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斑马鱼饲养及繁殖孵化过程研究摘要：斑马鱼是一种重要的脊椎动物模式生物，因其胚体全透明，繁殖速度快，使用样品量少，饲养成本低，而被作为一种理想的模式动物广泛的应用于科学试验。
本实验通过对斑马鱼生长条件研究，探究斑马鱼可以生长的适宜条件，并在一定条件下使斑马鱼产卵，探究斑马鱼孵化及鱼苗生长条件，建立斑马鱼的养殖平台，为之后进行斑马鱼毒性急性急性实验奠定良好的基础。
关键词：斑马鱼；生长发育；繁殖；胚胎发育孵化；鱼苗斑马鱼（学名：Barchydanio rerio var，别名：蓝条鱼）是一种重要的低等脊椎动物模式生物，因其具有个体小、生殖周期短、繁殖能力强及胚胎透明便于观察等优点，被广泛应用于发育生物学、环境毒理学、免疫学等领域[1]。
斑马鱼在基因水平上87%与人类同源，早期发育也与人类极为相似，这使得斑马鱼及其胚胎在人类疾病的研究中有重要的应用价值[2，3]。
其胚胎、幼鱼和成鱼最早是被用来检测水中的有毒物质和致畸物[4]。
Streisinger 等[8]于 1981 年首次将斑马鱼与遗传学和生物学领域划上联系，使其研究领域得以拓展和延伸。
目前，斑马鱼已被广泛用于遗传学、生态毒理学、药物药效活性物质筛选、药物代谢、药物毒性物质筛选等方面[9]。
该实验通过观察斑马鱼的形态特征，生活习性，繁殖发育，调节孵化条件，熟悉并建立斑马鱼养殖、繁殖、孵化、鱼苗养殖等一系列养殖平台，为之后开展斑马鱼相关生理药理实验奠定基础。
1实验材料1.1 实验用鱼成年AB系斑马鱼，六月龄，来源于斑马鱼科研服务中心1.2 仪器与设备T-240F9L水族箱（宝潮水族专营店）；产卵缸（南京一树梨花生物科技有限公司）培养皿若干、斑马鱼饲料（斑马鱼科研服务中心）、控温棒（斑马鱼科研服务中心）、生化培养箱（上海坤天实验室仪器有限公司）、6孔板、电子分析天平（万分之一赛多利斯科学仪器有限公司）。
1.3 实验试剂无水乙醇、500ml硝化细菌菌液、260ml水质稳定剂（上海寸景水族用品有限公司）、250ml胚胎培养液、亚甲基蓝（分析纯，成都市科龙化工试剂场2斑马鱼形态及习性2.1外形及雌雄鱼分辨AB型斑马鱼（野生型）体长为4～6cm，最大体长可达8cm。
发文章斑马鱼动物伦理材料斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化，在生命科学领域中应用前景十分广阔。
斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选，此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。
因为斑马鱼对污染物反应灵敏，现已用于监测环境污染物及污水检测。
本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。
关键字：斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。
属辐鳍鱼纲鲤科。
斑马鱼身体细长,呈纺锤形，成鱼体长约4-6cm,因全身布满深蓝色条纹似斑马样而得名。
斑马鱼雌雄鉴别容易,雄鱼体型细长，颜色偏黄，条纹较为显著，纵纹为柠檬色；雌鱼身体肥胖，颜色较淡，纵纹呈蓝色加银灰色，在性成熟后腹部肥大。
雌鱼每次可产卵300多枚，鱼卵易收集，其胚胎透明,繁殖能力强且生长发育速度快，对饲养要求低，可高密度饲养，与其他实验动物相比有很大优势，是一种非常受欢迎的实验动物模型。
近三十年来，已有约20个斑马鱼品系的基因数据库资料，全球已有超过1500个斑马鱼实验室，而我国也有超过250个实验室利用斑马鱼开展相关研究。
英国桑格研究所（Trust Sanger Institute）于2013年完成了斑马鱼的参考基因组，研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同，并进行了系统性的全基因组分析.在此综合近几十年的研究，在胚胎及遗传发育学、基因组学、药物筛选、疾病模型的建立等方向探讨斑马鱼的研究成果及进展。
1.胚胎及遗传生物学方向斑马鱼的发育分为6个阶段：卵裂期，囊胚期，原肠胚期、分裂期、成形期和孵化期。
斑马鱼属于体外受精动物，胚胎在体外发育且胚胎透明，发育过程可以直接连续的观察，是研究胚胎发育和遗传生物学的理想模式，解决了小鼠胚胎期变化不易观察的自身缺陷。
苯醚甲环唑对斑马鱼毒性及作用机制研究共3篇苯醚甲环唑对斑马鱼毒性及作用机制研究1苯醚甲环唑对斑马鱼毒性及作用机制研究作为一种常见的杀虫剂，苯醚甲环唑（chlorfenapyr）被广泛应用于农业生产中。
然而，苯醚甲环唑的大规模使用不仅会对有益生物产生影响，还会对生态环境造成破坏。
斑马鱼作为一种广泛应用于毒性测试的模式生物，在研究苯醚甲环唑的毒性和作用机制方面具有重要的意义。
斑马鱼是一种小型淡水鱼类，具有快速繁殖、易于养殖和通过外观观察等优点，是研究毒性作用的重要模式生物之一。
研究表明，苯醚甲环唑对斑马鱼的毒性主要表现为对其生殖发育和行为的影响。
在苯醚甲环唑暴露下，斑马鱼的生殖发育受到抑制，如精子和卵子的生成和受精能力明显下降等。
同时，苯醚甲环唑的暴露还会引起斑马鱼行为发生改变，如对光和声音的反应受到抑制，游动能力下降等。
针对这些毒性效应，科学家们进行了大量的研究，以探究苯醚甲环唑的作用机制。
研究表明，苯醚甲环唑会影响斑马鱼的线粒体呼吸链活动、红氧酶活性和ATP生成等，从而导致斑马鱼生殖功能和行为受到抑制。
此外，苯醚甲环唑还可能通过影响斑马鱼神经递质的水平，影响其神经系统的功能。
研究发现，苯醚甲环唑暴露后，斑马鱼体内谷氨酸和γ-氨基丁酸等神经递质的浓度明显下降，这可能是导致斑马鱼行为和生殖发育异常的重要原因之一。
为了更好地了解苯醚甲环唑对斑马鱼的毒性和作用机制，还需要开展更深入的研究。
一方面，需要对苯醚甲环唑对斑马鱼生物学多元性的影响进行综合评估，揭示其对斑马鱼个体、种群和群落的影响程度。
另一方面，需要深入研究苯醚甲环唑毒性作用的分子机制，以给出防治苯醚甲环唑毒性的更有效方法。
总之，苯醚甲环唑的大规模使用不仅会对有益生物产生影响，还会对生态环境造成破坏。
因此，开展苯醚甲环唑对斑马鱼毒性及作用机制的研究有着重要的意义，可以为保护生态环境和维护人类健康作出贡献综上所述，苯醚甲环唑对斑马鱼的毒性效应已经被广泛研究。
斑马鱼胚胎发育的分期CHARLES B. KIMMEL, WILLIAM W. BALLARD, SETH R. KIMMEL等原著俄勒冈大学神经生物学学院；达特茅斯学院生物系黄万旭译浙江大学生命科学学院摘要：我们对斑马鱼（zebranfish, Danio rerio）胚胎发育的分期作了一系列的阐述。
我们定义了胚胎发育的七段时期（period）——合子（zygote）、卵裂（cleava g e）、囊胚（blastula）、原肠（gastrula）、分节（segmentation）、咽囊（pharyngula），以及孵化期（hatching period）。
这一划分强调了发生于受精后头3天的主要发育过程中的变化情况，同时我们也回顾了发生于每一时期的诸如形态发生及其他主要事件。
时期的下一划分单位是分期（stage）。
各分期都有名称，而非标号，反映了分期序列的灵活性和持续演变过程，因为我们从这一物种中还能得到更多。
各分期的命名是基于用解剖立体显微镜（dissecting stereomicroscope）观察活体胚胎所容易观察到的形态学特征为依据的，同时也充分利用了活体胚胎的透明性，这一性质使我们可以用组合显微镜（compound microscope）和Nomarski干涉相差照明（Nomarski interference contrast illumination）观察到即使很深层的结构。
显微照相（photomicro- graphs）和组合显微描图（composite camera lucida line drawings）则以图片刻画了每一分期。
此外还有一些图像则显示了发育过程中一些可用作分期辅助标志的显著特征。
关键词：斑马鱼，形态发生，胚胎发生，合子，卵裂，囊胚，原肠，分节，咽囊，孵化目录概述 (1)全文组织结构 (1)步骤 (3)温度与标准发育时间 (8)合子期（0-0.75h） (9)卵裂期（0.75-2.25h） (9)囊胚期（2.25-5.25h） (12)原肠期(5.25-10h) (16)体节期（10-24h） (21)咽囊期（24-48h） (33)孵化期（48-72h） (42)早幼期 (48)谢辞 (48)斑马鱼胚胎发育的分期概述分期为发育研究提供了准确度。
斑马鱼在发育生物学中的研究进展斑马鱼（Danio rerio）是一种常见的小型热带淡水鱼类，也是一种重要的生物模型，因为它们易于繁殖和维护，具有透明胚胎，容易观察和操纵发育过程的特点。
在过去的几十年里，许多生物学家使用斑马鱼进行发育生物学研究，探寻分子机制、细胞过程、组织发生、器官形成和行为等方面的问题。
本文将介绍斑马鱼在发育生物学中的研究进展及其应用。
1. 斑马鱼的发育过程斑马鱼的发育过程可分为四个主要阶段：受精、分裂、胚胎发育和幼鱼期。
受精后，卵细胞形成受精卵，随后通过有丝分裂发育成为多个细胞，其中包括前期胚胎、球胚和盘胚。
在这些早期阶段，斑马鱼的胚胎透明，发育过程可以通过显微镜直接观察。
在幼鱼期，斑马鱼游泳、摄食和生长，逐渐成为成年鱼。
2. 斑马鱼的发育成因对于斑马鱼的发育成因的研究可以通过突变体筛选、遗传分析、基因克隆等方法进行。
许多突变体显示了不同的发育缺陷，例如胃肠道畸形、神经系统缺陷、鳍/肢体畸形等。
通过对这些突变体的遗传分析和基因克隆，科学家发现了很多与斑马鱼发育相关的基因，如sonic hedgehog、hox等。
另外，近年来，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，科学家可以精确地改变斑马鱼基因组中的某些位点，以研究特定基因功能或疾病模型等方面的问题。
这种方法加速了斑马鱼发育生物学的研究和应用。
3. 斑马鱼的组织和器官形成斑马鱼的器官发生过程是发育生物学的热点研究之一。
在胚胎发育过程中，骨骼、肌肉、心脏、肝脏、胰腺等组织和器官的形成令人印象深刻。
例如，斑马鱼心脏的发育非常相似于人类的心脏发育过程。
斑马鱼心脏发育的详细解剖和功能特征使得我们可以更好地理解人类心脏疾病，包括先天性心脏缺陷和心肌病等。
在肌肉结构和功能方面，斑马鱼是一种适应游泳的生物模型。
它们的鱼体非常透明，我们可以观察和操纵它们的鱼肌和鱼晶体肌的发育和生理功能。
研究斑马鱼肌肉发育和运动调节机制有助于解决人类运动性疾病诊断和治疗的问题。
低温对斑马鱼ZF4细胞基因组DNA甲基化水平的影响侯艳雯;刘玮;姜蓬垒;张俊芳;韩兵社【摘要】低温压力会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚至死亡,鱼类会产生各种适应性变化来应对低温压力,其中涉及的表观遗传学机制越来越受到重视.为了探讨鱼类低温应激压力下的表观遗传学调控机制,本研究对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行短期低温胁迫(18℃处理3 d、5 d和10℃处理3 d、5 d)和长期低温胁迫(18℃处理30 d),然后用具有不同甲基化敏感性的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ对细胞基因组DNA进行酶切以监测细胞基因组DNA甲基化水平变化.结果显示短期低温胁迫下ZF4细胞生长受到抑制甚至死亡,而经过长期低温胁迫的ZF4细胞对低温压力产生了一定适应性.并且低温胁迫下DNA甲基化水平呈现动态变化,短期低温培养细胞的基因组DNA甲基化水平明显增高,但是长期低温培养细胞的DNA甲基化水平反而下降.此外,研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)或者共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)抑制剂KU-55933可以抑制18℃5 d低温处理后的ZF4细胞DNA甲基化水平的增高,说明活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生和ATM的激活介导了DNA甲基化水平的增高.本研究结果显示,短期低温刺激下ZF4细胞ROS的产生导致DNA损伤,激活DNA损伤修复机制,进而导致基因组DNA 甲基化水平上升,该研究为后期斑马鱼低温胁迫分子机制的研究奠定基础.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2019(026)002【总页数】9页(P271-279)【关键词】斑马鱼ZF4细胞;低温应激;ROS;ATM;DNA甲基化【作者】侯艳雯;刘玮;姜蓬垒;张俊芳;韩兵社【作者单位】水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海海洋大学, 上海201306;水产科学国家级实验教学示范中心, 上海海洋大学, 上海 201306;海洋生物科学国际联合研究中心, 中国科学技术部, 上海海洋大学, 上海 201306【正文语种】中文【中图分类】S917DNA甲基化是发生于DNA胞嘧啶第五个碳原子上的一种共价修饰, 作为一种表观遗传标记, DNA甲基化已经被证明与基因组功能、基因转录以及X染色体失活相关[1-2]。
斑马鱼的品种介绍-斑马鱼怎么样？斑马鱼的品种介绍-斑马鱼怎么样？斑马鱼的简介斑马鱼，是一种常见的热带鱼。
斑马鱼性情温和，小巧玲珑，几乎终日在水族箱中不停地游动，易饲养，可与其他品种鱼混养。
饲养水温20～23℃，在水温11～15℃时仍能生存。
斑马鱼体型纤细，孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。
卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。
发育温度要求在25-31℃之间。
斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育。
由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。
鱼胚胎突变体是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型，斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力。
斑马鱼怎么样？斑马鱼体色为银色或金色，覆盖著一些蓝色或紫色的横纹，这些横纹从头部延伸至尾鳍的后端，臀鳍和尾鳍上同样也有这种条纹，背部呈浅橄榄黄。
雄鱼比雌鱼更修长，但略小一些。
体长可达3.8厘米。
有许多人工培养的品种。
华盛顿大学西雅图一直在对斑马鱼进行研究，试图解决人类听力丧失的问题。
和许多其他水生生物一样，斑马鱼在身体表面长有毛细胞。
这些毛细胞的作用是探测水中的振动，其原理与人类内耳中的毛细胞相似。
但是，与人类不同的是，斑马鱼的毛细胞在受损后还可以再生。
研究人员希望他们的工作可以揭开谜底，保护人类的毛细胞免受损伤、并推动毛细胞的再生。
斑马鱼的品种介绍蓝斑马、红斑马、黄斑马、喷点斑马、电光斑马、闪电斑马、豹纹斑马、虹带斑马、火红金线斑马、银河斑马、蓝带斑马、虎纹斑马等。
斑马鱼是研究发育生物学的新兴模式动物。
斑马鱼由于具有饲育容易、胚胎透明、体外受精、突变种多、遗传学工具成熟等诸多优点，已成为研究脊椎动物发育与人类遗传疾病的新兴模式动物。
转基因动物（transgenic animal）是指基因组中整合有外源基因的一类动物，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
嵌合体动物（chimera mosaic animal）是只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物（chimera mosaic animal）。
这类动物只有当外源基因整合入的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代，一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。
转基因动物是指动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，而且随着转基因动物技术的发展，转基因产品将会广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品中。
转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。
鱼类是脊椎动物中最丰富多样性的类群，估计达30000 种。
这种多样性反映在诸如形态、行为、生殖、发育、世代时间和对环境的耐受等各种特征的广泛差异，从而使各种转基因鱼模型的常规制作既是挑战，又是机遇。
有的鱼类的卵是透明的，能直接对发育进行监察，有的情况下对活体内报告基因的表达进行判断。
有些鱼的种类还可能进行其他的遗传操作来诱导单倍体、三倍体和纯合子产雌品系。
尽管鱼的种类很多，但作研究用的却要少的多。
因为野生种群的持续减少，为帮助满足高质量蛋白质需要，水产养殖较常用鱼是鲶鱼、虹鳟鱼、罗非鱼、大西洋鲑和鲤鱼。
收稿日期：2009-09-27录用日期：2009-10-26基金项目：国家科技重大专项资助（No.2008ZX 08526-003）；江苏省省级环保科技项目资助（No.2008005）；江苏省环境监测科研基金项目（No.0809）作者简介：郑新梅（1985—），女，硕士研究生，E -mail:zheng_xinmei@ ；*通讯作者（Corresponding author ），E -mail:hlliu@对硝基酚对大型蚤和斑马鱼胚胎的毒性郑新梅，丁亮，刘红玲*，于红霞南京大学环境学院污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京210093摘要：采用静态生物毒性试验方法，研究了对硝基酚对大型蚤的急性毒性和斑马鱼胚胎发育影响.结果表明，大型蚤幼蚤接触不同浓度的对硝基酚后，活动会受到不同程度的抑制，甚至死亡，48h EC 50值为2.55mg ·L -1.对硝基酚对斑马鱼胚胎有蓄积致毒作用，最敏感性指标为83h 未孵化、83h 卵凝结；实验还发现对硝基酚具有低浓度促进斑马鱼胚胎发育和孵化，高浓度抑制发育并延缓孵化的作用.对硝基酚对大型蚤的毒性与对斑马鱼胚胎的发育影响相比，大型蚤对对硝基酚反应更为敏感.关键词：对硝基酚；大型蚤；斑马鱼胚胎；毒性文章编号：1673-5897（2010）5-692-06中图分类号：R 99，X 592文献标识码：AToxicity of p -Nitrophenol to Daphnia Magna and Zebrafish （Brachydanio rerio ）EmbryoZHENG Xin -mei ，DING Liang ，LIU Hong -ling *，YU Hong -xiaState Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse,School of the Environment,Nanjing University,Nanjing 210093Received 27September 2009accepted 26October 2009Abstract ：The static method of biological toxicity test was used to study the effect of p -nitrophenol on Daphnia magna （D.magna ）and zebrafish embryos.The results of this study demonstrated that p -nitrophenol remarkably restrained the mobility of D.magna neonates,which may cause subsequent death,and the EC 50value was 2.55mg ·L -1at 48h.The results also indicated that p -nitrophenol remarkably retarded the development of zebrafish embryos.It can accumulate in the zebrafish embryos.The most sensitive toxicological endpoints in the development of the embryos were 83h non -incubation and 83h coagulation.A hormetic -like biphasic dose response was found in the effects of p -nitrophenol on embryo development.D.magna was also relatively sensitive to the effects of p -nitrophenol exposure.Keywords ：p -nitrophenol ；daphnia magna ；zebrafish embryos ；toxicity2010年第5卷第5期，692-697生态毒理学报Asian Journal of EcotoxicologyVol .5,2010No .5,692-697郑新梅等：对硝基酚对大型蚤和斑马鱼胚胎的毒性第5期1引言（Introduction）硝基酚类化合物广泛存在于焦化及煤气生产企业排放的废水中，具有排放量大、难降解以及“致癌、致畸、致突变”等特点，是美国环保局所规定的优先控制污染物（Wang et al.,2007），也是我国水体优先控制黑名单中的危险化合物（周文敏等，1991）.对硝基酚（p-nitrophenol,CAS100-02-7）是硝基苯酚中毒性较强的一种，它是一种重要的精细化工中间体，用作农药、医药和染料的生产原料（安家驹，2000）.同时对硝基酚是人体接触硝基苯类同系物后体内产生的主要代谢产物，其本身容易被皮肤和肺吸收，常以螯合物（硝基苯酚葡萄糖醛酸苷）的形式从尿中排出.目前我国对硝基酚钠和对硝基酚的年产量约8~10万吨，排放含酚废水30~40万吨（张蕾和孙秋香，2008）.这些含酚废水的排放是否会对生物产生毒性效应已经引起人们的广泛关注（赵秀娟等，2007）.研究表明，对硝基酚对哺乳动物中枢神经和迷走神经末梢有刺激作用及抑制作用，使机体出现高铁血色素症和呼吸困难（沈标和李顺鹏，1994）.对硝基酚在土壤中较难分解，残留时间较长.能抑制土壤中大多数微生物的生长（Oberemm et al.,1997）.杨丽等（2003）采用Ames试验发现对硝基酚对TA98菌株具有直接致突变性.目前，关于对硝基酚对水生生物的毒性已有一些报道.研究表明对硝基酚对泥鳅（Misgumus anguillicadatus）的24h、48h、72h、96h LC50分别为19.14、17.58、16.98、14.69mg·L-1，并可导致泥鳅鳃小叶细胞脱落、鳃小叶变细（雷忻等，2009）.李娟英等（2010）研究发现对硝基酚对发光菌毒性较强，其对502海水发光细菌的EC50值为23.90mg·L-1.陆光华等（2004）研究发现对硝基酚对水中隆线蚤（Daphnia carinata）的48h LC50为3.98mg·L-1.然而对硝基酚对鱼类的影响目前尚鲜有报道.对硝基酚是一种重要的水体污染物，探讨其对水体不同营养级生物的毒性作用具有重要意义.为此，本文对比研究了对硝基酚对水生食物链中的重要环节———大型蚤的急性毒性及模式生物斑马鱼的早期胚胎发育毒性，以期弥补对硝基酚对大型蚤和鱼类毒性资料的短缺，为制定硝基酚类化合物水质基准，加强其科学管理提供数据支持.2材料与方法（Materials and methods）2.1材料对硝基酚，国产分析纯试剂，无色或淡黄色结晶，纯度为99.5%.首先使用统一配制、充气饱和的标准稀释水（表1）配成160mg·L-1储备液备用.正式实验前使用HPLC测定不同时间各实验组对硝基酚的浓度，发现在染毒期间对硝基酚浓度均未发生明显改变，稳定性良好，适合做静态染毒实验.表1稀释水成分含量Table1Amount of components of diluted water物种含量/（mg·L-1）pH硬度MgSO4·7H2O CaCl2·2H2O KCl NaHCO3斑马鱼胚胎24.6558.8 1.1512.58.028~32°dH 大型蚤1232.5294062.5647.57.8±0.2150~300mg·L-1（CaCO3计）2.2实验生物大型蚤（Daphnia magna）由中科院生态环境研究中心提供，为实验室条件下培养3代以上的单克隆品系.培养在曝气24h以上的自来水中，温度（24±1）℃，每天添加一定浓度纯种斜生栅藻.试验前1天挑粗怀卵的大型蚤放入已配好的稀释水（表1）中.待母蚤产出足够幼蚤后，取24h内游动活泼的幼蚤待用.斑马鱼（Brachydanio rerio）购于南京大学模式生物研究中心，为正规饲养5月龄的成年斑马鱼，实验室驯化1个月以上.饲养于充分曝气1天以上的自来水中（雌雄比1:1），水温（26±1）℃、光照/黑暗周期比14:10，照度1000lx.每日喂食两次经紫外消毒处理过的冷冻赤虫.根据Schulte和Nagel 的方法（Schulte and Nagel,1994）收集受精卵，并迅速用统一配制、充氧饱和、温度为（26±1）℃、恒定组分的稀释水（表1）清洗鱼卵以除去残留物，在体视镜（ZOOM-550C）下挑选出分裂正常的受精卵，进行毒性试验.693生态毒理学报第5卷2.3实验方法实验时各自使用标准稀释水将对硝基酚储备液稀释到所需要的实验浓度.大型蚤稀释水依照《水质物质对蚤类（大型蚤）急性毒性测定方法》（GB/T132662-91）（国家环境保护局，1991a）配制；斑马鱼胚胎重组水成分参照《水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法》（GB/T132667-91）（国家环境保护局，1991b），含量加倍.两种生物培养水的成分含量见表1.根据预实验结果，大型蚤与斑马鱼胚胎均设置相同的6个浓度梯度组，分别为0、1、2、4、8、16mg·L-1.2.3.1大型蚤急性毒性试验用盐酸将各浓度组的pH调至6.0左右.在每个100mL烧杯中放入15只大型蚤幼蚤进行试验，观察并记录48h后大型蚤的受抑制个数，以玻棒轻触后不运动为实验终点，仅触角运动视为受抑制.实验中对照组的大型蚤不活动个数少于10%，不得有死亡，最后根据美国环境保护局规定的TSK （trimmed spearman-karber method）程序计算48h EC50.2.3.2斑马鱼胚胎生命早期发育毒性实验根据OECD指导（OECD,1993）设计胚胎试验，3次平行.使用24孔细胞培养板染毒，每孔容积为3mL，加入2mL溶液后，放入一枚受精卵.每张板为同一浓度组，其中20孔为同一浓度，另外4孔为组内空白对照.另单独设置一个空白对照板用于组间对照.为防止溶液中各组分浓度变化，将24孔板以保鲜膜覆盖后放在（26±1）℃恒温光照培养箱中培养.受精后马上开始暴露试验即卵裂期0hpf （hours past fertilization）开始染毒直至83h孵化完成，由于污染物作用时间段不同，作用的靶器官也不相同，故增加了6hpf（原肠胚期）、24hpf（心跳、血液循环发育期即成形期）染毒，目的是找出特定毒作用阶段.胚胎染毒后，在体视镜下观察记录83h 内所能出现的各个毒理学终点的情况（朱琳等，2003），实验结束后，将各浓度组孵化出的无异常的小鱼转移到正常胚胎培养水中培养直至由于营养缺乏而自然死亡，观察较长期的影响.采用SPSS15.0软件，通过浓度对数-概率单位法计算EC50和LC50等毒性数据.3结果与分析（Results and analysis）3.1对硝基酚对大型蚤的急性毒性效应大型蚤幼蚤接触不同浓度的对硝基酚后，活动会受到抑制，甚至死亡.大型蚤染毒后出现游动缓慢、外壳膨胀发白、大触角及纲毛的摆动变慢的现象，最后失去游动能力，沉入底部.数据分析表明，大型蚤抑制率与对硝基酚浓度存在明显的剂量-效应关系，48h实验周期内大型蚤抑制率与对硝基酚浓度对数的关系如图1所示.利用TSK程序计算得对硝基酚对大型蚤幼蚤的48h EC50为2.55mg·L-1，95%置信区间为1.81~3.59mg·L-1.按照蚤类急性活动抑制毒性分级标准（国家环保局水和废水监测分析方法编委会，2002），对硝基酚属中等毒性化合物.3.2对硝基酚对斑马鱼胚胎的发育毒性效应表2给出了斑马鱼胚胎受精0hpf（卵裂期）、6hpf（原肠胚期）和24hpf（心跳、血液循环发育期即成形期）后，开始染毒得到的明显的毒理学数据. 3.2.10hpf对硝基酚暴露实验0hpf暴露结果显示，83h未孵出指标（EC50= 2.10mg·L-1）敏感性最高，83h凝结（EC50=2.86mg·L-1）、24h眼点发育（EC50=3.31mg·L-1）、24h尾部不延展（EC50=3.08mg·L-1）等指标的敏感性也较高（表2）.0hpf染毒对硝基酚对斑马鱼胚胎发育的8h外包阶段有显著影响，说明对硝基酚对胚胎早图1大型蚤抑制率与对硝基酚浓度的关系（对硝基酚浓度单位：mg·L-1）Fig.1Relationship between inhibition rate of Daphnia magna and p-nitrophenol concentration（Unit of p-nitrophenol:mg·L-1）◆◆◆◆120100806040200◆◆抑制率Inhibitionrate/%y=0.8305x+0.1167R2=0.937500.20.40.60.81 1.2 1.4对硝基酚浓度对数Logarithm of p-nitrophenol concentration694郑新梅等：对硝基酚对大型蚤和斑马鱼胚胎的毒性第5期期发育影响比较大.0hpf 暴露实验中，不同时刻胚胎发育状况与对硝基酚暴露浓度的关系如图2~图5所示.胚胎染毒4h 内，对硝基酚对胚胎囊胚期影响较小，并未发现明显毒作用.8h ~12h 内（图2），浓度低于8mg ·L -1的实验组出现凝结、未外包的情况，16mg ·L -1组虽未出现凝结，但未外包个数从8h 时的95%（原肠作用未开始的EC 50=7.35mg ·L -1）达到12h 时的100%停止发育（12h 停止发育EC 50=6.66mg ·L -1）.随时间延长，8mg ·L -1组到达24h 时出现异常也达到了100%，可见对硝基酚并不是对胚胎直接致死而是存在体内蓄积作用.图3中低浓度时在依然成活的胚胎中未观察到24h 眼点未发育和尾部未延展两指标，而4~16mg ·L -1毒作用则非常明显.当到达48h 时（图4）高浓度组卵凝结数目剧增，这可能是对硝基酚在体内累积到达一定程度的结果.到染毒结束（图5），8mg ·L -1与16mg ·L -1两浓度组胚胎全部死亡，0~4mg ·L -1范围内孵化延迟指标出现明显增大趋势.可见除影响凝结和孵化以外，较低浓度对硝基酚还造成孵化延迟.实验中出现了一个比较特殊的现象，即在高浓度组从12h 便开始陆续大量出现停止发育的胚胎，这些胚胎几乎无生命特征但却尚需一段时间发生卵凝结，如图4中，8mg ·L -1、16mg ·L -1两组浓度下，停止发育的胚胎数目远大于凝结数，这些特征的胚胎早已达到一级致死标准.为更好地说明毒性作用，有文献将斑马鱼胚胎的半数致死浓度LC 50作为一个重要的评价指标（叶露，2008），因此本研究也分别计算了0hpf 暴露实验中24h 和48h 的LC 50（以该时刻达到一类致死指标的所有胚胎数目计），结果为24h LC 50=5.92mg ·L -1，48h LC 50=4.92mg ·L -1，与实验中大型蚤的48h EC 50比较发现，大型蚤较斑马鱼胚胎对对硝基酚可能更敏感.表2对硝基酚对斑马鱼胚胎的发育毒性Table 2Development toxicity of p -nitrophenol to zebrafishembryos染毒方式毒理终点染毒时间/h EC 50（LC 50）/（mgL -1）95%置信区间/（mgL -1）0hpf 染毒原肠作用未开始87.35 4.35~20.16停止发育12 6.66 4.10~15.10尾部不延展24 3.08 2.26~4.15LC 5024 5.92 4.90~7.16眼点未发育24 3.31 2.38~4.57凝结4810.04 4.16~15.12未孵化834.953.98~6.29LC 50484.92 4.32~5.62凝结83 2.86 2.10~3.83未孵出83 2.10 1.52~2.746hpf 染毒停止发育1211.8410.65~13.17眼点不发育24 4.24 3.17~5.84凝结48 6.93 4.55~13.26黑素细胞不发育48 3.52 2.67~4.69凝结83 3.27 2.44~4.40未孵化83 3.70 3.07~4.4824hpf 染毒黑素细胞不发育489.047.83~11.19凝结83 5.19 4.27~6.43图28h 胚胎发育情况（0hpf 暴露实验）Fig.2The embryonic development after 8h exposure（0hpf exposure experiment ）100%80%60%40%20%0%百分比P e r c e n t a g e /%124816对硝基酚浓度p -nitrophenol concentration/（mg ·L -1）未外包且未凝结卵凝结正常图324h 胚胎发育情况（0hpf 暴露实验）Fig.3The embryonic development after 24h exposure（0hpf exposure experiment ）百分比P e r c e n t a g e /%正常对硝基酚浓度p -nitrophenol concentration/（mg ·L -1）695生态毒理学报第5卷图583h 胚胎发育情况（0hpf 暴露实验）Fig.5The embryonic development after 83h exposure（0hpf exposure experiment ）图448h 胚胎发育情况（0hpf 暴露实验）Fig.4The embryonic development after 48h exposure（0hpf exposure experiment ）3.2.26hpf 、24hpf 对硝基酚暴露实验为进一步找出对硝基酚的致毒机制，增加了相同浓度组的6hpf （即原肠胚期）和24hpf （心跳、血液循环发育期即成形期）染毒实验.由表2可见，各对应指标的EC 50值大小排序为24hpf >6hpf >0hpf ，指标敏感性排序83h 未孵化>83h 凝结>48h 黑素细胞不发育>24h 眼点、尾未延展等.这些结果说明随着实际暴露时间的增加，化合物的毒性会逐渐增大.综合上述不同发育期染毒方式，说明对硝基酚在斑马鱼胚胎体内存在生物蓄积作用.对于6hpf 暴露试验，8h 外包活动影响的半抑制效应浓度是2h 后测定的，这和已经暴露了8h 的0hpf 染毒暴露试验相差不大，这说明对硝基酚对斑马鱼胚胎原肠胚发育的影响不受化合物积累量的影响，而且这一发育阶段对该化合物较敏感，这可能与相关文献中提到的3,3′-二甲基联苯胺的致毒机制类似（刘红玲等，2007）.实验还发现，无论是0hpf 还是6hpf 染毒，对硝基酚对斑马鱼胚胎发育的影响均表现为低浓度促进高浓度抑制，浓度1、2、4mg ·L -1的胚胎发育速度明显较对照组快，76h 即已经基本孵化，而浓度8mg ·L -1和16mg ·L -1的胚胎则表现为发育缓慢且在12~24h 内卵凝结或停止发育.实验结束后，将各浓度组孵化出的无异常的小鱼转移到正常胚胎培养水中培养直至由于营养缺乏而自然死亡，在此约10天时间内，各浓度组孵化出的小鱼与对照组相比没有太大可观差异.因此可以推测对硝基酚对斑马鱼的影响主要集中在早期胚胎阶段.通讯作者简介：刘红玲，南京大学毕业并获得博士学位，2007年9月留校任教.主要从事有机污染物的生物积累与代谢，以及生物个体水平、生化水平和细胞水平的毒理学效应等方面的研究，已发表论文20余篇.ReferencesEditorial Committee of Methods for Monitor and Analysis ofWater and Wstewater of Ministry of Environmental Protection of the People ’s Republic of China.2002.Methods for Monitor and Analysis of Water and Wastewater ［M ］.Beijing :China Environmental Science Press （in Chinese ）Lei X,Li Z Q,Lian Z M,Yan Z L,Bai C Y.2009.Acute toxicity effects of bisphenol A and p -nitrophenol to Misgurnus anguillicadatus ［J ］.Chinese Journal of Ecotology ,28（11）:2257-2261（in Chinese ）Li J Y,Gao F,Chen J,Hua Y,Peng Z R,Wang J.2010.Inhibition of phenol and its derivatives on dehydrogenase activity and luminescent bacteria biotoxicity ［J ］.Journal of Shanghai Ocean University,19（1）:111-115（in Chinese ）Liu H L,Yu H X,Jiang W,Wang X R,Shi S J,Zhu L.2007.Preliminary study on zebrafish embryo -toxicity of benzidine congeners ［J ］.Asian Journal of Ecotoxicology,2（1）:94-99（in Chinese ）Lu G H,Jin Q B,Wang C.2004.Quantitative structure -toxicity relationship for acute toxicity of nitrobenzenes to Daphnia carinata ［J ］.Journal of Hohai University （Natural Sciences ）,32（4）:372-375（in Chinese ）Ministry of Environmental Protection of the People ’s Republic of China.1991a.Waterquality -Determination of the Acute Toxiclty of Substance to Daphnia （Daphnia magna straus ）［J ］.Beijing:Standards Press of China （in Chinese ）Ministry of Environmental Protection of the People ’s Republic of China.1991b.Waterquality -Determination of the Acute Toxiclty of Substance to Zebrafish （Brachydanio rerio ）［J ］.Beijing:120%100%80%60%40%20%0%百分比P e r c e n t a g e /%0124816对硝基酚浓度p -nitrophenol concentration/（mg ·L -1）正常卵凝结停止发育100%80%60%40%20%0%百分比P e r c e n t a g e /%124816卵凝结孵化延迟孵化率对硝基酚浓度p -nitrophenol concentration/（mg ·L -1）696郑新梅等：对硝基酚对大型蚤和斑马鱼胚胎的毒性第5期Standards Press of China（in Chinese）Oberemm A,Fastner J,Steinberg C E W.1997.Effects of microcystin-LR and cyanobacterial crude extracts on embryo-larval development of zebrafish（Danio rerio）［J］.Water Research,31（11）:2918-2921OECD.1993.OECD Guideline for the Testing of Chemicals ［M］.OECDSchulte C,Nagel R.1994.Testing acute toxicity in the embryo of zebrafish,Brachydanio rerio as an alternative to the acute fish test-preliminary results［J］.Alternatives to Laboratory Animals, 22:12-19Wang J,Chen S,Quan X,Zhao H,Zhao Y.2007.Enhanced photodegradation of PNP on soil surface under UV irradiation with TiO2［J］.Soil Sediment Contamination,16（4）:413-421Yang L,Xu J B,Liu Z T.2003.Study on the mutagenicity of phenolic compounds by the Ames test［J］.Journal of Northeast Normal University（Natural Sciences Edition）,35（1）:83-85（in Chinese）Zhang L,Sun Q X.2008.The application of the macroreticular polymeric adsorbent resin to treat waste water containing high concentration organic chemicals［J］.Journal of Hubei University of Education,25（8）:51-54（in Chinese）Zhou W M,Fu D Q,Sun Z G.1991.Determination of black list of China s priority pollutants in water［J］.Research of Environmental Sciences,4（6）:9-12（in Chinese）Zhu L,Shi S J,Tong Y J.2003.Application of the teratogenic effects of Embryo development in zebrafish to the determination of toxicity of environmental pollutants［J］.Journal of Environment and Health,20（2）:122-124（in Chinese）中文参考文献安家驹.2000.实用精细化工辞典（第二版）［M］.北京:中国轻工业出版社国家环保局水和废水监测分析方法编委会.2002.水和废水监测分析方法［M］.北京:中国环境科学出版社国家环境保护局.1991a.GB/T132662-91水质物质对蚤类（大型蚤）急性毒性测定方法［S］.北京:中国标准出版社国家环境保护局.1991b.GB/T132667-91水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法［S］.北京:中国标准出版社雷忻,李宗强,廉振民,延志莲,白重炎.2009.双酚A和对硝基酚对泥鳅的急性毒性效应［J］.生态学杂志,28（11）:2257-2261李娟英,高峰,陈洁,华寅,彭自然,王静.2010.酚类化合物对发光细菌的急性毒性和对ETS的抑制研究［J］.上海海洋大学学报,19（1）:111-115刘红玲,于红霞,姜威,王晓蓉,史淑洁,朱琳.2007.联苯胺类化合物对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究［J］.生态毒理学报,2（1）:94-99陆光华,金琼贝,王超.2004.硝基苯类化合物对隆线蚤急性毒性的构效关系［J］.河海大学学报,32（4）:372-375沈标,李顺鹏.1994.几种化合物的生物毒性和致突变性［M］.北京:中国农业科技出版社,294-296杨丽,徐镜波,刘征涛.2003.苯酚类化合物致突变Ames试验研究［J］.东北师大学报,35（1）:83-85叶露.2008.典型全氟化合物水生毒理学效应与致毒机理初探［D］.上海：同济大学张蕾,孙秋香.2008.大孔树脂在高浓度有机废水处理中的应用［J］.湖北第二师范学院学报,25（8）:51-54赵秀娟,赵艳,张宇秋,张宇,吴坤.2007.尿样中对硝基酚高效液相色谱荧光测定［J］.中国公共卫生,23（12）:1459-1460周文敏,傅德黔,孙宗光.1991.中国水中优先控制污染物黑名单的确定［J］.环境科学研究,4（6）:9-12朱琳,史淑洁,佟玉洁.2003.应用斑马鱼胚胎致畸效应检测环境污染物毒性［J］.环境与健康,20（2）:122-124◆697。
《河北渔业｝｝２０１１年第６期（总第２１０期） ｏ苗种繁育 ｄｏｉ：１ ０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１ ００４—６７５５．２０ １１．０６．０１ ６ 二甲基联苯胺对斑马鱼早期胚胎发育的表观影响★ 陈文利 ，李培英 ，杨丽莉 ，高丽蕙 ，王 彤 ，陈昌生 ，安瑞永 （１．石家庄市职业病防治院，ｆ￣４１：石家庄０５００３１；２．河北师范大学，ｆ￣４１；石家庄０５００１６）
摘 要：研究了３，３’一二甲基联苯胺对斑马鱼早期胚胎发育的表观毒性影响。试验证明４．３２ ｍｇ／Ｌ以上高 浓度的二甲基联苯胺都能导致斑马鱼受精卵发生卵黄凝聚，使胚胎发育终止而死亡。低浓度下２．１６ ｍｇ／Ｌ 的二甲基联苯胺对斑马鱼受精卵的发育有一定的毒害作用，但有近一半的胚胎存活，这可能是影响其胚胎发 育成活的一个临界浓度；还发现低浓度（２．１６ ｒａｇ／Ｌ）的二甲基联苯胺对斑马鱼的胚胎发育有一定的加速作 用，但共机理还有待进一步研究。 关键词：３，３ 一二甲基联苯胺；斑马鱼；胚胎发育；表观
０ 引言 联苯胺类化合物在化工合成中有着广泛应 用，是树脂、橡胶、染料等产品的生产原料或中间 体，易溶于乙醇、苯及乙醚等有机物，毒性较大。 它可以通过生产过程的泄漏、工业废水的排放及 印染织物的漂洗等多种途径进入外界水环境，危 害鱼、虾等水生生物，再间接地危害人类的健康。 联苯胺类化合物对哺乳动物的毒性作用已经有了 较多研究，主要集中在联苯胺对哺乳动物代谢和 细胞方面的影响［１］，其对哺乳动物或人类具有致 癌或潜在的致癌作用［２］。关于联苯胺类化合物对 水生生物的毒性研究目前还比较少，朱琳、史淑洁 等曾经报道了斑马鱼胚胎发育技术在毒性评价中 的应用０］，端正花、张斌田等还初步研究了联苯胺 类化合物对鱼类胚胎发育的毒性作用Ｌ４］。 斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）分类上属于鲤科的短 担尼鱼属，俗称蓝条鱼、斑马担尼鱼等，是原产于 印度、孟加拉国等水域的一种小型热带鱼。由于 其个体小，身体透明，产卵多，体外受精，胚胎发育 快，易于观察和饲养简便等优点，很快成为了发育 生物学、遗传学、环境毒理学、免疫学等学科的模 式生物［５］。０ＥＣＤ在１９９６年将斑马鱼胚胎发育 方法列入测定单一化学品毒性的标准方法之一， 并制定了详细的操作指南 ］。斑马鱼也因此成为 仅次于小鼠的脊椎动物模式动物。国内的柳爱 莲、曹更生等早在２００４年开展了斑马鱼早期胚胎 发育的形态学观察 ］，为其用于毒性反应研究莫 定了基础生物学资料。 本研究以斑马鱼新产的受精卵为试验材料， 利用生物显微拍照技术直接观察和研究不同浓度 的３，３’＿二甲基联苯胺对鱼卵早期胚胎发育外观 形态变化的影响，以补充和完善联苯胺类化合物 对鱼类及其他水生生物毒性影响的基础资料，并 为联苯胺类化合物的残留在环境卫生标准和职业 卫生标准方面的制定提供科学依据。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 二甲基联苯胺（３，３ 二甲基联苯胺） 由 石家庄市职业病防治院提供。分析纯，性能稳定， 在水溶液内基本不发生水解、氧化、光解等反应， 符合水生毒理学试验要求。按照ＯＥＣＤ的要求 设计胚胎毒性试验 ］，受试化合物用甲醇贮备液 和蒸馏水配制成水溶液，甲醇含量低于０．３ 。 设空白对照和甲醇溶剂对照各一个，３，３’＿二甲基 联苯胺的毒性试验浓度分为２．１６、４．３２、６．４８、 ８．６４、１０．６８ ｍｇ／Ｌ ５个，分别选用２Ｏ ｍＬ的磨口 瓶避光贮存。 ２．１．２试验用鱼及其受精卵的采集 斑马鱼为 ６月龄以上，体长４ ｃｍ左右的红色品种亲鱼。按 照雌雄鱼数量约为１：１的比例放养在２５ ｃｍ×２５
环境对斑马鱼胚胎发育的干扰
XXX,YYY,ZZZ
一、实验目的及原理：
1、通过斑马鱼早期发育过程的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识。
2、通过设置环境因子（锌离子）来研究其对斑马鱼胚胎发育的影响程度。
3、通过对比对照组和实验组，进一步巩固对硬骨鱼胚胎发育模式的认识。
4、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力。
5、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解。
二、实验材料与方法：
1、实验材料：
所需胚胎：发育良好的、健康的斑马鱼胚胎（原肠胚早期）36枚。
试剂：硫酸锌（分析纯），
器材：培养容器12孔板，恒温培养箱，显微镜，解剖镜，载玻片，塑料滴管，手表，移液枪100uL、1000uL，量筒100mL*2。
2、实验方法：
（1）在本实验中，使用硫酸锌作为实验用环境因子，共设三个梯度，分别为：0，0.1mg/L，1mg/L。
每个梯度设4个平行组，每个平行组3个胚胎，共需36个胚胎。
（2）实验处理起始时间：原肠胚早期：
实验处理终止时间：孵化期。
（3）实验操作：
A.挑选胚胎：
由于斑马鱼卵受精及发育的不均匀性，要对斑马鱼卵进行挑选。
挑选时要挑透明、无白色斑点、卵膜完整的。
之后的实验中还要不断将败育卵挑出。
用滴管（塑料滴管口部要剪短且一定要圆滑，并且直径要大于卵径）将选择好的卵依次吸出，然后放入12孔板中进行孵化。
【注意剔除异物眼观有白色小斑点、畸形异常卵。
】
B.实验体系：
12孔板培养胚胎，每孔放入3个胚胎，共使用12个孔，36个胚胎。
12个孔分别标上A1~A4,B1~B4,C1~C4。
A1~A4组作为对照组的三个平行组，B1~B4作为0.1mg/L组的三个平行组，C1~C4作为1mg/L组的三个平行组。
C.实验期间的培养管理：
1．孵化用水：
孵化水温一般要25~28℃，在这个温度范围内，温度越低，孵化所需时间相应越长。
水温25℃时，受精卵经48~72h孵出仔鱼，水温28℃时，经36h孵出仔鱼。
水温太高或太低，会造成受精卵死亡。
[2]
【实验中设定的培养温度为25℃，由于恒温培养箱的示数与实际温度有较大差异，而且在实验后期（80h）提高培养箱温度以加速孵化，所以本次实验实际中的温度并不恒定，暂以25℃为准。
】
2.孵卵卫生：
（1）定期观察，每12h换一次水，水温要相近，而且每次换水量在原水量的1/3-1/2,以尽量使胚胎缩短适应期，使发育流畅。
定期将死卵挑出，以确保不影响其他卵的正常发育。
3、观察记录：
（1）前3h实时观察、拍照并记录，之后每天早上(7:00-9:00)、中午(12:30-14:30)、晚上(18:00-21:00)三段时间对斑马鱼胚胎发育不同时期以及畸变进行观察、拍照并记录。
（2）实验指标:实验前，根据文献查询[3]，Zn2+可能导致的畸变有：
原肠胚期：胚胎可能因外包功能缺失而妨碍前后体轴的形成，导致卵黄外突和原肠外凸。
分裂期：胚胎可能发生严重的发育阻滞和神经管缺损，后者表现为尾部畸变，从而影响早期器官的形成。
成型期和孵化期：可导致心肌肿大、心率不稳、后主静脉血流缓慢或停止、神经管缺损、脊椎和尾部弯曲、色素沉积减少等。
（3）实验照片及记录：
A、对照组与实验组发育过程比较：
1、原肠期：由于实验照片不足，不能作出有价值的分析。
故省去。
下图依次是原肠早期、原肠晚期：摄于23-20：00
2、体节期：如下，各组间在相近时间内体节期胚胎的发育图比较。
A组：摄于24-10：35
B组：摄于24-10：10
C组：摄于24-10：22
3、咽期：各组间在相近时间内咽期胚胎的发育图比较。
A组：25-18：04
B组：25-18：15
C组：25-18：32
4、孵化期：各组间在相近时间内孵化期胚胎的发育图比较。
A组：摄于26-19：50
B组：摄于26-19：20
C组：摄于26-19：15
B、设计梯度和对照组，并各设平行试验3次。
（吸收[1]的图表模式）
4、计算及数据分析：
使用的数据处理方法：用直线内插法作图，使用软件测定不同浓度锌离子与对应斑马鱼胚胎发育影响程度的显著性概率，从而得出锌离子对斑马鱼早期胚胎发育的干扰的相关程度。
使用的处理软件：Excel软件。
三、实验结果：
（一）用硫酸锌做环境因子，在25℃的培养条件下：
对照组：
斑马鱼胚胎平均经过84.21h孵化出来。
实验组：
0.1mg/L的处理下，斑马鱼胚胎平均经过82.83h孵化出来；
1mg/L的处理下，斑马鱼胚胎平均经过82.19h孵化出来。
（二）对照组孵化率为100%，实验一组孵化率为91.7%，实验二组孵化率为83.3%。
（三）三个组均无明显的畸形胚胎产生。
（四）实验中各阶段胚胎的图片所示：
四、分析与讨论：
（一）对实验结果进行分析讨论，并阐述其中的原理。
1、本次实验中，斑马鱼胚胎发育的速度明显较相应的文献值慢。
分析：文献中，在25℃条件下，斑马鱼胚胎从受精卵到孵化出大约需要72h,而本实验平均孵化时间约83.1h，比文献值慢不少。
本实验中斑马鱼胚胎要不时的取出观察、拍照，而室温比恒温培养箱中的低，故较长时间的取出观察，使平均培养温度降低，这可能是本实验胚胎发育偏慢的一个原因；经过证实，实验用的恒温培养箱箱内实际温度比其示数明显要低，故实验设定的25℃培养条件就不准确了。
其他组的培养箱温度与示数较为一致，明显可感觉出温度比本实验所用的培养箱的温度高，而且这些组的斑马鱼与文献值较接近，比本实验组早孵化大约一天。
基本上可以说明本实验组培养温度偏低是导致斑马鱼发育较慢的主要原因。
2、在本次实验中，斑马鱼胚胎并没有明显的畸形产生，与文献中锌离子
的致畸作用不一致。
分析：文献中证明锌离子在浓度为20-30mg/L时，对斑马鱼的致畸作用较为明显，而实验中因为操作及器材等原因，只设置了对照、0.1mg/L 和10mg/L三个浓度梯度，而且浓度在较低水平，故而锌离子浓度偏低可能是实验胚胎无畸形出现的主要原因。
3、通过实验图片可以发现，在相同的时间点，实验组有较明显的发育较快
现象（见实验照片和记录：体节期、咽期）。
分析：通过实验图片的观察，我们可以较为清楚的发现在体节期、咽期阶段，锌离子浓度越高，胚胎发育越快。
与文献相结合可以推测：在较
低浓度条件下，锌离子有利于促进斑马鱼胚胎发育，在较高浓度条件下，锌离子会导致畸形。
4、对照组和实验一组、实验二组中三个组中死亡卵的个数依次为0、1、2。
实验数据呈线性关系，虽然可以说是随锌离子浓度的提高，卵的死亡率升高，但是死亡卵的个数较少，而且三个死卵都是在第二天死亡的，后两天均没有卵死亡，很可能是挑卵原因或者是随机原因，不太具有可信度，故不再用软件作图。
（二）实验系统缺陷分析：
本实验系统有一个缺陷，因为每组的斑马鱼数有限，而且要最终统计孵化率及孵化各个时期的斑马鱼形态变化，所以实验中不能人为地处理斑马鱼胚胎，尤其不能人为地致胚胎死亡。
除了在孵化期，其余各个个发育阶段，斑马鱼都是在卵膜以内，胚体弯曲，不能准确地观察、测定胚胎形态特征及变化，尤其是尾部的形态特征不能准确的观察。
各种实验文献中对斑马鱼胚胎的观察，基本上都是限定在某一发育阶段，因此在处理时都是将卵膜挑破，使胚胎舒展开再进行观察。
这样观察既准确又清晰、方便。
由于以上缺陷存在，故建议改进实验。
五、参考文献：
[1]陈桑，李朝红等斑马鱼实验室繁育系统的建立1672-3554
[2]陈宝增，李凤超等实验室斑马鱼的繁育与养殖技术071002
[3]周玉，杨振国等神仙鱼胚胎和仔鱼发育的初步观察130062
[4]谢恩义，何学福瓣结鱼的胚胎发育630715
[5]丁海，李荣庆梭鲈胚胎发育及仔鱼前期发育的初步观察100075
[6]任波，任幕莲等扁吻鱼胚胎及仔鱼发育的形态学观察150070；
830000；843000
[7]王彦怀，陶秉春等金头鲷胚胎发育的初步观察300221；300384；
300452
[8]叶露，吴玲玲等PFOS/PFOA对斑马鱼胚胎致毒效应研究
200092
[9]江景田，李秋等磁化水对家鱼胚胎发育的影响118000
[10]刘金兰，龚望宝等孵化水体pH值对异育银鲫胚胎发育的影响
434025
[11]谢仰杰，孙帼英等河川沙塘的胚胎和胚后发育以及温度对胚胎发育
的影响361021；200062
[12]易薇，梁姝等乐果对中华大蟾蜍受精及胚胎发育的影响100875
[13]端正花，张斌田等双酚A对斑马鱼胚胎发育阶段的毒性及生物蓄
积300071
[14]郑敏，朱琳五氯酚对斑马鱼胚胎的毒性效应研究300071
[15]戈志强，秦伟等重金属离子Pb2+、Cu2+、Cd2+对大银鱼胚胎发育与
仔鱼存活的影响215006。
