辣椒素受体-5在头孢曲松结石大鼠模型肾脏中的表达及其意义

・２１６６・　中国医院药学杂志２０１６年１２月第３６卷第２４期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｄｅｃ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．２４　辣椒素受体一５在头孢曲松结石大鼠模型肾脏中的表达及其意义　

孙允冀，李笑然，何伸宝，程双蕾，秦泽，卢建忠，张杨，史庭凯，岳中瑾　（兰州大学第－－Ｎ院泌尿外科，甘肃省泌尿　系疾病临床医学中心，甘肃省泌尿系疾病重点实验室，甘肃兰州７３００３０）　

［摘要］目的：通过构建头孢曲松钠结石大鼠模型，探讨ＴＲＰＶ５（辣椒素受体一５）在结石模型组大鼠肾脏中和正常对照组大鼠　肾脏中的表达差异，分析其表达量与头孢曲松钠应用时间的关系，为研究头孢曲松钠相关肾结石的发生机制提供新的理论依　据。方法：３０只雄性ＳＤ大鼠随机分为３组，Ａ组给予１２０　ｍｇ・ｋｇＩ１・ｄ　纯化水灌胃４周，Ｂ组、Ｃ组分别以１２０　ｒａｇ・ｋｇ　・ｄＩ１　头孢曲松钠灌胃２周和４周；试剂盒检测各组血、尿生化指标；用相差显微镜观察各组结石结晶形成情况；采用免疫组化、双抗　体夹心法分别定性、定量大鼠肾组织ＴＲＰＶ５的表达。结果：３组血钙浓度无统计学差异（Ｐ＞０．０５），Ｃ组与Ａ组、Ｂ组比较血　肌酐明显升高［（９６．２９±２１．８１）／￣ｍｏｌ・Ｌ～ｖｓ（３４．７２±１０．４９）　ｍｏ卜Ｌ～、（５９．９８±２０．４５）　ｍｏｌ・Ｌ，Ｐ＜０．０５］，ｃ组尿钙浓度　相比较Ａ组明显升高［（０．７２±ｏ．２５）ｍｍｏｌ・ＬＩ１　ｖｓ（０．４６±０．２３）ｍｍｏｌ・Ｌ～，Ｐ＜０．０１］，ｃ组与Ａ组、Ｂ组比较尿肌酐降低　［（２　４８８．２８±４３５．７５）＞ｍｏｌ・Ｌ。。ｖｓ（３　４６３．５７－４－２２１．７６）　ｎ１０卜Ｌ～、（２　９７１．３７±３１９．２７）肛ｍｏｌ・Ｌ～，Ｐ＜Ｏ．０１　ｆ。光镜下Ｃ组可　见有大量结石结晶形成。ＴＲＰＶ５在３组血液中表达无明显差异（Ｐ＞０．０５），Ｃ组中Ｔ　Ｖ５在肾脏中表达明显低于Ａ组、Ｂ　组［（２１７．７９±４８．３１）ｎｇ・Ｌ～ｖｓ（３９５．６６±７４．６９）ｎｇ・Ｌ～、（３４３．０８±７４．Ｏ８）ｎｇ・Ｌ～，Ｐ＜０．０１］。结论：ＴＩ　Ｖ５在头孢曲松钠　干预４周组大鼠肾组织中的表达降低，表达量且与头孢曲松钠干预时间呈负相关，可能由于头孢曲松钠抑制了钙离子通道蛋　白ＴＲＰＶ５在肾脏的表达，增加肾小管尿钙排泄从而参与了头孢曲松结石的形成。　［关键词］辣椒素受体一５；头孢曲松钠；肾结石；大鼠　［中图分类号］Ｒ９８３　．２［文献标识码］Ａ［文章编号］１００１—５２１３（２０１６）２４－２１６６－０４　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｅｎｋｋ　ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１６．２４．０８　

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ＴＲＰＶ５　ｉｎ　ｔｈｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｓｔｏｎｅｓ　ＳＵＮ　Ｙｕｎ－ｊｉ，ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｒａｎ，ＨＥ　Ｓｈｅｎ－ｂａｏ，ＣＨＥＮＧ　Ｓｈｕａｎｇ－ｌｅｉ，ＱＩＮ　Ｚｅ，ＬＵ　Ｊｉａｎ－ｚｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｙａｎｇ，　ＳＨＩ　Ｔｉｎｇ－ｋａｉ，ＹＵＥ　Ｚｈｏｎｇ－ｊｉｎ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｇａｎｓｕ　Ｎｅｐｈｒｏ－Ｕｒｏｌｏｇｉｅａｌ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｕ—　ｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｉｎ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｓｕ　Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００３０，Ｃｈｉｎａ）　

ＡＢＳＴＲＡＣＴ：０ＢＪＥＣＩＩＶＥ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＲＰＶ５　ｉｎ　ｋｉｄｎｅｙ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｓｔｏｎｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏ１　ｇｒｏｕｐ　ｂｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　ｒａｔ　ｒｅｎａｌ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｓｔｏｎｅ　ｍｏｄｅｌｓ。ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｎｅｗ　ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｓｔｏｎｅｓ　ｂｙ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ　ＴＲＰＶ５　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．１ＶｌＥＴｔｔＯＤＳ　Ｔｈｉｒｔｙ　ｍａｌｅ　ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　３　ｇｒｏｕｐｓ．Ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｇａｖａｇｅｄ　ｗｉｔｈ　１２０　ｍｇ・ｋｇ～ｄｉｓ—　ｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ　ｆｏｒ　４　ｗｅｅｋｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ａ，ａｎｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｇａｖａｇｅｄ　ｗｉｔｈ　１２０　ｍｇ・ｋｇ一　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｆｏｒ　２　ａｎｄ　４　ｗｅｅｋｓ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　ｃ　Ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｋｉｔ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｅｓｔ　ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｕｒｉｎｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｄｅｘ．　ｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｋｉｄｎｅｙ　ｓｔｏｎｅｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｅｌｉｓａ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＲＰＶ５　ｐｒｏｔｅｉｎ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ，ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｓｃｒ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ［（９６．２９±２１．８１）扯∞Ｄｌ・ＬＩ１　ｓ．（３４．７２±　１０．４９）ｔ￣ｎｏｌ・Ｌ～，（５９．９８±２０．４５）“ｍ０卜Ｌ＿　，Ｐ＜Ｏ．０５］．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ａ，ｕｒｉｎｅ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ　［（０．７２±０．２５）ｍｍｏｌ・Ｌ　讲．（Ｏ．４６±０．２３）ｍｍｏｌ・Ｌ～，Ｐ＜Ｏ．０１］．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ，ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｕｃｒ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ［（２　４８８．２８±４３５．７５）　ｍ０ｌ・Ｌ一　邯．（３　４６３．５７±２２１．７６）／ｚｍｏｌ・Ｌ一　，（２　９７１．３７±３１９．２７）／￣ｍｏｌ・　Ｌ‘。，Ｐ＜０．０１］．Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ　ｕｎｄｅｒ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｍａｓｓ　ｓｔｏｎｅ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＲＰＶ５　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｈａｄ　ｒｉｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ，ｔｈｅ　ｅｘ－　ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＲＰｖ５　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ［（２１７．７９±４８．３１）ｎｇ・Ｌ一　ｖｓ．（３９５．６６±７４．６９）ｎｇ・Ｌ一　，（３４３．０８±　７４．０８）ｒｉｇ・Ｌ。。，Ｐ＜０．０１３．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＲＰＶ５　ｉｓ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ　ｗｉｔｈ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｓｔｏｎｅｓ，ａｎｄ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｍａｙ　ｓｕｐｐｒｅｓｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＲＰＶ５　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅ—　ｎａｌ　ｔｉｓｓｕｅｓ，ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｒｅｎａｌ　ｔｕｂｕｌａｒ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ　ｔｏ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｒｅｎａ１　ｃａｌｃｉｕｍ　ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ　ｓｔｏｎｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｖａｎｉｌｌｏｉｄ－５；ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ；ｒｅｎａｌ　ｃａｌｃｕｌｉ；ｒａｔ　

［基金项目］甘肃省杰出青年基金（编号：１１１１　ＤＡ０００１）［作者简介］孙允冀，男，硕士研究生，医师，研究方向；泌尿系结石方向，电话：０９３１　８９４２２６２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｅｎｎｙｓｕｎｕｓｅｒ＠１６３．ｃｏｍ［通讯作者］岳中瑾，男，博士，博士研究生导师，教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｚｈｏｎｇｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ　中国医院药学杂志２０１６年１２月第３６卷第２４期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｄｅｃ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．２４　头孢曲松钠作为第三代头孢菌素，因其不良反　应小、抗菌谱广、疗效确切，广泛应用于，ｂＪＬ各种感　染性疾病的临床治疗。但有研究报道，使用头孢曲　松钠后，小儿头孢曲松钠相关结石的发生率达１．４　～７．８　ｏＡ［１　］，且长时间应用后尿钙的排泄显著增加。　ＴＲＰＶ５是瞬时性受体电位通道（ＴＲＰ）ｖａｎｉｌｌｏｉｄ受　体类成员之一Ｌ３］，ＴＲＰＶ５作为尿钙重吸收的重要　上皮通道蛋白，近几年研究表明，其主要表达于肾脏　远曲小管和集合管上皮细胞管腔，再通过主动重吸　收Ｃａ　人机体，进而调节尿钙水平，维持机体钙离　子的平衡。目前的多项研究显示ＴＲＰＶ５表达下降　或活性降低可能导致尿钙水平升高［４］。因此考虑　ＴＲＰＶ５和高钙尿、头孢曲松相关肾结石之间可能　存在关联性。本实验通过免疫组织化学染色、酶联　免疫吸附实验的方法，比较不同组间在形态学上的　差异及ＴＲＰＶ５蛋白的表达差异，研究ＴＲＰＶ５在　头孢曲松钠相关肾结石形成中的作用，从而为泌尿　系结石病的预防提供理论依据。　１材料与方法　１．１动物模型制备与分组健康雄性ＳＤ大鼠３０　只，体质量１３０￣１５０　ｇ，购自于甘肃省中医学院动物　实验中心［使用许可证号：ＳＣＸＫ甘２００４—０００７３。５　鼠一笼，适应性喂养一周，自然采光。将ＳＤ大鼠随　机分为３组：Ａ组为正常对照组，给予纯化水１２０　ｍｇ・ｋｇＩ１・ｄ　灌胃４周；Ｂ组为头孢曲松钠干预２　周组，给予１２０　ｍｇ・ｋｇ　・ｄＩ１灌胃２周；Ｃ组为头孢　曲松钠干预４周组，给予头孢曲松钠溶液１２０　ｍｇ・　ｋｇ　・ｄＩ１灌胃４周，Ｂ、Ｃ组每日清晨均一次性给药。　１．２检测盒及试剂钙离子、肌酐检测试剂盒购自　南京建成科技有限公司，大鼠ＴＲＰＶ５酶联免疫分　析试剂盒（Ｒａｔ　ＴＲＰＶ５　ＥＬＩＳＡ　ＫＩＴ）购自上海酶　联生物科技有限公司，ＴＲＰＶ５抗体（Ａｎｔｉ—ＴＲＰＶ５　ａｎｔｉｂｏｄｙ［ＥＰＲ８８７５］ａｂ１３７０２８）购自Ａｂｃａｍ公司。　１．３血清、２４　ｈ尿生化检测　分别在实验第２周　末和第４周末，采用大鼠代谢笼收集实验大鼠２４　ｈ　尿液，通过钙离子、肌酐检测试剂盒，进行２４　ｈ尿　钙、尿ｐＨ及尿肌酐测定；Ａ、Ｃ组于第４周末处死，　经大动脉采血标本，离心后留取血清标本；Ｂ组于实　验第２周末处死，留取血清标本，取血清通过检测试　剂盒，检测血钙、血肌酐。　１．４肾组织ＨＥ染色判断结晶形成结果手术切　取处死的大鼠左肾，甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片　行ＨＥ染色，相差显微镜观察肾组织有无结晶形成，　判断结晶形成结果。具体评分标准如下：高倍视野　中无任何结晶亮点记“一”；视野中少部分管腔中可　・２１６７・　见结晶，且有结晶形成的管腔占一半以下记“＋”；视　野中一半左右管腔中可见结晶形成记“＋＋”；视野　中几乎所有管腔都有结晶形成记“＋＋＋”。　１．５　ＴＲＰＶ５的免疫组化检测　取肾组织切片，分　步行脱蜡，抗原修复，血清封闭，滴加ＴＲＰＶ５抗体　（一抗１：１５０），４℃孵育过夜，滴加二抗，ＤＡＢ显色，　复染，脱水，透明，封固等，空白对照组用ＰＢＳ液代　替一抗，观察ＴＲＰＶ５组织化学染色情况。光学显　微镜观察各组免疫组化切片，阳性结果的判定具体　如下：“＋”表示肾小管上皮细胞胞膜轻度染色（淡黄　色）；“＋＋”表示肾小管胞膜中度染色（黄色）；“＋＋　＋”表示肾小管胞膜明显染色（深棕黄色）。　１．６　ＥＬＩＳＡ检测ＴＲＰＶ５的表达水平　１．６．１组织匀浆制备准确秤取各组大鼠右肾组　织质量按质量（ｇ）：体积（ｍＬ）＝１：９的比例加入９倍　体积的去离子水，冰水浴匀浆，２　５００　ｒ・ｍｉｎ～，离心　１０　ｍｉｎ，取１０　的匀浆上清液待测。　１．６．２大鼠血清、肾组织中ＴＲＰＶ５表达水平测定　将标准品、样品稀释后加入纯化的大鼠钙离子通　道蛋白受体５（ＴＲＰＶ５）抗体包被微孔板，温育，洗　涤，加入酶标试剂（空白孔除外），温育，洗涤，显色，　加入中止液后，用酶标仪在４５０　ｎｍ波长下测定吸　光度（ＯＤ值），通过标准曲线计算样品中大鼠ＴＲ—　ＰＶ５浓度。　１．７统计学分析采用ＳＰＳＳ　１９．０统计软件进行　分析，实验数据以　±Ｓ表示，多组间比较采用单因　素方差（Ｏｎｅ—ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）检验中的ＬＳＤ多重比　较法进行显著性分析；肾结晶形成与ＴＲＰＶ５表达　情况比较采用秩和检验Ｋｒｕｓｋａｌ—Ｗａｌｌｉｓ检验，Ｐ＜　０．０５差异有统计学意义。　２结果　２．１血生化检测结果结果见表１。Ａ、Ｂ、Ｃ　３组　大鼠血钙比较，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），且都　在正常范围内；Ｃ组与Ａ组比较血肌酐升高，差异　有统计学意义（Ｐ＜０．叭）；Ｃ组与Ｂ组比较，血肌酐　呈升高趋势，差异有统计学差异（Ｐ＜０．０５）。　表１　各组大鼠血生化检查结果（　±ｓ。　＝１０）　Ｔａｂ　１　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｄｅｘ　ｉｎ　ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ　（　±ｓ，／－／＝１０）