(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol

模式动物斑马鱼斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。

斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。

可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。

斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。

雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。

胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。

受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。

一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。

目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。

AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。

Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。

WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。

此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。

这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。

二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。

ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。

射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。

斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。

二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。

在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。

斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。

最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。

为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。

斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。

2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。

3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。

4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。

5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。

6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。

因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。

三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。

曝气水10L。

性成熟雌、雄性斑马鱼。

四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。

2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。

3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。

选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。

斑马鱼动物模型的应用斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。

斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。

可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。

斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。

雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。

胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。

受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。

一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。

目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。

AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。

Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。

WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。

此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。

这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。

二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。

ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。

射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。

斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。

自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。

Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。

ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。

同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。

2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。

第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。

)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。

5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。

斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制研究斑马鱼是一种高度透明、易于研究的水生生物，因此成为了研究生物学的理想模型。

在斑马鱼的胚胎发育过程中，基因调控机制扮演着关键的角色，控制着发育的每个阶段。

本文将介绍斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制的研究现状和研究进展。

一、基因调控网络的建立要研究斑马鱼胚胎发育过程的基因调控网络，首先需要识别和鉴定参与发育调控的关键基因。

通过全基因组筛选和高通量测序技术，科研人员可以在斑马鱼中鉴定出数千个关键基因并建立基因调控网络。

实例研究：一项研究使用了大规模chIP（染色质免疫共沉淀）测序技术，在斑马鱼胚胎中鉴定了数千个与基因转录调控相关的转录因子和DNA结合蛋白基因。

这项研究为构建斑马鱼基因调控网络提供了基础数据。

二、基因表达调控机制的研究与其他多细胞生物一样，斑马鱼的基因表达调控机制包括转录后修饰、microRNA调控等多种方式。

这些调控机制之间相互交织、紧密联系，共同控制着斑马鱼胚胎发育过程。

实例研究：基因表达调控机制的研究需要集成多种技术手段，如RNA测序、原位杂交、Western blot等。

一项研究通过整合这些技术手段，发现成纱突即成胆突转化过程中，转录因子sox32通过调控mir-21基因的表达，促进了细胞转化的过程。

三、非编码RNA调控机制的研究非编码RNA（non-coding RNA）是指不具有编码蛋白的RNA分子，包括有机体内丰富的microRNA、small interfering RNA等。

在斑马鱼胚胎发育过程中，非编码RNA发挥着重要的调控作用，参与调控基因表达、细胞分化等过程。

实例研究：研究人员使用转录组测序技术，发现在斑马鱼的转变腹盘（metamorphic olfactory placode）转化过程中，miR-130b的表达量显著上调。

miR-130b通过抑制蛋白质转录调节因子Dlx3b的表达，从而协调着细胞转化过程。

四、基因表达时序调控机制的研究在斑马鱼胚胎发育过程中，基因表达的时序也是关键的。

斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。

在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。

因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。

操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。

实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。

(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。

避免漏加溶液。

(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。

一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。

(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。

吸时动作要轻。

任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。

(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。

第一天以下操作需戴乳胶手套。

1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。

1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。

梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。

稀释时间宁长勿短。

特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。

1.2 PBST处理5分钟，两次。

2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。

模式动物斑马鱼斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。

斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。

可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。

斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。

雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。

胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。

受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。

一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。

目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。

AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。

Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。

WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。

此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。

这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。

二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。

ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。

射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。

斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。

自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。

Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。

ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。

同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。

2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。

第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

整体原位杂交（WISH）（此实验需要全程在摇床上进行）1）胚胎准备，需确定胚胎地具体时间。

2）固定：将收取胚胎用4％PFA室温固定2h（或者4℃过夜）3）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次4）分别用50％、100％甲醇溶液胚胎脱水，各1次，5min/次5）更换新鲜100％甲醇，并将胚胎储存在－20℃固定2小时(或过夜)6）复水：分别用甲醇：PBST为3：1，1：1，1：3溶液漂洗胚胎，各1次，5min/次7）用PBST漂洗胚胎2次，5min/次。

8）增加胚胎的通透性：proteinase K（10μg/ml，用PBST稀释）处理胚胎，24hpf胚胎5min，胚胎8min，3dpf胚胎15min，5dpf胚胎27min。

处理过后用，PBST漂洗，然后4％后固定，室温30-40min。

9）用PBST漂洗胚胎2次，5 min/次，同时HB 60℃预热10）预杂交：吸除PBST，加入HB，60℃，5min；更换新鲜HB溶液，60℃，3-4小时，68℃ 10分钟。

11）加探针：取出探针，取出迅速置于冰上；回收HB溶液，加入探针，60℃，过夜12）回收探针（可以重复使用3-5次），储存在－20℃，将50％甲酰胺/2×SSCT及0.2×SSCT 68℃预热，漂洗2次，20min/次13）分别用2×SSCT和0.2×SSCT溶液在68℃漂洗胚胎，各2次，20min/次14）PBST漂洗胚胎，2次，5min/次。

15）封闭：现配2％羊羔血清（PBST稀释）用做封闭，室温至少1h16）抗体：用2％羊羔血清稀释抗体（anti-dig-AP），1：5000，4℃，过夜（或1：2000,RT,2h）17）回收抗体（可以重复3次），用PBST室温下漂洗胚胎，2次，10min/次18）用buffer9.5T溶液孵育胚胎，2次，10min/次，目的是提供碱性条件19）加入NBT/BCIP染液，染色适当时间（20-60min），待信号显现，加PBST终止反应，3次，10min/次20）用4％PFA固定胚胎，室温固定1h后，PBST漂洗2次，10min/次21）将胚胎储存在70％甘油中，4℃保存，备用。

原位杂交固定收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。

或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)一. 原位杂交第一天1. 重新水化和固定1）吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。

2）置换成30％甲醇的PBST溶液，放置5分钟3）置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次4）置换成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）1）用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。

5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。

发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2）用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

3）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

4）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的HYB＋取代HYB－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交1）吸去预杂交的HYB＋，加上100ul已加入探针的HYB＋溶液（探针浓度约为1ng/ul）.. 2）60℃温浴过夜。

注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

二. 原位杂交第二天1. 1）将探针回收，放于－20C保存(通常探针可重复使用十次左右)。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。

3）置换2XSSCT1ml，60℃，放置15分钟。

4）置换0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分钟，重复一次。

斑马鱼(Danio rerio)胚胎免疫反应：补体基因在早期胚胎以及LPS刺激胚胎中的表达李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【摘要】以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,使用原位杂交及实时荧光定量PCR方法,对斑马鱼补体基因(C3,C4,C9,Bf1,Bf2,Bf3)及其调节因子(RCA2.1,RCA2.2)在早期胚胎中的时空表达模式及LPS刺激后表达量的变化进行了研究.结果表明,上述基因在胚胎早期(卵裂期至体节期)均为泛表达,从受精后24h至幼鱼阶段特异性表达于肝脏及消化道等器官.对胚胎显微注射LPS后,C3、C9、Bf1、Bf2、Bf3基因在早期胚胎中表达上调,RCA2.1基因表达下调,这与斑马鱼成鱼受到革兰氏阴性菌感染后补体分子(C3,C9,B因子等)的反应类似,表明其参与补体激活途径、溶膜途径及补体调节,提示斑马鱼可在胚胎发育早期构建补体系统,参与急性期反应等免疫反应.【期刊名称】《海洋与湖沼》【年(卷),期】2015(046)006【总页数】7页(P1444-1450)【关键词】补体;斑马鱼;胚胎;LPS;表达模式【作者】李宗耀;杨雨佳;张士璀;汲广东【作者单位】中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛 266003;中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所青岛266003【正文语种】中文【中图分类】Q786斑马鱼(Danio rerio)是脊椎动物的模式生物,与大多数鱼类相似,均为体外受精并发育。

在胚胎发育过程中,鱼卵暴露于水中,同水中大量的病原微生物直接接触。

这就引出一个问题,鱼类胚胎在发育过程中是如何保护自身免受外源微生物入侵的？鱼类的特异性免疫于脊椎动物中发育程度较低,免疫球蛋白种类和数量均有限,已有的研究表明,与鱼类特异性免疫相关的基因(Rag2,AID,TCRAC,IgLC-1,mIg,sIg,IgZ和DAB)直到胚胎受精后8天才对LPS诱导有强烈反应(Li et al,2011),说明在胚胎发育早期,特异性免疫尚未成熟,非特异性免疫尤其是补体系统在胚胎发育中的构建对其抵御外界病原体的入侵具有重要的意义。

斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。

二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。

在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。

斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。

最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。

为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。

斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。

2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。

3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。

4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。

5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。

6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。

因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。

三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。

曝气水10L。

性成熟雌、雄性斑马鱼。

四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。

2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。

3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。

选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。

斑马鱼斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼（Brachydaniorerio），原产于印度、孟加拉国。

斑马鱼(B. rerio)，是淡水水族箱观赏鱼，原产于亚洲，体长约4公分(1.5吋)，具暗蓝与银色纵条纹，蓑鮋属鱼类是海水水族箱观赏鱼，鳍棘有剧毒，体具色彩丰富的垂直条纹。

有些种类称为蓑鮋(lion-fish)或称狮子鱼、火鸡鱼。

由于其基因与人类87%相似，因此广泛应用与生命科学的研究，2009年研究表明，它可能为盲人和耳聋带来福音。

中文学名：斑马鱼别称：蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼二名法：Daniorerio界：动物界门：脊索动物门Chordata纲：辐鳍鱼纲Actinopterygii目：鲤形目Cypriniformes科：鲤科Cyprinidae属：（鱼丹）属Danio种：斑马鱼 D. rerio简介斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼（Brachydaniorerio），原产于印度、孟加拉国。

(里面常见的蓝斑马讲解）是两个非近缘鱼类类群，即鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)短鱼丹属(Brachydanio)淡水鱼类和鮋形目(Scorpaeniformes)鮋科(Scorpaenidae)蓑鮋属(Pterois)海水鱼类的统称。

斑马鱼(B. rerio)，是淡水水族箱观赏鱼，原产於亚洲，体长约4公分(1.5吋)，具暗蓝与银色纵条纹，蓑鮋属鱼类是海水水族箱观赏鱼，鳍棘有剧毒，体具色彩丰富的垂直条纹。

有些种类称为蓑鮋(lion-fish)或称狮子鱼、火鸡鱼。

斑马鱼是一种常见的热带鱼。

斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。

孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。

卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。

发育温度要求在25-31℃之间。

斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。

组织学与病理学技术实验报告实验名称：使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚her4 基因的表达使用整胚原位杂交方法定位观察斑马鱼胚胎her4 基因的表达一、实验目的：1）通过本实验掌握原位杂交的基本原理及方法。

2）观察her4基因在斑马鱼胚胎的表达位置。

二、实验原理：原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。

字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。

原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。

这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。

整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。

整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。

我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。

三、实验试剂及仪器1、实验试剂：系统水、4%聚甲醛、PBS溶液、甲醇（70%、50％、30％）、蛋白酶K的PBST溶液（在管中原有的约1mlPBST中加入1 μl 10mg|ml的蛋白酶K，终浓度10 μg|ml）、H2O2（3%H2O2；0.5M NaOH）、PBST溶液、HYB 溶液、RNA探针、50%甲酰胺、2×SSCT溶液、0.2×SSCT溶液、MABT、阻断溶液、羔羊清:MABT=1:9的溶液、AP底物染色缓冲液。

斑马鱼胚胎胚盾特异表达基因的鉴定万传璐;闫一芳;曹羽;王强【摘要】Objective During zebrafish gastrulation, dramatic movements rearrange cells into three germ layers and contribute to the formation of the shield organizer, which acts as a dorsal signal center to pattern the body axis.Global identification of shield organizer-specific genes in early gastrulas will be valuable for studying the regulatory cascades during organizer formation and body axis establishment.Methods Tg( gsc:GFP) transgenic embryos express GFP in the shield organizer, which is controlled by a 1.8 kb gsc promoter.Flow cytometry technology and RNA deep sequencing analysis were applied to isolate GFP positive cells from theTg( gsc:GFP) transgenic embryos and systematically uncover the genes highly expressed in the dorsal organizer.Subsequently, the expression of shield organizer-specific genes was further con-firmed by quantitative real-time PCR and whole mount in situ hybridization method during zebrafish embryonic develop-ment.Results GFP-positive cells exceeding 96%purity were isolated from shield-stage Tg(gsc:GFP) transgenic embryos and 657 organizer highly expressed genes were identified through RNA deep sequencing analysis.The results of in situ hy-bridization experiments revealed that a number of genes including KIAA1324, ripply1, twist2, isthmin1, nme4, zgc174153 and rrbp1b were expressed in shield organizer during zebrafish gastrulation.Conclusions The identification of these shield organizer-specific genes in the current study provides useful clues toexplore the zebrafish developmental functions in further studies.%目的：由于原肠期细胞的剧烈运动，在斑马鱼胚胎的背侧汇聚形成了称为胚盾（ shield organizer）的结构，是胚胎发育的信号组织中心，在背腹轴建立和胚层诱导过程中具有关键作用。

固定收集野生型斑马鱼的卵，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20℃ 保存，待用。

（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去处色素。

现在正在使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成）。

原位杂交第一天重水化和固定1）吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。

2）换成30％甲醇的PBST溶液，放置5分钟3）换成PBST溶液，换两次，每次放置5分钟4）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定1）用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。

5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。

发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2）用PBST溶液轻洗，在PBST中纺织5分钟。

3）用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

4）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

预杂交1）每个管中加上大约500ulHYB－，55℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的HYB＋取代HYB－。

3）55℃水浴预杂交4 小时以上。

杂交1）去除预杂交的HYB＋，加上100ulHYB＋，加上探针，使探针浓度为1ng/ul..2）55℃ 温浴过夜。

杂交与预杂交的温度可以是55到60℃不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

原位杂交第二天吸去探针1）将探针回收，放于－20℃保存2）用50%甲酰胺/2×SSCT溶液，55℃ 洗两次，洗两次，每次1毫升。

3）2×SSC1ml，55℃ 洗15分钟，每次1毫升。

4）0.2×SSC1ml，55℃ 洗两次，每次放置30分钟，每次1毫升。

侦测1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。