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土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
实验土壤中细菌的分离与纯化
细菌是微生物中最常见和广泛分布的，它们对人类和自然界都起着重要的作用。
在研究不同类型的细菌时，需要从土壤样品中细菌的分离和纯化。
这可以通过多个步骤来完成。
第一步是样品的准备。
准备好样品是关键的第一步。
需要从所需的环境中收集样品，例如，在花园中收集土壤样品，神经外科手术时，需要收集体内的样品。
样品收集后，需要将其保存在适当的容器中，并避免过度处理。
第二步是制备培养基。
为了孵化细菌，需要准备不同种类的培养基，例如，对光和氧气敏感的厌氧菌需要使用厌氧培养基。
还需要选择颜色，形状和口感不同的特殊培养基，以区分不同种类的细菌。
第三步是分离和纯化细菌。
需要采取逐步流程来分离和纯化细菌。
首先，需要将土壤样品分散在培养基中，并容纳在瓶子或平板上。
然后，将样品暴露于光线和空气下，以让细菌开始生长。
细菌的生长取决于培养基的条件，例如，温度，pH，光线等。
为了获得单个细胞，需要通过挑选法或分离检查板来分离细菌。
挑选法是一种分离单个细菌的技术，其中使用草地绿和某些特定镜头。
经过一些练习和专业技能，可以使用这种方法分离出单个细菌。
为了区分不同种类的细菌，还可以在不同的特殊条件下进行培养。
最后，需要使用不同的方法来检验细菌的纯度。
例如，可以使用静电鉴别法来检测细菌的标记。
通过这种方法，细菌可以在电场的方向下移动，并根据它们的大小，形状，颜色等特征进行分类。
细菌的分离和纯化是细菌学研究的关键步骤。
通过这些方法，可以提取不同种类的细菌，进而进行更深入的研究。
马铃薯16种病虫害图一直以来，以马铃薯晚疫病、早疫病为代表的马铃薯病害，严重影响着马铃薯的产量和质量，成为马铃薯病虫害防治的重点和难点。
在栽植马铃薯过程中除了这些病害，还有其他哪些病虫害？往下读，共梳理了16种。
1.马铃薯晚疫病危害表现：受害叶片的叶尖、叶缘会出现暗绿色小病斑，边缘有灰绿色晕环，边缘分界不明显。
湿度大时，外缘会出现一圈白霉。
天气干燥时，病部会变褐干枯，质脆易裂。
病害严重时，病斑扩展到叶脉、叶柄和茎部，病叶枯死脱落。
被侵染的块茎最初出现褐色小斑点，以后扩大为凹陷的暗褐色不规则病斑。
防治措施：选择保护性药剂和治疗性药剂混合使用，合理安排间隔期。
保护性药剂：丙森锌、代森联、代森锰锌、噻唑锌、王铜、氢氧化铜。
治疗性药剂：氟菌·霜霉威、霜脲·锰锌、烯酰吗啉、氟啶胺等。
2.马铃薯早疫病危害表现：病害可发生在叶片上，也可侵染块茎。
叶片染病，病斑黑褐色，圆形或近圆形，具同心轮纹。
湿度大时，病斑上生出黑色霉层病征。
块茎染病，产生暗褐色稍凹陷圆形或近圆形病斑，边缘分明，病斑下的薯肉出现褐色海绵状干腐。
防治措施：（1）选用抗病品种，增施有机肥；（2）生长期加强肥水管理，适量增施钾肥，适时喷施叶面肥；雨后及时清沟排渍降湿，促进植株健康。
（3）药剂防治。
发病初期，喷施保护性杀菌剂，如丙森锌或代森锰锌等药剂1～2次。
发病较重时，用啶酰菌胺、烯酰·吡唑酯、噁唑菌酮·霜脲氰等药剂防治，隔7～10天喷1次，连喷2～3次。
3.马铃薯枯萎病危害特征：发病初期地上部出现萎蔫。
剖开病茎，薯块维管束变褐，湿度大时，病部常产生白色至粉红色菌丝。
防治方法：发病初期，可采用下列药剂进行防治：苯甲·丙环唑，苯酰菌胺，恶菌灵，萎锈灵等。
4.马铃薯青枯病危害症状发病初期，下部叶片先萎蔫后全株下垂，开始早晚恢复，持续4～5天后，全株茎叶全部萎蔫死亡，但仍保持青绿色，叶片不凋落。
叶脉变褐，茎出现褐色条纹，横剖可见维管束变褐，湿度大时，切面有菌液溢出。
实验八、土壤微生物的分离和纯化土壤微生物是指生长在土壤中的微弱的、微小的生物体，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物等。
土壤微生物是土壤的重要组成部分，对维持土壤生态系统的平衡和功能发挥起着关键作用。
因此，对土壤微生物的分离和纯化具有重要意义。
本实验就是针对土壤微生物的分离和纯化进行研究。
一、实验原理由于土壤微生物数量繁多而多样，分离出单一的菌落对于此实验来说非常的困难。
但是采用适宜的富培养基后能够轻松的促进土壤微生物菌群的生长。
富培养基包括有机和无机元素、维生素、氨基酸、碳源和氮源。
地衣素琼脂（ISP）是一种富含多种碳源和氮源的优质菌落培养基，是常用的微生物培养基。
本实验的基本原理就是在能够生长的环境中分离出单一的菌落，通过多次分离和鉴定获得纯种菌株。
二、实验器材和试剂1.地衣素琼脂培养基2.试管、移液器、移菌环、烧灼器、电热蚊子香、灭菌器3.已经壳霉菌疫苗接种的贵州悬钩子种子和土壤三、实验步骤1.准备工作。
用移液器将壳霉菌疫苗接种在新的地衣素琼脂培养基板上，将其灭菌，以备之后的使用。
2.准备土壤基质。
将土壤样品剪碎成非常小的颗粒，并放入烧灼的试管中，加入恰当的地衣素酵母素琼脂，变形后形成一个接种板。
在较大的容器中放置电热器设备，以保持环境的湿度和温度适宜。
接下来，将接种板和采样站放在单独的区域以免混淆。
3.接种。
从土壤中取一小部分，倒入试管中，并加入适量的地衣素琼脂培养基，并将其摇动均匀，使菌群溢出。
等到土壤均匀地分散在地衣素琼脂培养基中之后，用移菌环扭曲并切出一个菌落，并将其置于新的地衣素琼脂培养基板中。
重复此步骤至少三次，每次都要将新的分离土壤菌落剪出来。
4.孵育。
将地衣素琼脂培养基板置于电热器设备中，以使温度保持在合适的范围内，并等待菌落的生长。
当新的菌落形成后，即可重复上述步骤以获得更多的菌株。
5.纯化。
检查菌落后，需要进行纯化。
鉴定每个菌落，把每个菌落分别悬浮在新的地衣素琼脂培养基板中，并等待菌落的生长。
最新的土豆病害图谱都找齐了，一定要转发啊！危害马铃薯的病虫害有300多种，但并不是所有的病虫害都会造成马铃薯严重减产。
马铃薯病害主要分为真菌病害、细菌病害和病毒病。
其中由真菌引起的马铃薯晚疫病是世界上最主要的马铃薯病害，几乎能在所有的马铃薯种植区发生。
通常说的种薯退化即为不同病毒引起的多种病毒病所造成。
马铃薯害虫分地上害虫和地下害虫，其中比较主要的有马铃薯块茎蛾、蚜虫等。
一、马铃薯真菌性病害①晚疫病田间发病状晚疫病是马铃薯主产区最重要的一种真菌病害，其最初传播来源是邻近的薯田或番茄、杂草和有机堆肥。
【病害症状】叶片染病先在叶尖或叶缘生水浸状绿褐色斑点，病斑周围具浅绿色晕圈，湿度大时病斑迅速扩大，呈褐色，并产生一圈白霉，即孢囊梗和孢子囊，尤以叶背最为明显；干燥时病斑变褐干枯，质脆易裂，不见白霉，且扩展速度减慢。
茎部或叶柄染病现褐色条斑。
发病严重的叶片萎垂、卷缩，终致全株黑腐，全田一片枯焦，散发出腐败气味。
块茎染病初生褐色或紫褐色大块病斑，稍凹陷，病部皮下薯肉亦呈褐色，慢慢向四周扩大或烂掉。
【防治方法】防治晚疫病，首先要选择抗病品种；其次，播前严格淘汰病薯。
一旦发生晚疫病感染，一般很难控制，因此必须在晚疫病没有发生前进行药剂防治，即当日平均气温在10-25℃之间，下雨或空气相对湿度超过90%达8小时以上的情况出现4-5天后喷洒药剂进行防治。
可用70%代森锰锌可湿性粉剂来进行防治，每亩用量175-225克，兑水后进行叶面喷洒。
如果没有及时喷药，田间发现晚疫病植株后，则需要用瑞毒霉（也称为雷多米尔、甲霜灵）之类的药剂进行防治，每亩用25%瑞毒霉可湿性粉剂150-200克，兑水进行叶面喷施。
如果一次没有将病害控制住，则需要进行多次喷施，时间间隔为7-10天。
此外，环境条件也影响晚疫病的传播，为防止块茎感染，应当高培土。
如果植株地上部分受到晚疫病侵染，则最好在收获前将病秧割除并清理处田块，防止收获的薯块与之接触。
实验三土壤中微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术一、教学目标与基本要求：1、掌握倒平板的技术和分离纯化微生物的基本操作技术。
2、设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。
二、实验内容：1．用稀释法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线法分离纯化微生物。
3．学习斜宜接种、穿刺接种、平板接种、液体接种等接种方法。
三、实验步骤（一）微生物分离的方法有很多种，但常用的有两种：1.平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，二获得单个菌落，从而达到分离的目的，具体方法如下： 1)倒制平板：将固体培养基熔化，冷却至50-55℃，然后在酒精灯火焰旁，以右手持培养基，左手拿培养皿，以无菌操作将培养基注入培养皿内，约15ml，轻微转动培养基，使培养基均匀分布，然后静置于水平位置，凝固即成平板，并在皿该边贴上标签。
2.稀释平板分离法稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种记数方法。
1)制备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品1g，加入装有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成10-2土壤稀释液，然后用无菌移液管吸取9ml无菌水的试管内，制成10-3的稀释液将此移液管在试管内反复吸冲三次，然后取出移液管，并将其通过火焰，再插入原来包移液管的纸套内，以备再用，振荡10-3 的稀释液试管，再从纸套取出原来的移液管插入已混匀的试管内，再吹洗三次，然后吸出1ml10-3的稀释液至另一支装有9ml 无菌水的试管中，制成10-4稀释液。
用同样方法再制成10-5、10-6的稀释液，稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的 10-6的稀释液开始吸取1ml10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内，整个分离过程见下图。
http://www.paper.edu.cn 马铃薯晚疫病菌的分离纯化和单孢分离 包海银 甘肃农业大学草业学院，兰州（730070） 摘 要：晚疫病是马铃薯上最严重的真菌病害，它普遍发生于马铃薯的产区，引起马铃薯晚疫病的致病疫霉很难分离培养并得到纯菌株，本文对采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯晚疫病病叶进行致病疫霉菌的分离纯化和单孢分离，为马铃薯晚疫病菌的进一步研究提供试验材料。 关键词：马铃薯晚疫病菌，分离，纯化，单孢分离
马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)是全球马铃薯生产中毁灭性病害，是所有引起粮食作物产量损失的病害中最严重的一种真菌性病害, 全球每年因此病害造成的直接经济损失达170 亿美元以上[1]。我省马铃薯产区都有发生，陇南和中部的阴湿二阴地区最重，只
要7-9月降雨频繁，晚疫病必定大流行。六十年代初期，每年该病损失薯块占总产量的15%，1966年后，由于推广了比较抗病的品种，使该病得到了长期控制。但近年来，由于一些抗病品种退化，在阴湿多雨地区，该病又开始流行。 P. infestans存在A1、A2两种交配型，在寄主上通常以无性生殖方式繁殖。A2交配型1980年以前仅在墨西哥中部发现，世界其它各地只有A1交配型分布。但在后来的10-15 年中，A2交配型在世界各地包括欧洲、亚洲、南美洲、北美洲等相继发现。我国南北方也均已发现A2交配型的存在[2]，因此80年代后，新的晚疫病原小种已经逐步取代了原有A1交
配型生理小种，产生毒性更强的小种。A1、A2交配型的有性重组产生的卵孢子具有能忍耐不良环境、存活时间长的特点，有可能成为生命力更强，能够摆脱活体薯块存在的新的病源，这将为晚疫病防治带来更大困难。 马铃薯晚疫病主要靠化学药剂进行防治，常用的药剂是瑞毒霉，但自1980年后在荷兰、爱尔兰和其它欧洲国家、美洲及中东等地区也相继发现了抗性菌株发现抗的晚疫病菌株，对我国马铃薯主产区晚疫病菌株抗药性试验表明，90年代后期使用过瑞毒霉的地区普遍存在抗药性菌株。 对马铃薯晚疫病菌进行分离纯化以及单游动刨子无性系的建立，在遗传上获得较均一的单孢菌株，对疫霉菌的生理生化、抗药性的监测和遗传研究是一项十分有用的技术。据报道，从一个孢子囊中获得分离物能明显地分为三个不同的生理小种，从而证明了游动孢子的异核性，马铃薯晚疫病菌游动孢子的多核性在病原菌寄生变异中有很大意义，异质核能决定产生特异性的新菌系，虽然研究人员报道不同游动孢子的多核性，但人们普遍认为单游动孢子基本上是单核的。所以，在晚疫病菌遗传学和分子生物学以及交配型测定中，为了试验更高的准确性和重复性，最好应选用遗传性状单一的单游动孢子分离物作为实验材料。 本文对采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯晚疫病病叶进行致病疫霉菌的分离纯化和单孢分离，为马铃薯晚疫病菌的进一步研究提供试验材料。
1 材料与方法 1.1供试材料： -1- http://www.paper.edu.cn 以采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯病叶为试验材料。 1.1.1 供试培养基 黑麦培养基的制备： 黑麦60g，琼脂20g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml。 取60g黑麦在1000ml蒸馏水中浸泡24～36小时，在121℃下高压灭菌30分钟。 捣碎后经4层纱布过滤去渣，上清液补足1000ml，加入琼脂、蔗糖在121℃下高压蒸汽灭菌。 选择性培养基的制备[3]： 在适合于疫霉菌生长的培养基中加入少量可以抑制其他真菌和细菌生长，而对疫霉菌生长抑制不大的抗生素和杀菌剂配置而成的培养基。 每100ml培养基中加入利福平20mg，50%三氯硝基苯20mg，氨苄青霉素10mg。 在待培养基温度下降至50～60℃时，加入所用的药物摇匀，即刻倒平板使用。抗生素和杀菌剂可以配制成母液，在4℃冰箱中保存。
1.2 试验方法 1.2.1 分离和纯化[4]将采集的新鲜病组织在自来水龙头上用缓慢流水冲漂24-36小时，稍晾干。选病健交接处组织切成2×2mm 左右大小。 将易感病的马铃薯表面消毒后切成片，置于放有滤纸的培养皿中，倒入无菌水保持湿润。 将切好的病组织置于马铃薯片上，在20℃温箱中培养数日。 待菌落形成以后，将培养皿底朝上置于低倍显微镜下观察，若分离物的菌丝无隔膜，从菌落边缘移出菌丝块。 将移出的菌丝小心转接到选择性培养基纯化，待再次长出菌落后，在显微镜下直接观察鉴定。进一步观察孢子囊并诱导产生游动孢子进行鉴定。
1.2.2 单孢分离[5]将供试菌株在黑麦培养基的平板上培养8d，用无菌水冲洗后，再用尼龙网过滤除去菌丝，滤液放在灭菌的三角瓶中。 将其置于4℃冰箱中2～3h 以刺激游动孢子释放，然后再用钢丝网过滤除去孢子囊和空孢子囊壳。 用血球计数器将滤液中的游动孢子浓度调至80～160 个/mL，用微量移液器取2μL 游动孢子悬浮液滴于灭菌的载玻片上，在超净工作台上用显微镜（10×10）镜检两遍，肯定该滴悬浮液仅含有1 个游动孢子。 换另一个灭菌的枪头将这1 滴游动孢子悬浮液转移到黑麦培养基平板上。8-20d 后在平板上长出的单个菌落即是单游动孢子分离物菌落。
-2- http://www.paper.edu.cn 2 结果与分析 2.1 分离纯化的结果 经菌丝形态和孢子囊及游动孢子鉴定，本试验获得不同海拔、不同寄主品种的4个菌株，分别为LT1-9、LT3-3、LT4-1、LT4-3，均为单病斑分离物，培养基内的疫霉菌菌丝无隔膜，较粗壮，多分枝，主干不明显，通常清晰可见。孢子囊梨形，大小28.74～26.72×17.76～18.83μm。
2.2单孢子分离结果 采用上述单孢子分离方法，用两个单病斑菌株LT1-9和LT4-3，共分离了20个单游动孢子，其中得到了11个单游动孢子分离物，成功率为55% 表1单游动孢子分离百分率 Table1 Percentage of single-zoospore isolation
菌株编号 单孢子分离数 分离物数 单孢子分离率 Isolates Number of single-zoospore Number of single-zoospore Percentage of single-zoospore I Isolation cultures isolation(%) LT1-9 10 7 70 LT4-3 10 4 40
3 讨论 单孢分离是植物病理学的基本技术，它可纯化病原菌，是进行病原鉴定、生理生化、病菌遗传变异等方面研究的基础[6]。单孢分离的方法很多，常采用平板划线法。但这种方
法不太适用于马铃薯晚疫病菌，因为：（1）市售琼脂杂质较多，经高压灭菌后仍可保留许多不规则的小块，在显微镜下观察时，这些小块不但直接影响观察，而且与马铃薯晚疫病菌的游动孢子囊比较相似，给单孢分离带来困难，加之游动孢子较小，如果进行单个游动孢子的分离则更困难；（2）马铃薯晚疫病菌较难培养，即使在适宜的培养基（如利马豆、v8汁等）上，单个游动孢子或游动孢子囊也难以形成菌落；（3）用镊子挑取小块培养基较
难操作，且易使培养基破碎，很难再保证单孢分离。 分离疫霉菌的目的是获得疫霉菌的纯培养，是研究疫霉菌和植物疫病的最基本技术。采用分离真菌的常规方法分离疫霉菌不容易成功，主要是由于疫霉病组织中常有杂菌如腐霉菌，镰刀菌，丝核菌及某些接合菌混生[7]。这些真菌较疫霉菌迅速，抑制了疫霉菌生长
-3- http://www.paper.edu.cn 或其菌丝将疫霉菌覆盖，因此不能获得疫霉菌的纯培养，或分离到的培养物是其他杂菌。此外，病组织中的细菌在培养基上迅速繁殖，也会抑制疫霉菌的生长[8]。因此，要成功地
分离到疫霉菌，需要采用适合于疫霉菌生长而不适合于其他杂菌生长的选择性培养基。
参考文献： [1]朱杰华，张志铭，杨志辉. 马铃薯晚疫病菌的常规研究方法[J]. 河北农业大学学报,2001,24(2) 112-114 [2]袁海军，姚裕琪 马铃薯晚疫病菌单孢分离技术的改进[J]. 植物保护，2002 [3]郑小波. 疫霉菌及其研究技术 .中国农业出版社 1997 [4]王军, 宋伯符. 晚疫病研究的最新进展和策略. 中国马铃薯学术研讨文集, 黑龙江科学技术出版社, 1996, 210～ 215 [5]张志铭, 李玉琴等. The occu rence of potato late blig t pathogen A 2 maing type in China. 河北农业大学学报, 1996,19 (4) : 62～ 66 [6]赵志坚,何云昆,隋启君. 云南省马铃薯病害主要病原研究进展[J].中国马铃薯,2001,15(2):93-95. [7]姚裕琪,梁德霖,孔繁春. 适合马铃薯晚疫病菌生长的豆类培养基的筛选[J].华北农学报,1998,13(3):88-90. [8]李玉琴,张志铭,田世民,等 .用农药浸泡的马铃薯片培养晚疫病菌[J].河北农业大学学报,1996,19(2):120-121
Purification and Single- spore isolation of phytophthora infestans
Bao Haiyin Collage of Grassland Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou ( 730070 )
Abstract Potato late blight caused by Phytophthora infestans is the most serious fungal disease of potatoes that occurs almost anywhere that potatoes grow. Potato late blight is and it is very difficult to be isolated and purified. Leaves of different potato varieties were collected at different altitude in LinTao,and they were used to do purification and single-zoospore isolation of .The production above can offer experiment material for deeper studies. Keywords：Phytophthora infestans ;Isolation; purification ;single-zoospore isolation
