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土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
实验土壤中细菌的分离与纯化
细菌是微生物中最常见和广泛分布的，它们对人类和自然界都起着重要的作用。
在研究不同类型的细菌时，需要从土壤样品中细菌的分离和纯化。
这可以通过多个步骤来完成。
第一步是样品的准备。
准备好样品是关键的第一步。
需要从所需的环境中收集样品，例如，在花园中收集土壤样品，神经外科手术时，需要收集体内的样品。
样品收集后，需要将其保存在适当的容器中，并避免过度处理。
第二步是制备培养基。
为了孵化细菌，需要准备不同种类的培养基，例如，对光和氧气敏感的厌氧菌需要使用厌氧培养基。
还需要选择颜色，形状和口感不同的特殊培养基，以区分不同种类的细菌。
第三步是分离和纯化细菌。
需要采取逐步流程来分离和纯化细菌。
首先，需要将土壤样品分散在培养基中，并容纳在瓶子或平板上。
然后，将样品暴露于光线和空气下，以让细菌开始生长。
细菌的生长取决于培养基的条件，例如，温度，pH，光线等。
为了获得单个细胞，需要通过挑选法或分离检查板来分离细菌。
挑选法是一种分离单个细菌的技术，其中使用草地绿和某些特定镜头。
经过一些练习和专业技能，可以使用这种方法分离出单个细菌。
为了区分不同种类的细菌，还可以在不同的特殊条件下进行培养。
最后，需要使用不同的方法来检验细菌的纯度。
例如，可以使用静电鉴别法来检测细菌的标记。
通过这种方法，细菌可以在电场的方向下移动，并根据它们的大小，形状，颜色等特征进行分类。
细菌的分离和纯化是细菌学研究的关键步骤。
通过这些方法，可以提取不同种类的细菌，进而进行更深入的研究。
马铃薯16种病虫害图一直以来，以马铃薯晚疫病、早疫病为代表的马铃薯病害，严重影响着马铃薯的产量和质量，成为马铃薯病虫害防治的重点和难点。
在栽植马铃薯过程中除了这些病害，还有其他哪些病虫害？往下读，共梳理了16种。
1.马铃薯晚疫病危害表现：受害叶片的叶尖、叶缘会出现暗绿色小病斑，边缘有灰绿色晕环，边缘分界不明显。
湿度大时，外缘会出现一圈白霉。
天气干燥时，病部会变褐干枯，质脆易裂。
病害严重时，病斑扩展到叶脉、叶柄和茎部，病叶枯死脱落。
被侵染的块茎最初出现褐色小斑点，以后扩大为凹陷的暗褐色不规则病斑。
防治措施：选择保护性药剂和治疗性药剂混合使用，合理安排间隔期。
保护性药剂：丙森锌、代森联、代森锰锌、噻唑锌、王铜、氢氧化铜。
治疗性药剂：氟菌·霜霉威、霜脲·锰锌、烯酰吗啉、氟啶胺等。
2.马铃薯早疫病危害表现：病害可发生在叶片上，也可侵染块茎。
叶片染病，病斑黑褐色，圆形或近圆形，具同心轮纹。
湿度大时，病斑上生出黑色霉层病征。
块茎染病，产生暗褐色稍凹陷圆形或近圆形病斑，边缘分明，病斑下的薯肉出现褐色海绵状干腐。
防治措施：（1）选用抗病品种，增施有机肥；（2）生长期加强肥水管理，适量增施钾肥，适时喷施叶面肥；雨后及时清沟排渍降湿，促进植株健康。
（3）药剂防治。
发病初期，喷施保护性杀菌剂，如丙森锌或代森锰锌等药剂1～2次。
发病较重时，用啶酰菌胺、烯酰·吡唑酯、噁唑菌酮·霜脲氰等药剂防治，隔7～10天喷1次，连喷2～3次。
3.马铃薯枯萎病危害特征：发病初期地上部出现萎蔫。
剖开病茎，薯块维管束变褐，湿度大时，病部常产生白色至粉红色菌丝。
防治方法：发病初期，可采用下列药剂进行防治：苯甲·丙环唑，苯酰菌胺，恶菌灵，萎锈灵等。
4.马铃薯青枯病危害症状发病初期，下部叶片先萎蔫后全株下垂，开始早晚恢复，持续4～5天后，全株茎叶全部萎蔫死亡，但仍保持青绿色，叶片不凋落。
叶脉变褐，茎出现褐色条纹，横剖可见维管束变褐，湿度大时，切面有菌液溢出。
实验八、土壤微生物的分离和纯化土壤微生物是指生长在土壤中的微弱的、微小的生物体，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物等。
土壤微生物是土壤的重要组成部分，对维持土壤生态系统的平衡和功能发挥起着关键作用。
因此，对土壤微生物的分离和纯化具有重要意义。
本实验就是针对土壤微生物的分离和纯化进行研究。
一、实验原理由于土壤微生物数量繁多而多样，分离出单一的菌落对于此实验来说非常的困难。
但是采用适宜的富培养基后能够轻松的促进土壤微生物菌群的生长。
富培养基包括有机和无机元素、维生素、氨基酸、碳源和氮源。
地衣素琼脂（ISP）是一种富含多种碳源和氮源的优质菌落培养基，是常用的微生物培养基。
本实验的基本原理就是在能够生长的环境中分离出单一的菌落，通过多次分离和鉴定获得纯种菌株。
二、实验器材和试剂1.地衣素琼脂培养基2.试管、移液器、移菌环、烧灼器、电热蚊子香、灭菌器3.已经壳霉菌疫苗接种的贵州悬钩子种子和土壤三、实验步骤1.准备工作。
用移液器将壳霉菌疫苗接种在新的地衣素琼脂培养基板上，将其灭菌，以备之后的使用。
2.准备土壤基质。
将土壤样品剪碎成非常小的颗粒，并放入烧灼的试管中，加入恰当的地衣素酵母素琼脂，变形后形成一个接种板。
在较大的容器中放置电热器设备，以保持环境的湿度和温度适宜。
接下来，将接种板和采样站放在单独的区域以免混淆。
3.接种。
从土壤中取一小部分，倒入试管中，并加入适量的地衣素琼脂培养基，并将其摇动均匀，使菌群溢出。
等到土壤均匀地分散在地衣素琼脂培养基中之后，用移菌环扭曲并切出一个菌落，并将其置于新的地衣素琼脂培养基板中。
重复此步骤至少三次，每次都要将新的分离土壤菌落剪出来。
4.孵育。
将地衣素琼脂培养基板置于电热器设备中，以使温度保持在合适的范围内，并等待菌落的生长。
当新的菌落形成后，即可重复上述步骤以获得更多的菌株。
5.纯化。
检查菌落后，需要进行纯化。
鉴定每个菌落，把每个菌落分别悬浮在新的地衣素琼脂培养基板中，并等待菌落的生长。
最新的土豆病害图谱都找齐了，一定要转发啊！危害马铃薯的病虫害有300多种，但并不是所有的病虫害都会造成马铃薯严重减产。
马铃薯病害主要分为真菌病害、细菌病害和病毒病。
其中由真菌引起的马铃薯晚疫病是世界上最主要的马铃薯病害，几乎能在所有的马铃薯种植区发生。
通常说的种薯退化即为不同病毒引起的多种病毒病所造成。
马铃薯害虫分地上害虫和地下害虫，其中比较主要的有马铃薯块茎蛾、蚜虫等。
一、马铃薯真菌性病害①晚疫病田间发病状晚疫病是马铃薯主产区最重要的一种真菌病害，其最初传播来源是邻近的薯田或番茄、杂草和有机堆肥。
【病害症状】叶片染病先在叶尖或叶缘生水浸状绿褐色斑点，病斑周围具浅绿色晕圈，湿度大时病斑迅速扩大，呈褐色，并产生一圈白霉，即孢囊梗和孢子囊，尤以叶背最为明显；干燥时病斑变褐干枯，质脆易裂，不见白霉，且扩展速度减慢。
茎部或叶柄染病现褐色条斑。
发病严重的叶片萎垂、卷缩，终致全株黑腐，全田一片枯焦，散发出腐败气味。
块茎染病初生褐色或紫褐色大块病斑，稍凹陷，病部皮下薯肉亦呈褐色，慢慢向四周扩大或烂掉。
【防治方法】防治晚疫病，首先要选择抗病品种；其次，播前严格淘汰病薯。
一旦发生晚疫病感染，一般很难控制，因此必须在晚疫病没有发生前进行药剂防治，即当日平均气温在10-25℃之间，下雨或空气相对湿度超过90%达8小时以上的情况出现4-5天后喷洒药剂进行防治。
可用70%代森锰锌可湿性粉剂来进行防治，每亩用量175-225克，兑水后进行叶面喷洒。
如果没有及时喷药，田间发现晚疫病植株后，则需要用瑞毒霉（也称为雷多米尔、甲霜灵）之类的药剂进行防治，每亩用25%瑞毒霉可湿性粉剂150-200克，兑水进行叶面喷施。
如果一次没有将病害控制住，则需要进行多次喷施，时间间隔为7-10天。
此外，环境条件也影响晚疫病的传播，为防止块茎感染，应当高培土。
如果植株地上部分受到晚疫病侵染，则最好在收获前将病秧割除并清理处田块，防止收获的薯块与之接触。
实验三土壤中微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术一、教学目标与基本要求：1、掌握倒平板的技术和分离纯化微生物的基本操作技术。
2、设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。
二、实验内容：1．用稀释法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线法分离纯化微生物。
3．学习斜宜接种、穿刺接种、平板接种、液体接种等接种方法。
三、实验步骤（一）微生物分离的方法有很多种，但常用的有两种：1.平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，二获得单个菌落，从而达到分离的目的，具体方法如下： 1)倒制平板：将固体培养基熔化，冷却至50-55℃，然后在酒精灯火焰旁，以右手持培养基，左手拿培养皿，以无菌操作将培养基注入培养皿内，约15ml，轻微转动培养基，使培养基均匀分布，然后静置于水平位置，凝固即成平板，并在皿该边贴上标签。
2.稀释平板分离法稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种记数方法。
1)制备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品1g，加入装有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成10-2土壤稀释液，然后用无菌移液管吸取9ml无菌水的试管内，制成10-3的稀释液将此移液管在试管内反复吸冲三次，然后取出移液管，并将其通过火焰，再插入原来包移液管的纸套内，以备再用，振荡10-3 的稀释液试管，再从纸套取出原来的移液管插入已混匀的试管内，再吹洗三次，然后吸出1ml10-3的稀释液至另一支装有9ml 无菌水的试管中，制成10-4稀释液。
用同样方法再制成10-5、10-6的稀释液，稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的 10-6的稀释液开始吸取1ml10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内，整个分离过程见下图。
土壤细菌的分离与纯化土壤细菌是一种普遍存在于土壤中的微生物，它们在土壤生态系统中发挥着重要的角色。
分离和纯化土壤细菌，不仅可以研究其基本特性、生物学功能和代谢途径等，还可以开发其潜在的应用价值，比如生物农药和生物化学制品的生产等。
本文将介绍土壤细菌的分离和纯化过程，以及影响土壤细菌分离的因素和纯化方法。
土壤细菌的分离是指从土壤中分离得到单个细菌菌落的过程。
一般分离方法有以下几种：（一）稀释涂布法该方法是将土壤分别用不同浓度的生理盐水进行稀释，然后将不同浓度的土壤悬液制成平板培养基并涂布在培养基上。
菌落形成后，可再次从菌落上接种单个细菌。
该方法适用于分离数量稀少的细菌。
（二）膜过滤法该方法是将土壤和生理盐水混合后通过孔径为0.22μm的滤膜过滤出微生物体，然后将此滤膜放置于适宜的培养基上进行培养。
该方法适用于分离数量较多的细菌。
（四）毛细管沉淀法该方法是利用毛细管的吸力将土壤中的细菌沉淀到毛细管中，然后将毛细管插入含有适宜培养基的瓷片中，放置在恒温箱中进行分离和培养。
该方法适用于分离数量稀少的细菌。
（五）选择性富集法该方法是通过添加选择性富集剂使特定种类的细菌生长，不同种类的细菌生长受到不同富集剂的影响。
该方法适用于富集数量稀少的特定种类细菌。
（一）单菌落分离法该方法是将分离得到的细菌菌落在新的培养基上进行二次分离和培养，直至获得单一的细菌菌落。
该方法适用于分离数量较多并且形态较为相似的细菌。
（三）挑选法该方法是利用显微镜观察细菌形态和形状，手工用铂丝挑选出单个细菌菌落。
该方法适用于菌落数量较少且形态差异较大的细菌。
该方法是利用滤纸将细菌菌液过筛，分离得到单个细菌颗粒。
该方法适用于分离数量较少的细菌。
土壤细菌的分离受到多种因素的影响，如土壤环境因素、培养基种类和培养方式等。
（一）土壤环境因素土壤的物理化学因素，如土壤温度、pH值、土壤含水量等对土壤细菌的生长有很大影响。
不同种类的土壤中细菌种群差异很大，所以适当选择适宜的土壤样品可以更好的分离得到目标细菌群落。
实验十七、病原菌的分离培养、纯化和保存一、目的要求(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。
最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricularia orycae)。
(2)玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(Curvularia lunata)。
(4)玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。
(5)番茄灰霉病果(Botrytis cineFca)。
(6)黄瓜菌核病果(Sclerotinia sclerotiorum)。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(Pseudomonas syringaepv．1achrymans)。
(8)水稻白叶枯病叶(Xanthomonas campestms pv.oryeue)。
(9)大豆细菌性斑点病叶(Pseudomonas syringaepv．glycinea)。
(10)白菜软腐病叶(Erudnia carotovora subsp．carotovora)。
超详细！早疫病、晚疫病和绵疫病到底有啥不一样？（附高清图谱）一般来说，植物疫病，可以分成细菌性和真菌性两大类。
而真菌性中，又可以分成高等真菌（以早疫病为代表）、低等真菌（以晚疫病为代表），有“早高晚低”的说法。
一、细菌性疫病细菌性疫病（有时候也简称疫病），是由黄单孢杆菌侵染所致。
病菌主要在种子内越冬，也可以随着病残体在土壤中越冬，可以存活2-3年。
植株发病后会产生菌脓，借着风雨、昆虫传播，从植物叶的水孔、气孔及伤口侵入。
该病发病最适宜温度为30℃，高湿高温条件下，发病严重。
主要危害作物有：菜豆、扁豆等豆科作物，胡萝卜，丁香，桑，木薯等。
例如：豇豆细菌性疫病（野油菜黄单胞菌豇豆致病变种，属细菌）菜豆细菌性晕疫病（丁香假单胞杆菌菜豆晕疫病致病变种，属细菌）菜豆细菌性疫病（野油菜黄单胞菌菜豆致病变种，属细菌）症状：以菜豆细菌性疫病为例，其主要侵染叶、茎蔓、豆荚和种子。
幼苗出土后，子叶呈红褐色溃疡状，叶片染病，初生暗绿色油浸状小斑点，后逐渐扩大成不规则形，病斑变褐色，干枯变薄，半透明状，病斑周围有黄色晕圈，干燥时易破裂。
严重时病斑相连，全叶枯干，似火烧一样，病叶一般不脱落。
高湿高温时，病叶可凋萎变黑。
茎上染病，病斑红褐色，稍凹陷，长条形龟裂。
叶片上病斑不规则形，褐色，干枯后组织变薄，半透明，病斑周围有黄色晕环。
豆荚上初生油浸状斑马点，扩大后不规则形，红色，有的带紫色，最终变为褐色。
病斑中央凹陷，斑面常有淡黄色的菌脓。
菜豆细菌性疫病豇豆细菌性疫病菜豆细菌性晕疫病二、真菌性疫病（一）高等真菌疫病：最主要最常见的一类为茄科植物（例如番茄、辣椒、马铃薯、茄子的早疫病），属半知菌亚门真菌链格孢属。
茄子早疫病（茄链格孢属半知菌亚门真菌）番茄早疫病（茄链格孢属半知菌亚门真菌）辣椒早疫病（茄链格孢属半知菌亚门真菌）芹菜早疫病（芹菜尾孢霉属半知菌亚门真菌）马铃薯早疫病（茄链格孢属半知菌亚门真菌）症状：苗期、成株期均可发病，苗期发病，幼苗的茎基部生暗褐色病斑，稍陷，有轮纹。
作物品种抗病性鉴定实验指导实验一一、真菌、细菌培养基的配制及培养皿的灭菌1、马铃薯葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基：是培养真菌最常用的培养基成分如下：去皮马铃薯200 克葡萄糖（或蔗糖）20 克琼脂17—20 克水1000 毫升配置方法：将马铃薯洗净去皮，称取200克，切成小块，放入锅中加水1000毫升，煮沸半小时，然后用双层洁净纱布过滤去渣，在滤液中加葡萄糖（或蔗糖）20克，加水补足1000毫升。
配成的培养液一般呈酸性，若用于培养真菌，可以不必矫正它的酸度。
如配成固体培养基，可加入琼脂17—20克，加热使琼脂完全融化，同时补足应有的水量。
趁热分装在试管或三角瓶中，加棉花塞后灭菌。
每管约5毫升。
2、肉浸膏蛋白胨培养基：是培养细菌最常用的培养基成分如下：牛肉浸膏 3 克，蛋白胨5—10 克，葡萄糖或蔗糖10 克，琼脂17—20 克。
水1000毫升配置方法：先将牛肉浸膏、蛋白胨和糖溶于少量热水中，然后加水到1000毫升，矫正其酸度到中性反应，加入琼脂溶化，趁热装入试管或三角瓶，加棉花塞后灭菌。
矫正培养基酸度的方法：用刻度吸管吸取5毫升培养液于试管中，加入麝香兰指示剂5滴。
如培养基呈黄色（表示酸性），则用有刻度的吸管加入N/20的NaOH调节；若培养基呈兰色（表示碱性），则加N/20的HCl 调节。
最后，使培养基呈草绿色为止，记下所加N/20的NaOH或HCl的量，以加入的量乘10，即为1000毫升培养基中应加1N NaOH或HCl的量。
例如5毫升的培养基加N/20 NaOH 0.3毫升既达到中性反应，则在1000毫升培养基中应加入1N NaOH 3 毫升。
3、培养基的灭菌配制好的培养基必须经过灭菌后方能使用，培养基的灭菌一般是用高压蒸汽灭菌法（又称湿热灭菌）。
其原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。
将要灭菌的培养基、灭菌水等置于灭菌锅中，一般锅中加入2000－4000毫升（不同的高压灭菌锅加水的量不同），密闭锅盖，打开排气活门，加热至锅内空气全部排除（可根据活门冲击的全部是蒸汽时来确定排气是否彻底），即可关闭排气活门。
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。
一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。
所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。
病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。
－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。
灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。
消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。
在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。
但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。
涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。
此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
土壤中放线菌的分离和纯化实验报告土壤中放线菌的分离和纯化实验报告土壤是一个很复杂，有许多层次的生态系统。
要想从事物体内分离得到目标产物，必须在特定条件下进行，而不能凭空臆断。
因此，实验室分离放线菌所需设备也应根据这些原则来选择和准备，如果单凭某种条件就妄加判断那么往往会导致实验失败或造成人力财力上的浪费。
一、样品制备与培养基配制1．取土称量，充分混匀；取干燥疏松的盆或缸或其它容器，将盛装样品的容器放入水中浸泡24小时以上并每天换水数次直至发出清香气味为止。
2．称取少量样品于蒸馏水中，混合均匀。
3．挑取含水量适当的样品接种于经灭菌消毒的马铃薯种子培养基平板上。
4．将经过灭菌消毒的培养皿置于恒温箱或酒精灯上加热使之软化。
5．软化后的样品立即倒入100毫升灭菌马铃薯琼脂培养基中。
6．迅速摇动平板混匀，冷却至45℃左右，用无菌操作法倒平板并贴签标记好。
二、增菌接种三、初代培养和测试计算平板上的菌落数，挑取相同的稀释度再按照步骤一继续培养。
然后检查各种参数及观察培养结果，对比最终的数值，以判断微生物对放线菌的敏感程度和产率。
四、菌种保藏采集长期保存的菌种可采用50℃的马铃薯培养基，将菌液接入0.7%-0.8%琼脂斜面中，斜面凝固后将斜面置冰箱中低温保存。
五、影响实验结果的主要因素环境条件和杂菌污染的因素都会严重地影响放线菌的分离纯化效果，如果只注意控制某个方面，忽视了另外两个条件都难以获得满意的结果，故要求分析工作者既要认真仔细又要灵活掌握，对那些关键性的技术环节和易受外界干扰因素影响的项目应给予足够的重视，这里只简略说明几点。
（1）温度是决定分离效果的主要因素之一。
通常情况下，分离放线菌要在25℃～28℃，湿度60%～70%的条件下进行，温度高达40℃，不但有碍于菌株的正常繁殖，还会导致菌种死亡。
2．采用多菌种混合分离的办法更能提高效率。
（3）琼脂浓度的影响在各种放线菌的分离中，无论是直接法还是间接法，均以琼脂培养基的营养丰富、无机盐和生长因子较多等优良特性著称，故为放线菌分离的常规方法，由于它在生长过程中氧化葡萄糖产酸，故利用这一特点来抑制微生物的呼吸，同时利用无机盐提供电子使酶钝化，因而提高了实验效果，并且减轻了劳动强度。
http://www.paper.edu.cn 马铃薯晚疫病菌的分离纯化和单孢分离 包海银 甘肃农业大学草业学院，兰州（730070） 摘 要：晚疫病是马铃薯上最严重的真菌病害，它普遍发生于马铃薯的产区，引起马铃薯晚疫病的致病疫霉很难分离培养并得到纯菌株，本文对采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯晚疫病病叶进行致病疫霉菌的分离纯化和单孢分离，为马铃薯晚疫病菌的进一步研究提供试验材料。 关键词：马铃薯晚疫病菌，分离，纯化，单孢分离
马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)是全球马铃薯生产中毁灭性病害，是所有引起粮食作物产量损失的病害中最严重的一种真菌性病害, 全球每年因此病害造成的直接经济损失达170 亿美元以上[1]。我省马铃薯产区都有发生，陇南和中部的阴湿二阴地区最重，只
要7-9月降雨频繁，晚疫病必定大流行。六十年代初期，每年该病损失薯块占总产量的15%，1966年后，由于推广了比较抗病的品种，使该病得到了长期控制。但近年来，由于一些抗病品种退化，在阴湿多雨地区，该病又开始流行。 P. infestans存在A1、A2两种交配型，在寄主上通常以无性生殖方式繁殖。A2交配型1980年以前仅在墨西哥中部发现，世界其它各地只有A1交配型分布。但在后来的10-15 年中，A2交配型在世界各地包括欧洲、亚洲、南美洲、北美洲等相继发现。我国南北方也均已发现A2交配型的存在[2]，因此80年代后，新的晚疫病原小种已经逐步取代了原有A1交
配型生理小种，产生毒性更强的小种。A1、A2交配型的有性重组产生的卵孢子具有能忍耐不良环境、存活时间长的特点，有可能成为生命力更强，能够摆脱活体薯块存在的新的病源，这将为晚疫病防治带来更大困难。 马铃薯晚疫病主要靠化学药剂进行防治，常用的药剂是瑞毒霉，但自1980年后在荷兰、爱尔兰和其它欧洲国家、美洲及中东等地区也相继发现了抗性菌株发现抗的晚疫病菌株，对我国马铃薯主产区晚疫病菌株抗药性试验表明，90年代后期使用过瑞毒霉的地区普遍存在抗药性菌株。 对马铃薯晚疫病菌进行分离纯化以及单游动刨子无性系的建立，在遗传上获得较均一的单孢菌株，对疫霉菌的生理生化、抗药性的监测和遗传研究是一项十分有用的技术。据报道，从一个孢子囊中获得分离物能明显地分为三个不同的生理小种，从而证明了游动孢子的异核性，马铃薯晚疫病菌游动孢子的多核性在病原菌寄生变异中有很大意义，异质核能决定产生特异性的新菌系，虽然研究人员报道不同游动孢子的多核性，但人们普遍认为单游动孢子基本上是单核的。所以，在晚疫病菌遗传学和分子生物学以及交配型测定中，为了试验更高的准确性和重复性，最好应选用遗传性状单一的单游动孢子分离物作为实验材料。 本文对采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯晚疫病病叶进行致病疫霉菌的分离纯化和单孢分离，为马铃薯晚疫病菌的进一步研究提供试验材料。
1 材料与方法 1.1供试材料： -1- http://www.paper.edu.cn 以采自临洮不同海拔、不同品种马铃薯病叶为试验材料。 1.1.1 供试培养基 黑麦培养基的制备： 黑麦60g，琼脂20g，蔗糖20g，蒸馏水1000ml。 取60g黑麦在1000ml蒸馏水中浸泡24～36小时，在121℃下高压灭菌30分钟。 捣碎后经4层纱布过滤去渣，上清液补足1000ml，加入琼脂、蔗糖在121℃下高压蒸汽灭菌。 选择性培养基的制备[3]： 在适合于疫霉菌生长的培养基中加入少量可以抑制其他真菌和细菌生长，而对疫霉菌生长抑制不大的抗生素和杀菌剂配置而成的培养基。 每100ml培养基中加入利福平20mg，50%三氯硝基苯20mg，氨苄青霉素10mg。 在待培养基温度下降至50～60℃时，加入所用的药物摇匀，即刻倒平板使用。抗生素和杀菌剂可以配制成母液，在4℃冰箱中保存。
1.2 试验方法 1.2.1 分离和纯化[4]将采集的新鲜病组织在自来水龙头上用缓慢流水冲漂24-36小时，稍晾干。选病健交接处组织切成2×2mm 左右大小。 将易感病的马铃薯表面消毒后切成片，置于放有滤纸的培养皿中，倒入无菌水保持湿润。 将切好的病组织置于马铃薯片上，在20℃温箱中培养数日。 待菌落形成以后，将培养皿底朝上置于低倍显微镜下观察，若分离物的菌丝无隔膜，从菌落边缘移出菌丝块。 将移出的菌丝小心转接到选择性培养基纯化，待再次长出菌落后，在显微镜下直接观察鉴定。进一步观察孢子囊并诱导产生游动孢子进行鉴定。
1.2.2 单孢分离[5]将供试菌株在黑麦培养基的平板上培养8d，用无菌水冲洗后，再用尼龙网过滤除去菌丝，滤液放在灭菌的三角瓶中。 将其置于4℃冰箱中2～3h 以刺激游动孢子释放，然后再用钢丝网过滤除去孢子囊和空孢子囊壳。 用血球计数器将滤液中的游动孢子浓度调至80～160 个/mL，用微量移液器取2μL 游动孢子悬浮液滴于灭菌的载玻片上，在超净工作台上用显微镜（10×10）镜检两遍，肯定该滴悬浮液仅含有1 个游动孢子。 换另一个灭菌的枪头将这1 滴游动孢子悬浮液转移到黑麦培养基平板上。8-20d 后在平板上长出的单个菌落即是单游动孢子分离物菌落。
-2- http://www.paper.edu.cn 2 结果与分析 2.1 分离纯化的结果 经菌丝形态和孢子囊及游动孢子鉴定，本试验获得不同海拔、不同寄主品种的4个菌株，分别为LT1-9、LT3-3、LT4-1、LT4-3，均为单病斑分离物，培养基内的疫霉菌菌丝无隔膜，较粗壮，多分枝，主干不明显，通常清晰可见。孢子囊梨形，大小28.74～26.72×17.76～18.83μm。
2.2单孢子分离结果 采用上述单孢子分离方法，用两个单病斑菌株LT1-9和LT4-3，共分离了20个单游动孢子，其中得到了11个单游动孢子分离物，成功率为55% 表1单游动孢子分离百分率 Table1 Percentage of single-zoospore isolation
菌株编号 单孢子分离数 分离物数 单孢子分离率 Isolates Number of single-zoospore Number of single-zoospore Percentage of single-zoospore I Isolation cultures isolation(%) LT1-9 10 7 70 LT4-3 10 4 40
3 讨论 单孢分离是植物病理学的基本技术，它可纯化病原菌，是进行病原鉴定、生理生化、病菌遗传变异等方面研究的基础[6]。单孢分离的方法很多，常采用平板划线法。但这种方
法不太适用于马铃薯晚疫病菌，因为：（1）市售琼脂杂质较多，经高压灭菌后仍可保留许多不规则的小块，在显微镜下观察时，这些小块不但直接影响观察，而且与马铃薯晚疫病菌的游动孢子囊比较相似，给单孢分离带来困难，加之游动孢子较小，如果进行单个游动孢子的分离则更困难；（2）马铃薯晚疫病菌较难培养，即使在适宜的培养基（如利马豆、v8汁等）上，单个游动孢子或游动孢子囊也难以形成菌落；（3）用镊子挑取小块培养基较
难操作，且易使培养基破碎，很难再保证单孢分离。 分离疫霉菌的目的是获得疫霉菌的纯培养，是研究疫霉菌和植物疫病的最基本技术。采用分离真菌的常规方法分离疫霉菌不容易成功，主要是由于疫霉病组织中常有杂菌如腐霉菌，镰刀菌，丝核菌及某些接合菌混生[7]。这些真菌较疫霉菌迅速，抑制了疫霉菌生长
-3- http://www.paper.edu.cn 或其菌丝将疫霉菌覆盖，因此不能获得疫霉菌的纯培养，或分离到的培养物是其他杂菌。此外，病组织中的细菌在培养基上迅速繁殖，也会抑制疫霉菌的生长[8]。因此，要成功地
分离到疫霉菌，需要采用适合于疫霉菌生长而不适合于其他杂菌生长的选择性培养基。
参考文献： [1]朱杰华，张志铭，杨志辉. 马铃薯晚疫病菌的常规研究方法[J]. 河北农业大学学报,2001,24(2) 112-114 [2]袁海军，姚裕琪 马铃薯晚疫病菌单孢分离技术的改进[J]. 植物保护，2002 [3]郑小波. 疫霉菌及其研究技术 .中国农业出版社 1997 [4]王军, 宋伯符. 晚疫病研究的最新进展和策略. 中国马铃薯学术研讨文集, 黑龙江科学技术出版社, 1996, 210～ 215 [5]张志铭, 李玉琴等. The occu rence of potato late blig t pathogen A 2 maing type in China. 河北农业大学学报, 1996,19 (4) : 62～ 66 [6]赵志坚,何云昆,隋启君. 云南省马铃薯病害主要病原研究进展[J].中国马铃薯,2001,15(2):93-95. [7]姚裕琪,梁德霖,孔繁春. 适合马铃薯晚疫病菌生长的豆类培养基的筛选[J].华北农学报,1998,13(3):88-90. [8]李玉琴,张志铭,田世民,等 .用农药浸泡的马铃薯片培养晚疫病菌[J].河北农业大学学报,1996,19(2):120-121
Purification and Single- spore isolation of phytophthora infestans
Bao Haiyin Collage of Grassland Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou ( 730070 )
Abstract Potato late blight caused by Phytophthora infestans is the most serious fungal disease of potatoes that occurs almost anywhere that potatoes grow. Potato late blight is and it is very difficult to be isolated and purified. Leaves of different potato varieties were collected at different altitude in LinTao,and they were used to do purification and single-zoospore isolation of .The production above can offer experiment material for deeper studies. Keywords：Phytophthora infestans ;Isolation; purification ;single-zoospore isolation
