。 二、青霉素的发酵 青霉素的发酵生产的一般工艺流程： 青霉素生产菌不同，发酵工业也有区别。 丝状菌的青霉素发酵工艺流程：沙土管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～ 7d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，6～7d）→种子罐（种子培养，25℃，
40～45h）→繁殖罐（种子培养，25℃，13～15h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐 球状菌的青霉素发酵工艺流程：冷冻管→斜面母瓶（孢子培养，25℃，6～8d）→大米孢子斜面（孢子培养，25℃，8～10d）→种子罐（种子培养，28℃，50～60h）→发酵罐（发酵，26℃，6～7d）→放罐 青霉素的分批发酵分为菌丝生长和产物合成两个阶段，进入合成阶段的必要条件是降低菌丝的生长速率。影响青霉素发酵产率的因素有环境和生理因素两个方面，前者包括温度、PH、培养基种类及浓度、溶解氧饱和度等；后者包括菌体浓度、菌体生长速率、菌丝形态等。 菌体生长和青霉素合成最适温度并不相同，一般前阶段略高于后阶段。因此，在菌体生长阶段可以采取较高温度，以缩短生长时间，而到达产物合成阶段，应适当降低温度，以利于青霉素的合成。青霉素发酵的最适PH一般在左右，由于青霉素在碱性条件下不稳定，容易发生水解，因此应尽量避免PH超过。 三、青霉素发酵过程控制 反复分批式发酵，100m3发酵罐，装料80m3，带放6－10次，间隔24h。带放量10％，发酵时间24h。发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。 在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前40h生长，而在40h后，靠低速连续补加葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。 （1）培养基 青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节是根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。 碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。经济核算问题，生产成本中碳源占12％以上，对工艺影响很大；糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。葡萄糖、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。
青霉素生产工艺过程 一、青霉素的发酵工艺过程 1、工艺流程 （1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25℃，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25℃，孢子培养，7天）——大米孢子（26℃，种子培养56h,1:1.5vvm）——一级种子培养液（27℃，种子培养，24h,1:1.5vvm）——二级种子培养液（27~26℃,发酵,7天,1:0.95vvm）——发酵液。 （2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25℃，孢子培养，6~8天）——亲米（25℃，孢子培养，8~10天）——生产米（28℃，孢子培养，56~60h,1:1.5vvm）——种子培养液（26~25-24℃，发酵，7天，1：0.8vvm）——发酵液。 2、工艺控制 （1）影响发酵产率的因素 基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制，苯乙酸的生长抑制），而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成，为了避免这一现象，在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加，因为即使是超出最适浓度范围较小的波动，都将引起严重的阻遏或限制，使生物合成速度减慢或停止。目前,糖浓度的检测尚难在线进行, 故葡萄糖 释放率予以调节。的流加不是依据糖浓度控制,而是间接根据pH 值、溶氧或C0 2 （2）温度：青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别，但一般认为应在25℃左右。温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说，最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度，以利于青霉素的合成。（3）pH值：青霉素发酵的最适pH值一般认为在6.5左右,有时也可以略高或略低一些，但应尽量避免pH值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。 （4）溶氧：对于好氧的青霉素发酵来说，溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于10%饱
放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取 一、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法； 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基 本原理和操作技术 二、实验原理 ①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 ②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线
菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 ③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。 抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。
雷帕霉素免疫抑制和抗肿瘤双重效应的研究进展雷帕霉素（RAPA）是一种大环内酯类抗生素，最初RAPA在临床上主要 作为一种强力的免疫抑制剂而广泛使用，其对多种自身免疫性疾病有显著疗效，而且在器官移植术后显示出良好的抗排斥反应活性，副作用较小，近年来又发现其具有抗肿瘤作用，是一种具有免疫抑制和抗肿瘤双重作用的药物。本文就雷帕霉素（RAPA）双重药理作用的研究进展作一简要综述。 标签：雷帕霉素；免疫抑制剂；抗肿瘤 传统的免疫抑制剂如硫唑嘌呤（AZA）、环孢素（CsA）等在临床上得到广泛应用，但其过敏反应、肝肾毒性、骨髓抑制等副反应屡见不鲜，尤其会带来一个严重的并发症，那就是增加肿瘤风险，Guba等[1]动物实验发现，环孢素A可诱发小鼠原发和转移性肿瘤发生，新型免疫抑制剂雷帕霉素免疫效应是环孢素10倍以上，而且还具备抗肿瘤效应，免疫抑制剂量（1.5mg/kg）的雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）可以使小鼠肝脏原发与转移性肿瘤的体积缩小70%，使鼻咽部肿瘤的体积缩小87%，可显著延长带瘤小鼠的生存周期。它的双重功效不仅可以使其单独针对性应用于临床，还可以应用于需免疫抑制和抗肿瘤联合治疗的交叉领域。 1 雷帕霉素 RAPA是Vezina和She gal从加拿大Rapa Nui岛的土壤中分离的一种具有抗真菌作用的三烯大环内酯类化合物，分子式为C51H79NO13，化学结构与同类免疫抑制剂他克莫司（FK506）相似，为白色或微黄色固体结晶，熔点为183～185℃，亲脂性，易溶于甲醇、丙酮、氯仿、乙醇等有机溶剂，几乎不溶于乙醚和水。最初被研究作为低毒性的抗真菌药物，从1977年发现其具有免疫抑制作用，1989年把RAPA首次作为治疗器官移植排斥反应药物，近年又发现其具有抗肿瘤的作用，其独特的双效性使其具有广阔的临床开发应用前景。 2 雷帕霉素的作用机制 2.1 雷帕霉素的免疫抑制机制 （1）雷帕霉素通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，将免疫细胞（T细胞和B细胞）滞留于G1/S期，阻止免疫细胞进入S期及抑制DNA的合成，从而抑制免疫细胞的生长、增殖[2]。（2）雷帕霉素抑制IL-2以及其他的免疫分子的合成，从而抑制机体免疫功能的发挥[3-4]。（3）抑制IgG和供者特异性抗体（细胞毒抗体）产生。 2.2 雷帕霉素的抗肿瘤机制 （1）雷帕霉素通过雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制细胞从G1到S
青霉素生产工艺过程 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
青霉素生产工艺过程 一、青霉素的发酵工艺过程 1、工艺流程 （1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25℃，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25℃，孢子培养，7天）——大米孢子（26℃，种子培养56h,1:）——一级种子培养液（27℃，种子培养，24h,1:）——二级种子培养液（27~26℃,发酵,7天,1:）——发酵液。 （2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25℃，孢子培养，6~8天）——亲米（25℃，孢子培养，8~10天）——生产米（28℃，孢子培养，56~60h,1:）——种子培养液（26~25-24℃，发酵，7天，1：）——发酵液。 2、工艺控制 （1）影响发酵产率的因素 基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制，苯乙酸的生长抑制），而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成，为了避免这一现象，在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法，即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加，因为即使是超出最适浓度范围较小的波动，都将引起严重的阻遏或限制，使生物合成速度减慢或停止。目前,糖浓度的检测尚难在线进
行, 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制,而是间接根据pH 值、溶氧或C02释放率予以调节。 （2）温度：青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别，但一般认为应在25℃左右。温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说，最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度，以利于青霉素的合成。 （3）pH值：青霉素发酵的最适pH值一般认为在左右,有时也可以略高或略低一些，但应尽量避免pH值超过, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。 （4）溶氧：对于好氧的青霉素发酵来说，溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于10%饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高，说明菌丝生长不良或加糖率过低，造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 而氧消耗与碳能源消耗成正比, 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。 （5）菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓
抗生素发酵生产知识 1、微生物发酵的概念及发展史。 答：1857年巴斯德提出著名发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”。 1929年Flemming爵士发现了青霉素，增加一大类新产品－抗生素。 20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物-抗生素为主要特征的抗生素工业成为微生物发酵工业技术的支柱产业。 20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为微生物技术产业的又一个成员，实现了对微生物的代谢进行人工调节，这又使微生物技术进了一步。 20世纪60年代，微生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。 20世纪70年代，为了解决由于人迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。 80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为微生物发酵技术引入了遗传工程的技术，使微生物技术进入了一个新的阶段。 目前，人们把利用微生物在有氧或无氧状态下通过生命活动来制备微生物菌体或其它代谢产物的过程统称为发酵。 2、发酵产品的生产特点是什么？ 答：发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下： （1）发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。 （2），发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 （3）发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物。 （4）由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。 （5）发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。 （6）微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。 （7）工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快，开可以取得显著的经济效益。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌’来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和和创新。 3、从微生物分类学的角度，把菌种分为几大类？ 答：分为：细菌类，如短杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等；酵母菌类，如啤酒酵母、酒精酵母等；霉菌如黄曲霉、红曲霉、青霉菌和赤霉菌等；放线菌如链霉素、庆大霉素等。 4、作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有什么特点？ 答：(1)具有稳定的遗传学特性。(2)微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求。 (3)生长条件易于满足。(4)具有较高的各种酶活力，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短。（5）对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。（6）无杂菌污染。
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。 临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L; Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配; 400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存; 3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成 用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。 文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些 无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。 EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了 Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。 sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存 不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。 Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。 1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol； 2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。 正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的
雷帕霉素 NO STRUCTURE 产品编号：ALG-A03574 中文名称：雷帕霉素 英文名称：Rapamycin 别名：雷帕霉素;西罗莫司;雷帕霉素,99%;瑞帕霉素;西罗莫司(雷帕霉素);西罗莫司口服液;雷帕霉素/西罗莫司;雷帕酶素 AY 22989;23,27-EPOXY-3H-PYRIDO(2,1-C)(1,4)OXAAZACYCLOHENTRIACONTINE;NSC-226 080;RAPA;RAPAMUNE;RAPAMYCIN;RAPAMYCIN, STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS;RPM CAS：53123-88-9 MDL：MFCD00867594 分子式：C51H79NO13 分子量：914.17 产品说明
用途:免疫抑制剂。 免疫抑制剂：雷帕霉素(RAPA)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂,为白色固体结晶，熔点为183-185℃，亲脂性，溶解于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂，极微溶于水，几乎不溶于乙醚。早在20世纪70年代就被研发出来，起初被作为低毒性的抗真菌药物,1977年发现具有免疫抑制作用,1989年开始把RAPA作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行试用,从动物实验及临床应用的效果看，是一种疗效好，低毒，无肾毒性的新型免疫抑制剂。现在经常作为维持移植器官免疫能力的药物（特别是肾移植），以减缓器官移植手术后的免疫排斥反应,然而科学家近期发现它另外一种用途：可用于治疗阿尔茨海默症(老年性痴呆)。令他们颇感兴趣的是，雷帕霉素的主要成分也存在于复活岛隔离土壤中的细菌产物，最新实验表明该物质施用在实验老鼠患体上可起到恢复识记缺陷能力。 雷帕霉素属大环内酯类抗生素，与普乐可复（FK506）的结构相似，但却有非常不同的免疫抑制机制。FK506抑制T淋巴细胞由G0期至G1期的增殖，而RAPA则通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，和FK506相比，RAPA可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路。 芝加哥大学医学研究人员利用市售雷帕霉素口服片加上葡萄柚汁治疗黑色素瘤（一种欧美人常见的恶性肿瘤疾病），可大大提高其他化疗药物的抗癌效果，从而延长患者的存活时间。研究表明，雷帕霉素在进入消化道后很容易被酶分解，而葡萄柚汁里含大量的呋喃香豆素类成分，后者能抑制消化道酶对雷帕霉素的破坏作用，故能提高雷帕霉素的生物利用度。据说最早荷兰医生已发现：葡萄柚汁具有提高山地明的口服吸收效果的作用，现欧美国家医生将其应用到雷帕霉素制剂上。 贮存:贮存温度-20℃
青霉素的发酵工艺 青霉素生产工艺过程 一、青霉素的发酵工艺过程 1、工艺流程 （1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h,1:1.5vvm）——一级种子培养液（27°C，种子培养，24h,1:1.5vvm）——二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天,1:0.95vvm）——发酵液。 （2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25°C，孢子培养，6~8天）——亲米（25°C，孢子培养，8~10天）——生产米（28°C，孢子培养，56~60h,1:1.5vvm）——种子培养液（26~25-24°C，发酵，7天，1：0.8vvm）——发酵液。 2、工艺控制 （1）影响发酵产率的因素 基质浓度在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制, 苯乙酸的生长抑制）, 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成, 为了避免这一现象, 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法, 即对容易产生阻遏、抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。这里必须特别注意的是葡萄糖的流加,
因为即使是超出最适浓度范围较小的波动, 都将引起严重的阻遏或限制, 使生物合成速度减慢或停止。目前, 糖浓度的检测尚难在线进行, 故葡萄糖的流加不是依据糖浓度控制, 而是间接根据pH 值、溶氧或C02 释放率予以调节。 （2）温度青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 ,同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。（3） pH 值青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起 pH 值上升。 （4）溶氧对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同
雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤 后的运动功能障碍 摘要:哺乳动物雷帕霉素的受体(mTOR)是负向调节自噬的丝氨酸/苏氨酸激酶。雷帕霉是mTOR 信号抑制剂，可以促进自噬并在中枢神经系统 (CNS) 的几种疾病中起到神经保护作用。在本研究中，我们评估了小鼠脊髓损伤 (SCI) 后，应用雷帕霉素是否促进自噬，并降低神经组织损伤和减少运动功能障碍。我们的结果表明雷帕霉素的应用大大减少了损伤脊髓组织中p70S6K 蛋白质的磷酸化以及LC3和Beclin 1 的高表达。此外，损伤脊髓组织中，雷帕霉素组的神经元丢失和细胞死亡率明显低于溶剂对照组。并且，在大鼠后肢运动功能评分--（BMS评分）中，雷帕霉素处理组得分明显高于溶剂对照组。这些结果表明，脊髓损伤后，雷帕霉素通过抑制 mTOR 信号通路，提高自噬水平，并减少神经组织损伤和运动功能障碍。脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗可能成为一种新的治疗策略。 关键词：自噬；Beclin1；LC3；雷帕霉素靶蛋白；雷帕霉素；脊髓损伤 前言：雷帕霉素是一种大环内酯类药物，最初被用作抗真菌剂。雷帕霉素是一种特殊的哺乳动物雷帕霉素受体阻滞剂(Ravikumar et al., 2004; Schmelzle and Hall, 2000)。它结合于胞质的FK结合蛋白(FKBP12)。雷帕霉素-FKBP12复合物抑制mTOR，阻止p70S6K 和4EBP1的磷酸化(Vignot et al., 2005)。因此，雷帕霉素抑制mTOR 从而促进自噬(Kamada et al., 2004;Klionsky and Emr, 2000;
Schmelzle and Hall, 2000; Wang and Klionsky, 2003)。 自噬是一种细胞内的分解代谢的机制，通过自噬溶酶体途径降解细胞质成分(Mizushima, 2004)。这种机制对维持稳态起着重要的作用，在某些疾病中起到保护作用(Hara et al., 2006; Liang et al., 1999; Ru-binsztein et al., 2005; Shintani and Klionsky, 2004)。自噬在细胞生长和应激状态下清除或者再利用长寿蛋白和受损的细胞器(Levine and Klionsky, 2004;Shintani and Klionsky, 2004)。已有研究表明，自噬对正常细胞的生长，分化和存活也很重要(Reggiori and Klionsky, 2002; Schmelzle and Hall, 2000)。 新近研究表明，应用雷帕霉素能够增强自噬，在亨廷顿病和帕金森病等某些神经退行性疾病中能够保护神经细胞(Malagelada et al., 2010; Ravikumar et al.,2004)。在这些退行性疾病中，应用雷帕霉素诱导自噬能够增强对聚集蛋白的清除从而减少其毒性(Berger et al., 2006; Webb et al., 2003)。以往的研究表明，在创伤性脑损伤和脑缺血后的神经组织中自噬活动是增强的(Bigford et al., 2009; Diskin et al., 2005; Ramiet al., 2008)。应用雷帕霉素增强自噬的活性并降低脑外伤和新生儿缺氧缺血性脑损伤的神经组织损伤(Carloni et al., 2008; Erlich et al., 2007a)。一些研究也表明，自体吞噬增强可以减少受中枢神经系统（CNS）中受损神经细胞的凋亡(Carloni et al., 2008; Pan et al., 2008)。因此，使用雷帕霉素促进自噬被认为能够在中枢神经系统中起到神经保护功能。