鼻粘膜组织培养
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年 !
卷
期
一∀!
一
#∀
鼻粘膜
组织培养
中国
人民解放军总
医院耳
弄咽喉科研
究所∃
北京##∀%!&
王丰综述
苏振伦
审校
〔摘要∋到目
前为止人
类气道上
皮细胞
培养有四种方法
利用
外植块培养法
成
纤维细胞滋
养层
支持
法!气
液界面
培养法∀分离
细胞直
接种植法
利用
鼻粘膜组织
培养研究了上
皮受损后
的恢复过程
观察到
速尿
能抑
制人
类鼻粘膜细
胞前列腺
素#
∃
的
合成
鼻粘膜腺体细胞
的分离达到了
精细
的程
度乙
酞胆
碱能调节鼻粘
膜腺
细
胞内
游离
钙%
民&∋
〕)
鼻粘膜浆液腺细
胞∗+
一
通道
的激活
依靠乙酞胆
碱诱导的细
胞内,∗&
−∋.
,
的升高/0
大环
内
醋类抗生
素能抑
制此
种∗+
一流
鼻粘膜上皮细胞∗+一
的分泌
受123
和423
的影响
近
/5余年
人类鼻腔粘膜组织
的培养方法
及其生化和
组化研究取得了
较大进展
鼻腔粘
膜细胞的分离达到了
精细的程
度并对其离子
通道的特性及调控机制
进行了研究现
就近年
来
上述两
个方面的研究进展
进行综述
【
奔粘膜组织培养及
其
组化和生化研究】人
类气道上
皮培养目
前有四种
基本方法第
一种
系
利用
外植块培养法对其周围生长晕
中不断
增长的细胞进行培养
第二
种方法使用成纤维
细
胞滋养层
支持分离细
胞的生
长
第三种为气
液界面培养法川这种方法的步
骤如下∃
人
鼻粘
膜取自
患慢性鼻
阻塞或行鼻
整形手术
患者的下
鼻甲切下的组织立即放入67+
89:;<
改良
#&=+9<
培养基中%
6>
#>)
其中含有青霉素
%
−;;4≅+)
链霉素%
Α55拌=?≅+)
庆大霉素
%/55
拜=≅
+)
二
性霉素Β%5Δ
拼=?≅+)
以
6>
#>
洗三次去除血液和
粘液去掉出血和
坏死组织以0≅≅
活
组织检查钻切下
全厚鼻
粘膜片%
包括鼻粘膜和
粘膜
下层)
将这些
粘膜
片移植到+Ε+Ε;Φ:≅
含有胶原
的明
胶海绵
块
上明
胶海绵以6>
#>%
加入/5Γ
热灭活
胎
牛血清
和Δ5拜=?≅+
庆大霉素)
预水化至
少0
小
时粘膜块%
每个明胶海绵块放一片粘膜)
被单
个放
在平皿内平皿充以
适量培养基以保证上
皮位于
液相之上使组织块的上
皮层
向上
在气
液界面
粘膜下层
向下在明
胶海绵里培养基由
6>
#>
加丙
酸钠%ΗΦ
Ι?ϑ)
6
葡萄糖%
/Ι?
ϑ)
ϑ
谷氨酸
胺%−≅≅;+ϑ)
青霉素Κ%+;;4?≅+)
链霉素%/55
拌=≅+)
庆大霉素%Δ5
拼=?≅+)
二
性霉素Β%5ΑΔ
拌=?≅
+)和/5Γ
热灭活
胎牛血清
培养物在加湿
的充
有ΙΔΓ
Λ∃
和ΔΓ
∗Λ∃
的孵
箱里可存活
达ΦΑ
小时以单克隆抗体Μ(ΝΦ
为
标记指示
细胞增生程度结果显示
培养0
小时
后在整
个固
有层上面
出现
了一层
连续的增生
细胞Α0小时
后Μ(ΝΦ
染色阳
性细胞呈不
连续
的细胞丛沿基底膜分布
0Ο小时和ΦΑ
小时后
仅有个别增生细
胞出现
与其它
方法相比
较这
种方法使鼻粘膜细胞在无损伤的全厚粘膜片上
接近于生
理状态
的环
境下生长能
反应在体的
情形随
着技术的逐步
完善为鼻粘膜生
理学和
病理学研究提供
了很好的模型
第四种鼻粘膜
组织
培养方法则直接将分离
细胞种植在培养皿
里不
加成纤维细胞滋养层不
带移植组织这
种方法的具体操作如下∃
以
蛋白酶
处理法分离
细
胞将取好的人鼻粘膜组织以
加有Ν54≅
+
青霉素Ν5
拌=≅+
链霉素Δ5
拼=?≅+
庆大霉素的
Π;Θ+(<<
改良
低限量#
&=+9
无钙培养基%>
#>)
漂洗ΑΡΗ
次然后置入含有5/Γ
蛋白酶的
>
#>
孵化/Ν
小时温度为0
℃再加入/5Γ
胎牛血清%ΣΒΤ)
轻轻振荡将上
皮细
胞分离出
来
然后以
孔径05Ρ/55
拼≅
的过滤网
过滤在
0
℃
下离心%
/Δ5
Ι+;≅
(Υ)
沉淀重新放入一。Γ
ΣΒΤ>
#>
培养
基中再次离心
将
沉淀物制成
细胞悬液后
进行培养ς7
等川于/ΙΟ0
年建立
了用于
培养和
繁殖人
类鼻粘膜上皮细
胞的无血
清Σ,Α
基础
培养基其中
加入胰岛素%ΩΥ<)转铁
蛋
白%
2Ξ)
上
皮细胞生长因
子%
#ΚΣ)
氢化可
的松%Ψ∗)
霍乱毒素%
∗2)三碘甲腺原氨酸
一∀(
一国
外医学耳
鼻咽喉
科学
分册
∃
)!&
和
牛下丘脑提取物∃∗+,&
他们在这一实
验中观察到
七种附加营养成分必不
可少无血
清系
统较含血清系统更有利于
人类鼻粘膜上皮
细
胞的生长
与分化血清对鼻粘膜上
皮生长
具
有抑
制作用
形态
学研究表明纤毛
与粘液在
培
养过程
中∃
一周内&
消失但若用剥掉粘膜的兔
气管移植物作诱
导人
鼻
粘膜上
皮不仅能很好
地
生长
分化且具有粘液毡和
纤毛
运动功能
−.
等用
透射电镜
在培养
组织
中发现了无定形
物质生
化分析其为透明质酸∃+/&
和
硫酸乙
酞
肝素这些勺
质可能由人
鼻粘膜上
皮产生在
培养基中人
类鼻
粘膜细
胞∃+0,&
不
合成粘蛋
白而
合成+/
和
硫酸乙酞肝
素它
们的作用
可
能
与损伤有关+/
在细胞
膜合成与细
胞生长
动态
相关一切与膜有关的核昔酸及其衍生物
都可影
响+/
的生
成维生素/
可能影响核
昔
酸的合成从而
影响+/
合成酶的活性促进
+0,
的成熟和
分泌
许多作者研究了上
皮细
胞受损伤后其上皮
屏
障
完整性所受影响和
恢复过程未损伤上皮
的跨上
皮电阻∃)
,1&
大对甘露醇和
硝酸斓无
通透性当
气道上皮受损伤后其完整
性受到了
影
响在损伤区),1
下降
对氖标记甘露醇和
硝酸斓
的通透性增强上
皮细胞的完整性主
要
与
细胞间紧密连接有关234.563
775.874
95
∃ #一,&
是首先发现
的与紧密连结有关的蛋白
此外还有 #
一 7:4;.5:4<+=
抗原>?!。
和
≅6Α,!
等 #一,
与肌动蛋
白微丝
有关可能是紧密
连结与肌动蛋
白细胞
浆骨架之间
的桥梁当
紧
密
连结松开),
1
改变肌动蛋
白也在细
胞松
弛
素的作用下
分解当上
皮细
胞受损伤
后 #一
亦
消失 #一
5在
受损区
边沿检测不到而
在向受
损区
移行的细
胞中可有2。一,
点状染色在创伤
愈合后上
皮细
胞周围染色再次出现+7≅6≅8
等川
观察到
在全部损伤区
闭合后
一
天
仍
有小分子甘露醇通过上皮仍受一些毒物如氧
化剂和蛋
白酶以
及渗透压失衡等影
响这些因
素都能影
响紧密连结的形成妨碍上皮屏
障
的
完全
恢复而
上皮的缺陷有利于细菌
与病毒的
侵入这一
理论为临床工作提供了指导前列
腺素,2∃
>Β,2&
是哺乳动物鼻腔粘膜
上
皮主要
的环
加氧酶产物此外还有前列
腺素
ΧΔ∃
>ΒΧ2&
前列
腺素Ε?
和=
酮
前列
腺素Χ2
Φ
7Γ6997.≅/7Η7≅
等Ι‘
〕
利用
培养的鼻和
支气管
粘膜上
皮进行实验时发现
速尿可以
减少基础
的和花
生四烯酸刺激引起的>Β,
和>Β,2
的
产生速尿在
酮
还原酶水平特异地抑制
>Β,?
的合成同时伴有>Β,2
合成的减少而
>Β,2
是支气管
收缩药>Β,?
能通过其扩血管
作用而
增加炎症介质
在局
部的浓
度故速尿能
通过抑
制前列
腺素生
成而间接抑
制气管支气管
的收缩这对临床
实践具有指导
意义
【
异粘膜组织及
分离细胞
的短期培养及
其
离子通道和分泌功能的
研究】
鼻粘膜浆
液细
胞
的分离达到了
很精细的程
度少有其它
细胞掺
入
超微结构完整活
性良
好川
具体方法如下
健康
豚鼠经麻醉后断
头迅速取下鼻中隔浸入
充氧的细
胞储藏
液里细
胞储藏
液是将#
Κ
牛血清白蛋白
加入标准液
中构成的将鼻中隔
粘膜与软骨膜分离翻转铺放在含有细胞储藏
液的培养皿中以
精细
的钳子和眼
科剪去掉软
骨膜在不
损伤粘膜下层
的前提下将包含大量
鼻
腔腺体
的组织分离
下来
然后切成。
Λ
#
9ΜΜ
的小块将其浸泡
在分离
液中
在!<
℃
的震动水
浴中
孵化 #Λ!#分钟
分离液是由不
含Ν62
十
的标准液加入5ΜΜ35ΟΦ
乙
二醇双
乙胺
醚00’
四乙酸
∃,Β)/
Κ牛血清白
蛋
白
和
#ΠΟΜ
5
胶原蛋
白酶
构成用硅
化巴斯德移
液管将经酶
消化的组织吹打#
Λ #次使其分
离然后
用孔径为<%
拌Μ
的铂筛过滤
过滤
后的
细胞经
漂洗离心
三次将最后的沉淀重新悬浮
于
新鲜的不含胶原酶的细胞储藏液中即可进行
实验
乙酸胆
碱能诱导鼻
腔粘膜
下腺细胞内游离
钙∃ΙΘ62
Ρ
〕:&
增高并随剂量而变化ΙΘ6,Ρ
〕Σ
呈
双
相增加由瞬间的起始峰和
持
续的平台期组
成这种反
应被阿
托品
完全阻滞ΤΗ786
等发现
起始峰不
依赖细胞外Θ6 Ρ
水平能被细胞内
Θ62
Ρ
拮抗剂)Υ
∗∀
消除说
明Θ62
Ρ
是从细胞
内Θ62
Ρ
库中释放的这种由ςΡ
去极化诱导起