实验三十三 木瓜蛋白酶性质测定

木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。

（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋口酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。

二、原理木瓜蛋口酶（Papain ）是一种毓基蛋白酶，它分解比胰脏蛋口水解酶更多、更广泛的蛋白底物。

它也具有脂酶活力。

其分子量约为23000 左右。

在25 °C , pH6. 2时，1分钟生成lumol酪氨酸的酶量为1 单位。

木瓜蛋白酶是单条肽链，有211氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1个疏基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和EDTA ；抑制剂有铳基试剂，包括重金属和竣基试剂和过氧化氢。

酪蛋口是一种蛋口质，它被木瓜蛋口酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm处有吸收峰，根据测定275nm处的吸收值，可以判定木瓜蛋口酶的酶活力。

吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋口酶分解的酪蛋口多，酶活力高。

三、实验材料番木瓜汁；PEG （聚乙二醇，分子量为6000）；（NH5）2SO1；三氯乙酸（TCA）；酪氨酸；考马斯亮蓝四、仪器设备（1 ）离心机4000-lOOOrpm （冷冻式或非冷冻式）（2 ）752紫外分光光度计（3 ）水浴箱（4 ）冰箱（5 ）榨汁机五、玻璃器皿（以组为单位）试管（6 ） , 100 mL烧杯（2 ）,吸管（1 ）、玻棒（1 ）,试剂瓶（1000 mL、500 mL、250 mL等），移液管或移液器5mL （l）、lmL（2）、0. 5mL （ 1 ）,漏斗（3 ）,滤纸（3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤氨酸的标准曲线试管编号01234一标准酪氨酸溶液（ml ）00.20.40.60.8 1.0蒸馅水（ml ）2 1.8 1.6 1.4 1.21紫外吸光度A275nm00. 0660. 1750. 3000.4300. 550将上述各管混匀，静置2min,测定各管的A275nm,做标准曲线,曲线如下：酪氨酸曲线（二）粗酶活测定1试剂（1）3mg/ml木瓜蛋白酶液（用0. lmol/L的磷酸缓冲液，pH 7. 2 配制）（2 ） 0. lmol/L的磷酸缓冲液，pH 7.2（3 ）用0. lmol/L磷酸缓冲液（pH 7. 2 ）配制含80mmol/L半胱氨酸（4）1%酪蛋白溶液：用0. lmol/L磷酸缓冲液（pH7.2 ）配制（5 ）15%三氯乙酸（TCA ）溶液2方法量取酶液0.2 mL,加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37°C水浴中保温8 min,吸取预热37°C酪蛋白液（质量分数为1%） 1 mL加入此管，在37°C水浴中反应10 min,加入三氯乙酸（TCA） 2 mL摇匀, 静置5 min；另取样液（己激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL, 37°C保温10 min后，加入预热至37°C的酪蛋白液1 mL, 静置5 min,测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。

ｒ木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白的水解作用研究１黄惠华何铁剑许南燕ｆ华南理工大学食品与生物工程学院，５１０６４１）摘要用木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白进行了酶解研究，结果表明：以大豆分离蛋白作为底物，木瓜蛋白酶的反应动力学参数妇ｌ值为０．３４％，酶的最适反应ｐＨ值为７．５，在ｐＨ争Ｏ的碱性条件下有较好的适应性。

酶的最大反应温度为６０＂（２。

在此温度条件下，温浴１８０分钟仍能保持７０％的酶活。

２．０％一２ｊ％的大豆分离蛋白溶液经木瓜蛋白酶水解后，丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸、蛋氨酸等游离氨基酸含量明显增加，大豆多肽每ｌＯＯｍｌ提高９２－－９４ｍｇ，等电点分布范围变宽，由原来大豆分离蛋白的ｐＨ３．１～４．３变为ｐＨ３．１—５．５。

关键词：大豆多肽木瓜蛋白酶大豆分离蛋白ＡＳｔｕｄｙＯｉｌＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓｗｉｔｈＰａｐａｉｎｏｎＩｓｏｌａｔｅｄＳｏｙｂｅａｒｌ．ＰｒｏｔｅｉｎＨｕａｎｇＨ“ｉｈｕａＨｅＴｉｏｊｉａｎ）（ｎＮａｎｙａｎｇ（ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅａｌｓｗｉｔｈｔｈｅ坶ｄｒｏｌｙｓｉｓ０ｎｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｐ舢．Ｔｈｅｍｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｋｍｖａｌｕｅｏｆｐａｐａ／ｎｗｉｔｈｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎａｓｓｕｂｓｔｒａｔｅｗａｓ３．４％．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｐＨｖａｌｕｅｗａｓ６０＂ＣａｎｄｐＨ７．５．Ｐａｐａｉｎｗａｓａｄａｐｍｂｌｅｔｏｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆ６０＂（２ａｎｄｐＨ９．０．Ｐｅｐｔｉｄｅｗｅｒｅｒｅｌｅａｓｅｄｗｉｔｈｉ．ｎｅｒｃｍｅｎｔｏｆ９２·９４ｍｇ／ｌＯＯｍｌｗｈｉｌｅｔｈｅＳｏｌｕｔｉｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎ埘ｔｌｌ２．０－２．５％Ｗａｓｈｙｄｒｏｌｙｚｃｄｂｙｐａｐａｉｎ．Ａｎｄｔｈｅｉｓｏｅｌｅｅｔｒｉｃｐｏｉｎｔｓｏｆｔｈｅｐｅｐｔｉ幽ｓｗｅｒｅｒａｎｇｅ．ｄｆｒｏｍｐＨ３．ＩｔｏｐＨ５５ｋｅｙｎｏｒｄｓ：ｐｅｐｔｉｄｅｏｆｓｏｙｂｅａｎｐａｐａｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｓｏｙｂｅａｎｐｒｏｔｅｉｎ１、前言大豆含有近４０％的蛋白质，开发大豆蛋白系列产品，对于充分利用我国的现有食品资源，改善我国人民的膳食结构有着重要的意义。

木瓜蛋白酶酶活力检测方法南宁庞博生物工程有限公司企业标准Q/NPB 01-2019食品添加剂木瓜蛋白酶制剂1、范围本标准规定了食品添加剂木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。

本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂木瓜蛋白酶制剂。

2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 191-2019 包装储运图示标志GB/T 601-2002 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准GB/T 4789.2-2019 食品卫生微生物检验菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验沙门氏菌检测GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检测 GB/T 4789.10-2019 食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定GB/T 5009.74-2019 食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生标准GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄糖JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY/T 691-2019 番木瓜定量包装商品计量监督管理办法国家质量监督检验检疫总局令（2019）第75号 3、原辅料要求 3.1 水应符合 GB 5749-2019规定 3.2 木瓜果应符合NY/T 691-2019的规定 3.3 葡萄糖应符合GB/T 20880-2019中无水葡萄糖的规定 3.4 食品添加剂食品添加剂使用的品种和使用量应符合GB2760 的规定，质量应符合相应产品标准的规定。

木瓜酶活力测定方法的研究木瓜酶是一种黄酮酶，广泛存在于许多植物当中，具有良好的催化活性。

木瓜酶在食品工业、医药领域和生物技术等方面有着广泛的应用。

因此，准确测定木瓜酶的活力是非常重要的。

本文将针对木瓜酶活力测定方法展开研究。

首先，概述目前常用的木瓜酶活力测定方法，随后详细介绍各种方法的原理、操作步骤以及优缺点。

最后，对其中一种测定方法进行深入研究，以便更好地了解木瓜酶活力的测定过程。

目前常用的木瓜酶活力测定方法包括酚酞法、酪氨酸酶法、pH酶法和萤光素法等。

下面将对这些方法进行简要介绍。

酚酞法是根据酚酞与木瓜酶催化产生的酚酞显色反应来测定木瓜酶活力的一种方法。

该方法操作简单、灵敏度较高，但需要使用有毒的试剂和显色剂。

酪氨酸酶法是一种通过测定木瓜酶对酪氨酸水解的催化活性来测定其活力的方法。

该方法对样品处理要求较高，但操作相对简单，测定结果相对准确。

pH酶法是一种基于酶活性对反应物pH值的变化情况进行测定的方法。

该方法对pH的变化极其敏感，可以用来测定木瓜酶的活力，但依赖较强。

萤光素法是一种通过测定木瓜酶与辣根过氧化物酶的复合物产生的荧光强度来测定木瓜酶活力的方法。

该方法操作相对简单，结果准确，但需要专门设备。

在这些方法中，我们选择了酪氨酸酶法进行深入研究。

该方法原理简单，测定结果准确可靠。

具体的操作步骤如下：1.准备样品：收集所需测定的木瓜酶样品，如酒精或水提液。

2.取适量的酪氨酸溶液，使其浓度与之前的样品相同。

3.在试管中，混合适量的酪氨酸溶液和木瓜酶样品。

对照组中只加入酪氨酸溶液。

4.将试管放入恒温水浴中，温度为37°C，孵育一定时间，使酪氨酸水解反应完全进行。

5.向反应体系中加入适量的硫酸，停止反应。

6.使用分光光度计测定反应体系中产生的对映光的光密度。

7.根据光密度值计算出木瓜酶的活力。

这种方法虽然操作简单，但也有一些局限性。

首先，酪氨酸的浓度需与样品浓度进行匹配，这对样品的处理和准备有一定要求；其次，由于酪氨酸酶活性对各种因素如温度、pH值等有一定依赖性，因此在样品处理过程中需保持温度和pH的稳定。

木瓜蛋白酶水解条件
木瓜蛋白酶的水解条件包括温度、pH值和底物浓度等。

在pH值为7.0的条件下，底物浓度W(S)为5%，加酶量Φ(E)为4%，水解时间为4小时。

同时，可以在温度45℃、50℃、55℃、60℃、65℃五个水平进行实验，以探索最佳的水解条件。

此外，木瓜蛋白酶的抑制剂包括E-64、胱胺二盐酸盐、胰凝乳蛋白酶抑制剂、依布硒、亮肽素和三氟乙酸盐等。

这些抑制剂可能影响酶的活性，从而影响水解效率。

在实验过程中，需要注意以下几点：
1. 保证实验环境的清洁，以避免污染对实验结果的影响。

2. 使用新鲜的底物和酶，以确保实验结果的准确性。

3. 在水解过程中，要保持恒定的温度和pH值，以避免影响酶的活性。

4. 在实验结束后，要对实验数据进行整理和分析，以得出最佳的水解条件。

通过以上步骤，可以有效地利用木瓜蛋白酶进行水解反应，并获得最佳的水解效果。

同时，也可以为食品加工和生物工程领域提供有价值的参考。

实验四、蛋白酶酶活力的测定一、原理以酪蛋白为反应底物，令蛋白酶在其最适宜条件下反应一定时间，用三氯乙酸终止反应后过滤或离心得上清液，用Folin比色法测上清液中蛋白酶解物的浓度，计算蛋白酶活力。

蛋白酶活力定义：在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1μg酪氨酸相当的三氯醋酸可溶物所需的木瓜蛋白酶的量，为1个酶活力单位（u）。

二、材料、仪器与试剂（一）材料：木瓜蛋白酶（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管（10、15ml）、漏斗、滤纸、试管架，容量瓶、移液管（1、10ml）、烧杯（25ml）、玻璃棒。

（三）试剂：1福林试剂(Folin试剂)市场购买的Folin试剂。

此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释3倍的福林试剂。

2、中性稀释液－pH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol/L溶液(A液)。

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol/L 溶液(B液)。

取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。

3、酪蛋白溶液2g恒重的酪蛋白，用0.5mol/LNaOH溶液润湿后加入80ml pH7.2磷酸盐缓冲液，沸水浴溶解，冷却后，用1 mol/L盐酸调至pH 7.0，再用磷酸盐缓冲液定容至100ml，得浓度为2%的酪蛋白溶液。

临用现配。

4、三氯醋酸溶液称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL，得0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液5、酪氨酸标准溶液精确称取精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再用水稀释5倍，得到200μg/mL的酪氨酸标准溶液。

取200μg/mL的标准酪氨酸溶液，配成不同浓度的溶液（0、20、40、60、80、100μg/mL）6、样品溶液称取木瓜蛋白酶0.100g, 置于研钵中,加入相应的缓冲液定容至50mL,得到稀释500倍的酶液（当天配制、稀释）。

木瓜蛋白酶水解igg分子摘要：1.木瓜蛋白酶简介2.木瓜蛋白酶对IgG分子的水解作用3.木瓜蛋白酶水解IgG分子的实验方法4.木瓜蛋白酶在水解IgG分子中的应用5.总结正文：【1.木瓜蛋白酶简介】木瓜蛋白酶（Papain）是一种来源于木瓜的巯基蛋白酶，具有广泛的应用前景。

它是一种高效、特异性强的蛋白酶，可以水解蛋白质分子。

由于其温和的催化条件和相对简单的操作流程，木瓜蛋白酶在生物化学和分子生物学研究中备受关注。

【2.木瓜蛋白酶对IgG分子的水解作用】IgG是免疫球蛋白的一种，具有抗原结合活性，参与机体免疫反应。

木瓜蛋白酶可以特异性地识别和水解IgG分子中的某些部位，从而影响其生物活性。

研究发现，木瓜蛋白酶对IgG分子的水解作用具有种属特异性，不同物种的IgG分子可能被水解的部位有所不同。

【3.木瓜蛋白酶水解IgG分子的实验方法】实验过程中，首先需要提取IgG分子，然后采用适当的方法纯化。

接下来，通过酶促反应，将木瓜蛋白酶与IgG分子混合，观察水解反应的进程。

可以通过电泳、光谱分析等方法检测水解产物，从而确定木瓜蛋白酶对IgG分子的水解效果。

【4.木瓜蛋白酶在水解IgG分子中的应用】木瓜蛋白酶水解IgG分子的研究在生物化学、分子生物学和免疫学等领域具有广泛应用。

例如，通过研究木瓜蛋白酶对IgG分子的水解作用，可以揭示免疫系统中抗原-抗体复合物的形成与降解机制。

此外，在药物研发中，木瓜蛋白酶水解IgG分子有助于优化药物分子设计，提高药物的生物利用度和疗效。

【5.总结】木瓜蛋白酶作为一种重要的生物催化剂，对IgG分子的水解作用具有显著的特异性和高效性。

研究木瓜蛋白酶水解IgG分子不仅有助于深入了解免疫系统的相关机制，还为药物研发和生物化学研究提供了新的思路和方法。

木瓜蛋白酶的分离纯化一、目的（1）它是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁中提取粗酶液，并进一步纯化，获得高纯度的木瓜蛋白酶。

（2）通过此次试验，熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理，了解离心分离，萃取等实验技术。

二、原理木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。

它也具有脂酶活力。

其分子量约为 23000 左右。

在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟生成1umol酪氨酸的酶量为 1 单位。

木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。

酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。

吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。

三、实验材料番木瓜汁；PEG (聚乙二醇，分子量为6000)； (NH4)2SO4；三氯乙酸(TCA)；酪氨酸；考马斯亮蓝四、仪器设备（ 1 ）离心机 4000-1000rpm （冷冻式或非冷冻式）（ 2 ） 752 紫外分光光度计（ 3 ）水浴箱（ 4 ）冰箱（ 5 ）榨汁机五、玻璃器皿（以组为单位）试管（ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3-6 ）等六、实验试剂配制及实验步骤（一）酪氨酸的标准曲线将上述各管混匀，静置2min, 测定各管的A 275nm，做标准曲线，曲线如下：（二）粗酶活测定1 试剂（ 1 ） 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制）（ 2 ）0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2（ 3 ）用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸（ 4 ）1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制（ 5 ）15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液2 方法量取酶液0.2 mL，加入激活剂0.25 mL于带塞试管中，在37℃水浴中保温8 min，吸取预热37℃酪蛋白液（质量分数为1%）1 mL加入此管，在37℃水浴中反应10 min，加入三氯乙酸（TCA）2 mL摇匀，静置5 min；另取样液（已激活）0.3 mL置另一带塞试管中，加入TCA 2 mL，37℃保温10 min后，加入预热至37℃的酪蛋白液1 mL，静置5 min，测2个管的A275 nm值，同时做2个平行试验。

固定化木瓜蛋白酶与溶液酶性质的比较学生姓名刘晶指导老师万善霞摘要：本文就木瓜蛋白酶固定化后的性质与其溶液酶性质进行了初步比较。

以变性的卵清蛋白为载体，以戊二醛做交联剂固定木瓜蛋白酶。

结果表明：与溶液酶相比，固定化后的木瓜蛋白酶最适反应温度提高了30℃，最适反应PH向碱性方向移动2.0，其热稳定性及耐热性均较溶液酶有显著提高。

关键词：木瓜蛋白酶；固定化；卵清蛋白；戊二醛Comparison of the properties immobilized papain andsoluble papainLiu Jing Wan ShanxiaAbstract:In this paper, the immobilized papain with the nature of a preliminary nature of the soluble papain compared.To denatured egg white protein as the support with glutaraldehyde as the cross-linker. The result showed that:compared with the soluble papain,immobilized papain increased the optimum temperature 30℃,optimum PH2.0 to the basic direction, The thermostability and thermotolerance of the immobilized papain are obviously increased compared to those of the soluble one.Key words: papain; immobilization; egg white protein; glutaraldehyde目录1.序言‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥52.实验材料‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥52.1仪器及器材‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥52.2实验试剂‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥63.实验方法及结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥63.1实验测定原理 (6)3.2固定化酶与溶液酶最适温度的比较 (7)3.2.1实验方法 (7)3.2.1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥73.2.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥73.2.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥73.2.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥83.2.2实验结果及分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥93.2.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥93.2.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥103.3固定化酶与溶液酶最适PH的比较 (10)3.3.1实验方法 (10)3.3.1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥103.3.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113.3.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113.3.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113.3.2实验结果及分析 (11)3.3.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥113.3.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥123.4固定化酶与溶液酶热稳定性的比较 (12)3.4.1试验方法 (12)3.4.1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥123.4.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥123.4.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥133.4.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥143.4.2实验结果及分析 (14)3.4.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥143.4.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153.5固定化酶与溶液酶耐热性的比较 (15)3.5.1试验方法 (15)3.5.1.1试剂组成‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153.5.1.2木瓜蛋白酶的固定化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153.5.1.3木瓜蛋白酶溶液酶活力的检测‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥153.5.1.4固定化酶活力的定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥163.5.2实验结果及分析 (16)3.5.2.1 实验结果‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥163.5.2.2 结果分析‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥164.讨论 (17)5.结论 (17)参考文献 (18)致谢 (19)1.序言（Asn-158）这三个氨基酸所组成[2]。

一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

2. 了解蛋白酶的特性和作用。

3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。

二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。

蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。

2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。

3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。

（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。

（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。

（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。

5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。

（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。

（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。

6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。

（2）分析蛋白酶的特性和作用。

五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。

（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。

2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。

（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。

六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。

木瓜蛋白酶的结构与功能研究进展植物蛋白酶是一类在许多生物过程中发挥重要功能的蛋白质酶，木瓜蛋白酶（Papain）作为其中一种重要的酶类，在生物医学领域中广泛应用。

木瓜蛋白酶具有较高的催化活性和特异性，对肿瘤细胞、病毒和细胞外基质等有很好的抑制作用。

本文将重点介绍木瓜蛋白酶的结构和功能，并对相关研究进展进行综述。

首先，木瓜蛋白酶的结构特点是其由一个单一的多肽链组成，而没有任何配体或辅基。

具体来说，木瓜蛋白酶分为三个结构域：N-端丝氨酸蛋白酶活性中心、CAT（cysteine proteinase catalytic center）结构域和C-端结构域。

其中，N-端丝氨酸蛋白酶活性中心通过其活性位点Ser195形成了一个催化三元复合物，其中还包括His57和Asp102。

这个复合物在蛋白酶底物结合并发生催化反应时起到关键作用。

其次，木瓜蛋白酶的功能与结构密切相关。

该酶在消化、抗病毒、抗炎和抗氧化等生理过程中发挥着重要作用。

在消化过程中，木瓜蛋白酶能够降解蛋白质，帮助生物体消化并吸收养分。

此外，木瓜蛋白酶还表现出抗病毒活性，能够抑制病毒进入宿主细胞，并抑制其复制过程。

这使得木瓜蛋白酶成为药物研发领域的重要候选。

近年来，对木瓜蛋白酶结构与功能的研究取得了许多进展。

首先，科学家们通过X射线晶体学和核磁共振等技术获得了高分辨率的木瓜蛋白酶晶体结构图像，揭示了其三维结构和催化机制。

这为深入了解其功能奠定了基础。

其次，使用基因工程和相关技术，科学家们提高了木瓜蛋白酶的表达水平和纯化效率，使其更易于研究和应用。

此外，还有研究通过对木瓜蛋白酶进行结构修饰，进一步提高其催化效率和抗病毒活性。

除了以上基础研究外，木瓜蛋白酶的应用价值也得到了广泛关注。

例如，在生物医学领域中，木瓜蛋白酶已被用于制备医用胶原、生物活性肽和药物载体等。

由于木瓜蛋白酶具有较强的蛋白降解能力和特异性，因此在这些应用中发挥了重要作用。

此外，在生物清洗和制药过程中，木瓜蛋白酶也被广泛运用，以去除杂质和提高产品纯度。

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求,木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。

二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶.木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶,广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富.木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶,它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶,分子量为23406，由一种单肽链组成,含有212个氨基酸残基.至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时,酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐)或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。

它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色,有时呈乳白色;几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。

木瓜蛋白酶是一种含巯基（-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力,但几乎不能分解蛋白胨。

木瓜蛋白酶的最适合PH值6~7（一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用,等电点（pI）为8。

75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可）,耐热性强，在90℃时也不会完全失活;受氧化剂抑制，还原性物质激活. 。

另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键，且都不在活性部位。