斑马鱼的胚胎发育与影响因素

斑马鱼胚胎发育阶段相关基因的挖掘与分析近年来，斑马鱼成为一种常用的实验室模式生物，其胚胎发育过程十分规律和可控，是研究发育生物学和基因调控机制的重要模型。

随着基因挖掘技术的不断发展，越来越多的基因与斑马鱼胚胎发育阶段相关性得到了发现。

因此，分析斑马鱼胚胎发育阶段相关基因的功能和调控机制对于揭示生命活动的本质有着至关重要的意义。

一、斑马鱼胚胎发育阶段及其分子机制斑马鱼是一种小型热带鱼类，其胚胎发育阶段可分为十几个时期，分别对应着不同的形态和生理特征。

这些不同的发育阶段均是由基因表达的时空调控所驱动的，特定的基因激活和抑制导致了不同的胚胎形态和器官功能的发生。

在斑马鱼的早期发育过程中，主要涉及到卵母细胞的受精和初胚形成。

此阶段的发育主要由母源性基因调控，如 nop5、dead end、Vasa等。

随着器官的逐渐形成，受精卵将发展成为由脑、眼、肌肉等不同组织构成的多细胞胚胎。

这个过程中涉及到神经、视觉、肌肉等多种发育生物学特征，同时也是多个信号通路的交错调节，如 BMP、Wnt、Notch、Hedgehog等。

在胚胎发育的晚期，涉及到器官的成熟和功能细化等生理特征。

这个过程也是多种生化信号和调节因子交错作用下的结果，其主要涉及到细胞增殖、周期、分化等方面的调控，如 Cyclin D1、Nodal、Sox9等。

以上所述只是基础的胚胎发育阶段及其分子机制，实际上与胚胎发育相关的基因非常多且复杂。

因此，对斑马鱼胚胎发育相关基因的挖掘与分析显得尤为重要。

二、斑马鱼胚胎发育相关基因的挖掘通常，对基因的挖掘可以通过多种方式进行。

例如，可以通过对小分子化学物质的筛选和识别来验证潜在的胚胎发育相关基因，或者采用基于全反式PCR和转录组测序技术的方法进行基因调控因子的预测和鉴定。

另外，通过胚胎发育过程中的突变模式和形态，可获得一些具有生物学意义的候选基因，对其功能的研究也是非常重要的。

目前，已经有大量的胚胎发育相关基因在斑马鱼中被发现并得到了鉴定。

研究斑马鱼的胚胎发育及其关键期发育斑马鱼作为实验室中常用的模式生物之一，其相对简单的生殖和发育过程使得它成为了人们研究胚胎发育的重要对象之一。

斑马鱼的生殖过程非常规律，整个胚胎发育周期为24小时左右，孵化出的幼鱼期只有3天时间，因此研究斑马鱼胚胎发育的关键期是极为重要的。

1.斑马鱼的繁殖周期按照斑马鱼的繁殖周期，胚胎发育可分为四个阶段：受精卵期、原肠胚期、中胚层期和胚胎期。

在受精卵期，由于胚胎的细胞数量较少，细胞分化还未开始，因此对于实验研究比较有利。

而原肠胚期则是胚胎细胞分化的关键时期，不同类型的细胞开始出现，胚胎的体轴形成也在这一时期完成。

中胚层期则是各个器官的形成时期，器官原基逐渐形成并开始发育。

胚胎期则是细胞分化和器官形成的阶段，各种器官开始具备其特定的功能。

2.斑马鱼的胚胎发育与研究方法在研究斑马鱼的胚胎发育过程中，有两种经典的实验方法：一种是观察胚胎的形态，另一种则是分子遗传学方法。

观察胚胎形态的方法包括显微镜观察、形态学分析、各种染色法和微剖检查等。

分子遗传学方法则包括DNA微注射、利用Tol2系统进行基因转染、利用Morphant植入进行基因敲除和利用各种转录因子进行基因表达调控等。

这些方法能够全面深入地研究斑马鱼发育过程中的各个细节，为发育生物学研究提供了成熟的基础。

3.斑马鱼的胚胎发育关键期胚胎发育关键期即是指在这些时期，斑马鱼胚胎发育过程中出现了大量的关键分化事件，从而对胚胎发育产生了决定性的影响。

比如，在受精卵期，精卵和精子合并形成的原始受精卵很快分裂成数千个相同大小的细胞，进入囊胚阶段，随后囊胚开始对细胞进行分化。

在这个时期，实验研究可以利用形态和分子生物技术，来全面了解斑马鱼胚胎发育基本的细胞分化过程。

原肠胚期则是一个重要的发育关键期，这时各个器官开始发育，形成胃肠道和脊髓，并且产生了一些重要的基因表达调控。

中胚层期和胚胎期是一个比较综合和复杂的发育时期，不同器官之间紧密联系和相互影响，分化程度和细胞命运已经初步确定，此时的特定基因已经被表达并进入各个器官的形态调控中。

2021年2月第29卷㊀第1期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICAFebruary 2021Vol.29㊀No.1楚璐萌,田子颖,崔蕊,等.低氧对斑马鱼胚胎发育和红细胞生成的抑制作用[J].中国实验动物学报,2021,29(1):1-8.Chu LM,Tian ZY,Cui R,et al.Inhibition effects of hypoxia on embryonic development and erythropoiesis in zebrafish [J].Acta Lab Anim Sci Sin,2021,29(1):1-8.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2021.01.001[基金项目]国家自然科学基金(31301135),河南省高等学校重点科研项目资助计划(21A320018),河南省高校科技创新人才支持计划(17HASTIT047),河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2016GGJS-103),新乡医学院精神神经医学学科群支持计划(2016PNKFKT-08),新乡医学院产学研合作项目(2017CXY-2-14),河南省生物精神病学重点实验室开放课题(ZDSYS2016001),研究生创新支持计划资助项目(YJSCX201811Z)㊂Funded by National Natural Science Foundation of China (31301135),Key Scientific Research Projects of Henan Province (21A320018),Innovative Talents in Science and Technology of Fund Program of Universities of Henan Province(17HASTIT047),the Young Backbone TeachersFellowship in Henan Province (2016GGJS-103),the Disciplinary Group of Psychology and Neuroscience,Xinxiang Medical University (2016PNKFKT-08),Production,Study and Research Project Funding of Xinxiang Medical University(2017CXY-2-14),Open Program of Henan Key Laboratory of Biological Psychiatry(ZDSYS2016001),Graduate Innovation Support Program Funded Projects(YJSCX201811Z).[作者简介]楚璐萌(1994 ),女,在读硕士研究生,研究方向:造血分化发育研究㊂Email:670381639@ [通信作者]于海川(1979 ),男,博士,副教授,研究方向:造血分化发育㊂Email:haichuan_yu@;吴娇(1978 ),女,博士,副教授,研究方向:神经分化发育研究㊂Email:wujiao@㊂∗共同通信作者低氧对斑马鱼胚胎发育和红细胞生成的抑制作用楚璐萌1,4,田子颖1,崔蕊1,吴娇2∗,于海川1,3∗(1.新乡医学院医学检验学院,河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心,河南新乡㊀453003;2.新乡医学院药学院,河南新乡㊀453003;3.新乡医学院第二附属医院,河南省生物精神病学重点实验室,河南新乡㊀453002;4.河南省郑州市第七人民医院,郑州㊀450000)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀本文以斑马鱼(Danio rerio )为研究对象,探讨了低氧对早期胚胎发育㊁造血分化和红系分化的影响㊂方法㊀选取受精后12h 的斑马鱼胚胎,随机分为两组,以常氧组为对照组,低氧组为实验组,实时观察斑马鱼胚胎发育形态学的变化;通过联苯胺染色㊁邻联茴香胺染色㊁AO 染色及瑞氏吉姆萨染色观察红细胞的生成及形态学变化;并通过Real time PCR 检测了斑马鱼胚胎造血相关基因的表达情况㊂结果㊀与常氧相比,低氧降低了斑马鱼胚胎卵黄囊的营养消耗,抑制了色素细胞的形成,减慢了心率,延缓了斑马鱼胚胎的孵化,观察和分析了低氧对红细胞产生和成熟的抑制作用㊂结论㊀低氧延缓了斑马鱼胚胎发育,抑制了红细胞的产生和成熟㊂ʌ关键词ɔ㊀斑马鱼;低氧;胚胎发育;造血分化;红细胞生成ʌ中图分类号ɔQ95-33㊀㊀ʌ文献标识码ɔA㊀㊀ʌ文章编号ɔ1005-4847(2021)01-0001-08Inhibition effects of hypoxia on embryonic development anderythropoiesis in zebrafishCHU Lumeng 1,4,TIAN Ziying 1,CUI Rui 1,WU Jiao 2∗,YU Haichuan 1,3∗(1.School of Laboratory Medicine,Henan Collaborative Innovation Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China.2.School of Pharmacy,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003.3.the Second Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Henan Key Laboratory of Biological Psychiatry,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453002.4.Zhengzhou No.7People s Hospital of Henan Province,Zhengzhou 450000)Corresponding author:YU Haichuan.E-mail:haichuan_yu@;WU Jiao.E-mail:wujiao@ ʌAbstract ɔ㊀Objective ㊀The vertebrate model of zebrafish (Danio rerio )was employed to explore the effects ofhypoxia on early embryonic development,hematopoietic differentiation,and erythroid differentiation.Methods ㊀At 12hpost-fertilization,zebrafish embryos were randomly divided into two groups.The normoxic group was used as the control group,and the hypoxic group was used as the experimental group.The morphological changes of zebrafish embryos were observed in real-time.Erythropoiesis and morphological changes were observed by benzidine,O-dianisidine,acridine orange,and May-Grunwald Giemsa staining.Real time PCR was used to analyze hematopoietic gene expression in zebrafish embryos.Results㊀Hypoxia reduced nutritional consumption of the yolk sac,inhibited the formation of pigment cells, slowed down the heart rate,and delayed the hatching of zebrafish embryos.Inhibitive effects of hypoxia on the production and maturity of red blood cells were observed.Conclusions㊀Hypoxia delays zebrafish embryonic development and inhibits the production and maturity of red blood cells.ʌKeywordsɔ㊀zebrafish;hypoxia;embryonic development;hematopoietic differentiation;erythropoiesis Conflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.㊀㊀斑马鱼(Danio rerio)是研究发育㊁造血和遗传学的强大模型[1],其具有体外受精发育㊁产卵量大㊁胚胎透明等多种优势[2-4]㊂斑马鱼与人类之间的遗传同源性达87%[5],同时具有遗传操作和再生能力[6],这使得斑马鱼成为目前研究脊椎动物胚胎发育和造血分化的优秀动物模型[7]㊂低氧是影响水生系统的最重要的压力源之一[8-9],目前有关低氧对斑马鱼胚胎发育的影响机制研究报道非常少㊂斑马鱼胚胎发育是一个复杂的㊁高度协同的过程㊂斑马鱼与人的造血分化是保守一致的,已经发现并克隆了造血过程中的阶段特异性表达基因,包括EPO㊁Globin和GATA1等[3,10]㊂研究发现红细胞生成受到低氧环境的影响,其中一个或多个异常可能导致不同类型的红细胞生成障碍[10]㊂本文采用联苯胺染色㊁邻联茴香胺染色及瑞氏吉姆萨染色来显示红细胞的生成及形态学变化,观察了低氧下斑马鱼胚胎的整个发育过程,并对常氧和低氧下的基因表达水平进行了比较,从而加深了低氧对脊椎动物影响的认识㊂目前涉及低氧对斑马鱼影响的详细研究很少,本研究为揭示低氧影响斑马鱼胚胎发育和红细胞生成的具体过程提供了新数据㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀实验动物本实验得到新乡医学院动物实验伦理委员会的审批(XYLL-2020163),于河南省免疫与靶向药物重点实验室中进行实验,实验动物实验使用许可证号ʌSYXK(豫)2018-0014ɔ㊂约100对状态良好的生育期的AB品系斑马鱼养殖于上海海圣斑马鱼实验养殖系统中,光照/黑暗14h/10h,水温为28ħ㊂受精卵在28.5ħ下孵育,并根据Kimmel等[2]方法进行分期㊂1.1.2㊀主要试剂与仪器3,3 ,5,5 -四甲基联苯胺(MACKLIN,中国);瑞氏吉姆萨染液(Baso,中国);AO染液(索莱宝,中国);邻联茴香胺(Sigma,美国);TRIzol试剂(ambion,美国);逆转录试剂盒(诺唯赞,中国)㊂斑马鱼养殖系统(上海海圣生物实验设备有限公司,中国);YCP系列三气培养箱(长沙华曦电子科技有限公司,中国);ZEISS Discovery.V8体式荧光显微镜(ZEISS,德国);BX51正置荧光显微镜(Olympus,日本);PikoReal TM实时荧光定量PCR检测仪(Thermo Fisher Scientific,美国);Tanon-3500凝胶成像系统(上海天能公司,中国)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀斑马鱼的繁殖和胚胎处理斑马鱼是根据已有文献的标准条件饲养和繁殖[11],交配和胚胎培养方法由中国斑马鱼资源中心提供㊂12hpf(hours post fertilization)后收集高质量的胚胎进行实验㊂将胚胎分为低氧和常氧培养组,低氧组的胚胎暴露于5%O2浓度下㊂每12h收集1次斑马鱼胚胎,鉴定胚胎的发育阶段㊂在不同发育时期,从常氧和低氧组各随机选取10个胚胎,用ZEISS ZEN软件计算卵黄囊的比例;用Image J软件分析体表色素沉着的比例;在体视显微镜下观察并计算胚胎个体的心率㊂1.2.2㊀联苯胺染色和邻联茴香胺染色联苯胺染色按照本实验室的方法进行[12],邻联茴香胺染色参照文献方法进行[13]㊂使用体式显微镜对各发育阶段的胚胎进行观察并拍照,用Image J 软件分析整个斑马鱼中染色部分的占比㊂图像至少是从3个独立的实验中获得,每组至少有6个胚胎或幼鱼㊂1.2.3㊀瑞氏吉姆萨染色对胚胎进行断尾处理收集血细胞,制备血涂片㊂斑马鱼预处理及瑞氏吉姆萨染色方法参照文献进行,并稍作改进[14-15]㊂使用BX51正置荧光显微镜观察并鉴定红细胞类型,并依据统计学方法计算红细胞在所有血细胞中的比例㊂1.2.4㊀AO染色随机收集10个胚胎/幼鱼移至包含1mL ddH2O的EP管中,然后加入30μL10μg/mL的AO染液,避光染色1h[16-17]㊂立即使用体式荧光显微镜观察并拍摄胚胎中的荧光㊂1.2.5㊀RNA提取和Real time PCR每组随机取50个胚胎/幼鱼,溶于TRIzol试剂中提取总RNA㊂使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA㊂使用特异性基因引物(见表1)进行常规RT-PCR和Real time PCR㊂表1㊀实时荧光定量PCR引物名称及序列Table1㊀Primer names and sequences of Real time PCR引物名称Primer names引物序列(5 -3 )Primer sequences(5 -3 ) Z-Globin-F TTTCCGCAAAGGACAAAGCGZ-Globin-R AGGAGAGTTGGGGCTTAGGTZ-GATA1-F TTTACGGCCCTTCTCCACACZ-GATA1-R GGTGGCACCACAATTCACACZ-l-plastin-F GATGTGGATGGGAACGGTCAZ-l-plastin-R ATGAACCACCTTGGCGAACTZ-scl-F CGGGCTGACAACTAGCGTATZ-scl-R TACCTGATGAGGCGTGGGTAZ-c-myc-F TATGCTGCAAGTGACCGGAGZ-c-myc-R GCTGGATGGAGTCGTAGTCGZ-NFIL3-F TAGCCCGATGTCCTTCCAGAZ-NFIL3-R TGGTGAGTCTGGACATTGCCZ-GAPDH-F TCACATTAAGGGTGGTGCAAZ-GAPDH-R GTGATGGCATGAACAGTGCT 1.3㊀统计学分析使用GraphPad Prism7软件对实验数据进行分析㊂计量资料以平均值ʃ标准差( xʃs)表示,采用t检验比较两组样本的均值,多组间的样本采用单因素方差分析㊂P<0.05为差异有统计学意义㊂2㊀结果2.1㊀低氧延迟斑马鱼胚胎发育依据前期实验结果,最终选定5%O2浓度作为低氧条件㊂将12hpf的斑马鱼胚胎(图1A)随机分为两组,分别在常氧和低氧下培养㊂24hpf,咽囊期原基-5期视网膜色素沉着和皮肤黑色素沉积较早,卵黄囊内出现红细胞,此时出现早期心脏搏动(图1B);36hpf,原基-25期,绒毛膜中的斑马鱼胚胎出现早期运动㊁尾部色素沉着和血液循环(图1C); 48hpf,长胸鳍期,卵黄囊开始变薄,侧边带出现黑素细胞,视网膜上的虹膜色素细胞丰富,头部出现黄色(图1D);60hpf,高胸鳍期,血液循环明显,视网膜虹膜色素细胞环加深(图1E);72hpf,孵化期的突口阶段,虹膜色素细胞覆盖眼睛,背部与头部相同颜色(图1F);84hpf,斑马鱼胚胎已经发育到幼鱼期(图1G)㊂低氧下,胚胎在24hpf时发育到卵裂期的20-体节阶段,在胚胎背侧区域共观察到20个体节,相当于在常氧下19hpf时的发育阶段(图1H)㊂同样,低氧下,36㊁48㊁60㊁72㊁84hpf的胚胎发育阶段分别为原基-6期㊁原基-25期㊁高胸鳍期㊁长胸鳍期和胸鳍期,分别与常氧下的25㊁36㊁42㊁48㊁60 hpf一致(图1I㊁1J㊁1K㊁1L㊁1M),即低氧在一定程度上延迟了斑马鱼胚胎的整体发育㊂2.2㊀低氧对于斑马鱼卵黄囊㊁色素沉着㊁胚胎孵化和心率的影响在相同发育阶段,低氧组斑马鱼的卵黄囊体积明显大于常氧组(图2A㊁2B);低氧组斑马鱼眼睛㊁头部㊁躯干和卵黄囊中的色素沉着明显低于常氧组(图2A㊁2C);在相同的长胸鳍阶段,常氧组胚胎完成了孵化,低氧组胚胎仍然包裹在绒毛膜中(图2A)㊂常氧组斑马鱼在24hpf时胚胎开始出现早期的心脏搏动,而此时低氧组未发现心脏搏动㊂从24 hpf开始,无论是否低氧培养,胚胎早期心率随时间变化趋势一致,约60hpf后心率趋于稳定,而在相同发育时间,低氧组斑马鱼胚胎心率明显低于常氧组(图2D)㊂另外,相同发育阶段,低氧下的胚胎心率明显低于常氧(图2E)㊂2.3㊀低氧减少斑马鱼早期胚胎发育红细胞的生成邻联茴香胺染色结果显示,经低氧处理的斑马鱼胚胎的邻联茴香胺的着色面积显著降低,染色部位主要位于卵黄囊,而常氧组斑马鱼胚胎的染色部位则逐渐从卵黄囊转移到心脏和头部(图3A-a,c, e,g)㊂联苯胺染色结果与邻联茴香胺染色基本一致,常氧下胚胎的主要染色部位逐渐从卵黄囊和大血管转移到心脏㊁大血管和节间血管,低氧下的染色部位逐渐从卵黄囊转移到心脏和血管,节间血管染色不明显(图3B)㊂使用Image J软件对联苯胺染色结果进行分析,在同一发育阶段,低氧下胚胎的着色面积比例明显低于常氧(图3C)㊂AO染色结果显示,低氧下斑马鱼胚胎卵黄囊的前部和上部有大量的凋亡细胞(绿色荧光颗粒);但其会随着斑马图1㊀斑马鱼胚胎发育代表性图片(ˑ150)Figure 1㊀Representative images of zebrafish embryonic development(ˑ150)注:A:斑马鱼胚胎的代表性图片(ˑ150);B㊁C:斑马鱼卵黄囊体积占比和色素沉着占比;D:不同发育时间斑马鱼胚胎的心率变化;E:相同发育阶段下斑马鱼胚胎的心率的差异㊂与常氧相比,∗P <0.05,∗∗P <0.01,∗∗∗P <0.001㊂(下图同)图2㊀低氧对于斑马鱼胚胎卵黄囊㊁色素沉着和心率的影响Note.A.Representative images of zebrafish embryos(ˑ150).B,C.The proportion of yolk sac volume and the proportion of pigmentation.D.The heart rate of zebrafish embryos under normoxic and hypoxic conditions at different developmental time.E.The heart rate of zebrafishembryos under normoxic and hypoxic conditions at the same developmental pared with normal oxygen,∗P <0.05,∗∗P <0.01,∗∗∗P <0.001.(The same in the following figures)Figure 2㊀Effects of hypoxia on yolk sac,pigmentation and heart rate of zebrafish embryos鱼胚胎的发育逐渐减少(图3A-b,d,f,h)㊂2.4㊀低氧抑制红细胞成熟瑞氏吉姆萨染色结果显示,同一发育时期,低氧下斑马鱼的总红细胞(包括幼稚红细胞和成熟红细胞)比例低于常氧(图4A㊁4B)㊂图4A 中,蓝色箭头处为未成熟红细胞,胞体呈圆形,胞质丰富,细胞核呈圆形或类圆形,蓝色,多居中;红色箭头处为成熟的红细胞,胞体比未成熟红细胞小,呈椭圆形,胞质丰富,细胞核呈椭圆形,深紫色㊂低氧下84hpf 的斑马鱼血液中只有未成熟的红细胞存在㊂但是同一发育阶段下常氧和低氧相比较,红细胞总数的比例没有统计学意义(图4C)㊂以往的研究表明,斑马鱼血液中的红细胞呈连续性年龄分布,成熟的红细胞血红蛋白含量较高[18]㊂这些结果表明低氧在一定程度上抑制了红细胞的成熟㊂2.5㊀低氧对于斑马鱼胚胎发育过程中造血相关基因表达的影响通过绘制斑马鱼胚胎发育早期的造血细胞分化发育图谱,我们选定了部分重要的造血相关基因进行表达检测㊂首先使用RT-PCR 的方法观察了在正常培养过程中斑马鱼胚胎发育6㊁12㊁24㊁48㊁72hpf 时一些重要造血相关基因的表达情况(图5A),在24hpf 之后,红系特异性造血因子GATA1和Globin 随着发育时间的增加其表达强度逐渐增加;注:A:斑马鱼胚胎的邻联茴香胺染色图片和AO 染色图片(ˑ150);B:斑马鱼胚胎的代表性联苯胺染色图片(ˑ100);C:联苯胺染色量化图㊂图3㊀低氧对斑马鱼胚胎血红蛋白的生成和细胞凋亡的影响Note.A.O-dianisidine staining pictures and Acridine orange staining pictures of zebrafish embryos(ˑ150).B.Representative benzidine staining of zebrafish embryos(ˑ100).C.Quantitative line chart of Benzidine staining.Figure 3㊀Effects of hypoxia on hemoglobin production and cell apoptosis of zebrafishembryos注:A:斑马鱼胚胎血细胞的瑞氏吉姆萨染色(ˑ1000);B:不同发育时期斑马鱼胚胎中红细胞的比例;C:在相同的发育阶段,斑马鱼胚胎中红细胞的比例㊂图4㊀低氧抑制红细胞成熟Note.A.May-Grunwald Giemsa staining of zebrafish embryonic blood cells(ˑ1000).B.The proportion of red blood cells in blood of zebrafish embryos at different developmental time.C.At the same developmental stage,the proportion of red blood cells in blood of zebrafish embryos.Figure 4㊀Hypoxia inhibits red blood cell maturity同时其他的与造血相关的基因c-myc㊁scl㊁GATA2和NFIL3等在斑马鱼胚胎发育早期,也随着发育时间呈逐渐升高的趋势,而l-plastin 在早期的表达更加明显㊂另外,Real time PCR 结果显示了常氧和低氧下一些红系相关基因的表达差异㊂Globin 在相同的发育时期低氧下的表达强度要明显低于常氧下的表达强度,与之相反Epo 基因在低氧下则显示较高,同时其他相关造血基因在某些发育阶段也显示出低氧下表达强度低于常氧下(图5B)㊂这些基因表达的变化情况证实并解释了先前观察到的低氧抑制斑马鱼胚胎早期红系分化的结果㊂注:A:RT-PCR 分析常氧条件下斑马鱼胚胎发育过程中的mRNA 表达水平;B:Real time PCR 分析比较常氧和低氧条件下造血相关mRNA 的表达差异㊂图5㊀低氧对于斑马鱼胚胎发育中基因表达的影响Note.A.Some mRNA level was analyzed by RT-PCR during embryonic development of zebrafish.B.Real time PCR was employed to analyze the differential expression of hematopoietic related mRNA.Figure 5㊀Effects of hypoxia on gene expression in embryonic development of zebrafish3㊀讨论为了探讨低氧对斑马鱼胚胎发育和造血作用的影响,我们使用了不同的低氧浓度和低氧处理时间㊂前期的实验结果表明当受精后的胚胎直接暴露于1%O 2浓度下超过24h,死亡率几乎是100%㊂我们最终选定了5%O 2浓度作为最适低氧浓度,而12hpf 作为最佳低氧处置时间㊂斑马鱼胚胎是一个 封闭系统 ,且发育早期不能合成血红蛋白来供应自身氧气的需求,只能通过外界氧气的被动扩散才能满足斑马鱼胚胎的正常生长发育,所以绒毛膜上的孔洞是氧气和营养物质从外部水环境运输到胚胎和清除废物所必需的[19],通过独特的绒毛膜结构,未孵化的胚胎感受到低氧并影响其发育,本研究发现低氧延缓了斑马鱼的孵化时间㊂卵黄囊的主要作用是为斑马鱼早期发育提供所需的营养物质,使发育不受外界干扰[20]㊂但有研究发现抵抗动物缺氧的最重要的防御机制之一是能量消耗的下调[21],本实验结果显示:低氧下斑马鱼胚胎卵黄囊的体积占比大于常氧,即实验证实低氧抑制卵黄囊的消耗㊂同时低氧减少了胚胎的体外色素沉着,这可能是由于低氧降低细胞色素P450的表达[22],或者因为低氧影响了酪氨酸酶的活性从而延迟了胚胎色素细胞的发育[23]㊂总之,低氧从整体上抑制了斑马鱼胚胎的发育过程,而持续的低氧不利于胚胎发育和生物学进化,在某些情况下甚至可能导致严重的疾病或死亡㊂鱼类心脏对多种环境因素敏感,其中之一就是低氧㊂在低氧状态下,由于外部氧气浓度较低,通过绒毛膜被动扩散进入斑马鱼胚胎的氧气含量无法满足斑马鱼胚胎心脏形成和发挥功能的需求,从而导致其出现持续性心动过缓,通过降低心率和能量消耗从而提高成活率[24]㊂与文献报道相一致,本研究发现低氧会导致斑马鱼心率发生复杂的变化,其确切的变化取决于发育阶段,并且在较小的程度上取决于饲养温度[25]㊂同时,以往文献显示,低氧导致斑马鱼胚胎出现一定程度的心包水肿,伴有卵黄囊水肿,胚胎血管系统发育不良,血液流速变缓[26-28]㊂我们的研究结果再一次证实了这一结果,心包水肿影响血液循环㊁心率,并很可能对血细胞生成有一定影响㊂低氧不仅影响斑马鱼胚胎的形态和心脏功能,造血分化和红细胞生成也受到了影响㊂斑马鱼是研究胚胎红细胞生成的理想系统[29]㊂红细胞的产生在许多水平上受到调节,包括基因表达的控制,环境条件的改变㊂本研究结果显示胚胎发育早期低氧对红细胞产生和成熟具有抑制作用㊂这可能是由于在胚胎发育的早期,低氧下卵黄囊前部和上部的血供不足引起的细胞凋亡,但在发育后期斑马鱼胚胎出现低氧耐受,凋亡模式发生改变,细胞凋亡数量减少㊂为了揭示低氧对红细胞生成过程中基因表达可能存在的调控机制,我们检测了一些重要的造血相关基因㊂有研究表明斑马鱼胚胎发育后期,12hpf胚胎血红蛋白的表达水平开始增加,并在孵化前后达到高峰,且胚胎血红蛋白基因水平一直保持在高水平,直到成年[30]㊂本实验的初步结果表明,常氧下12hpf,红系特异性造血因子Globin开始表达,随着发育时间的增加其表达强度逐渐增加,这与已有的研究报道结果是一致的;但是低氧下Globin的表达水平降低,及HiF1α的表达水平升高,提示在斑马鱼胚胎发育早期,低氧确实影响基因表达,但其分子机制尚不清楚㊂据报道,低氧可以通过调节斑马鱼胚胎的HIF通路,影响斑马鱼胚胎造血干细胞的产生和造血末期红细胞的终末分化[31-33]㊂综上所述,低氧延缓了斑马鱼胚胎的发育,抑制了红细胞的产生和成熟㊂我们的结果加深了人们对低氧诱导脊椎动物产生影响的认识,同时也提供了低氧对斑马鱼胚胎发育和红细胞生成的最新认识㊂由于斑马鱼相对于小鼠模型具有许多优势,斑马鱼疾病模型的进一步发展将加速我们对疾病各种病理㊁生理过程的了解㊂随着斑马鱼疾病模型的可用性和日益增加的多样性,该动物系统将为疾病诊断,有效治疗和预后提供强大的基础㊂在高海拔地区,低氧与中风或癌症等疾病相关[34]㊂所以此项研究在一定程度上为探索临床上低氧性疾病提供了新的认识和见解,但低氧究竟如何影响斑马鱼的胚胎发育和造血分化,还有待进一步研究㊂参㊀考㊀文㊀献(References)[1]㊀王小琦,孙岩,张洋,等.斑马鱼模型在常见骨疾病研究中的应用[J].中国比较医学杂志,2017,27(6):86-91.Wang 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斑马鱼模型以及其在遗传学实验研究中的应用斑马鱼（Danio rerio）是一种小型热带淡水鱼类，广泛应用于生物医学研究领域。

它的快速发育、高繁殖能力和透明胚胎等特点，使得斑马鱼成为研究人类疾病和遗传学的理想模型生物。

在遗传学实验研究中，斑马鱼被广泛用于探索基因功能、疾病模拟、药物筛选、发育生物学等诸多方面。

斑马鱼模型的优势主要体现在以下几个方面。

首先，斑马鱼的特征使其成为遗传学研究的理想模型。

斑马鱼的基因组在许多方面与人类的基因组高度保守，大约70%的人类基因具有斑马鱼的同源基因。

这意味着，通过研究斑马鱼的基因功能，我们可以更好地理解人类基因以及与之相关的疾病。

其次，斑马鱼的胚胎发育速度极快。

斑马鱼的胚胎在受精后仅需24小时便可以孵化。

另外，斑马鱼胚胎的发育过程可以在显微镜下清晰可见，这意味着我们可以轻松观察到发育过程中的变化，并进行更加精确的实验观察。

此外，斑马鱼的胚胎透明，这一特点使得研究人员能够直接观察到内脏器官和神经系统的发育。

通过应用各类荧光探针或特定标记物，我们可以在斑马鱼胚胎中对特定基因或基因产物进行定位和可视化，从而更深入地研究其功能和作用机制。

斑马鱼模型在遗传学实验研究中有着广泛的应用。

首先，斑马鱼模型可以用于探索基因功能。

在遗传学研究中，研究人员可以使用各种基于遗传学、分子生物学和转基因技术的方法来扰乱或改变斑马鱼基因的功能，从而了解特定基因对发育和疾病的影响。

其次，斑马鱼模型可以用于疾病模拟。

斑马鱼的遗传相似性和发育过程相似性使其成为研究人类疾病的理想模型。

通过模拟人类遗传病或疾病相关基因突变，我们可以研究这些疾病的发病机制、生理学变化和潜在治疗策略。

此外，斑马鱼模型还可以用于药物筛选。

研究人员可以将药物添加到斑马鱼培养液或胚胎中，然后观察斑马鱼的发育、行为和生理特征，以评估药物的毒副作用和药效。

这种药物筛选方法可以加速药物开发和筛选过程。

最后，斑马鱼模型在发育生物学领域也有广泛应用。

斑马鱼的胚胎发育与影响因素鲁东⼤学⽣命科学学院学院20 10 －20 11 学年第⼆学期学院______________ 专业_____________ 年级________ 班________ 学号_____________姓名______________密封线学⽣须将⽂字写在此线以下《发育⽣物学》课程论⽂课程号：2522080.关键词：斑马鱼；发育；葡萄糖；溶液浓度；温度；TCDD⼀、斑马鱼简介斑马鱼(zebra fish)，⼜名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。

斑马鱼是⼀种常见的热带鱼。

斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对⽔质要求不⾼。

孵出后约3个⽉达到性成熟，成熟鱼每隔⼏天可产卵⼀次。

卵⼦体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。

发育温度要求在25-31℃之间。

斑马鱼由于个体⼩，养殖花费少，能⼤规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。

经过30多年的研究应⽤和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库⾥有相关斑马鱼的资料可供查询和下载，⽅便了研究。

斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分⼦机制的优良资源，有的还可做为⼈类疾病模型。

斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育⽣物学模式之⼀，在其它学科上的利⽤也显⽰很⼤的潜⼒.⼆、斑马鱼的发育过程1〕卵⼦的发⽣斑马鱼卵⼦发⽣过程中乱母细胞的发育是不同步的。

在卵⼦发⽣早期，核内许多⼩核仁开始富集，其数⽬在接下来的时期中可以达到1500个，他们分布在和的外围和靠近内部核膜。

斑马鱼卵⼦发⽣过程⼀般分为5个时期，即StageⅠ-Ⅴ;有时也将StageⅡ和Ⅲ作为⼀个时期将卵⼦发⽣分为4个时期。

各个时期的基本特征是：StageⅠ是原始滤泡⽣长阶段，乱母细胞没有卵黄，是⼀个有细胞质包围着升值滤泡的圆形球体。

其染⾊体去浓缩并出现灯刷装状表型，此时DNA⾼度延伸，形成⼀个具有典型形态学上的包含RNA和蛋⽩质的恻环。

斑马鱼在发育生物学中的研究进展斑马鱼（Danio rerio）是一种常见的小型热带淡水鱼类，也是一种重要的生物模型，因为它们易于繁殖和维护，具有透明胚胎，容易观察和操纵发育过程的特点。

在过去的几十年里，许多生物学家使用斑马鱼进行发育生物学研究，探寻分子机制、细胞过程、组织发生、器官形成和行为等方面的问题。

本文将介绍斑马鱼在发育生物学中的研究进展及其应用。

1. 斑马鱼的发育过程斑马鱼的发育过程可分为四个主要阶段：受精、分裂、胚胎发育和幼鱼期。

受精后，卵细胞形成受精卵，随后通过有丝分裂发育成为多个细胞，其中包括前期胚胎、球胚和盘胚。

在这些早期阶段，斑马鱼的胚胎透明，发育过程可以通过显微镜直接观察。

在幼鱼期，斑马鱼游泳、摄食和生长，逐渐成为成年鱼。

2. 斑马鱼的发育成因对于斑马鱼的发育成因的研究可以通过突变体筛选、遗传分析、基因克隆等方法进行。

许多突变体显示了不同的发育缺陷，例如胃肠道畸形、神经系统缺陷、鳍/肢体畸形等。

通过对这些突变体的遗传分析和基因克隆，科学家发现了很多与斑马鱼发育相关的基因，如sonic hedgehog、hox等。

另外，近年来，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，科学家可以精确地改变斑马鱼基因组中的某些位点，以研究特定基因功能或疾病模型等方面的问题。

这种方法加速了斑马鱼发育生物学的研究和应用。

3. 斑马鱼的组织和器官形成斑马鱼的器官发生过程是发育生物学的热点研究之一。

在胚胎发育过程中，骨骼、肌肉、心脏、肝脏、胰腺等组织和器官的形成令人印象深刻。

例如，斑马鱼心脏的发育非常相似于人类的心脏发育过程。

斑马鱼心脏发育的详细解剖和功能特征使得我们可以更好地理解人类心脏疾病，包括先天性心脏缺陷和心肌病等。

在肌肉结构和功能方面，斑马鱼是一种适应游泳的生物模型。

它们的鱼体非常透明，我们可以观察和操纵它们的鱼肌和鱼晶体肌的发育和生理功能。

研究斑马鱼肌肉发育和运动调节机制有助于解决人类运动性疾病诊断和治疗的问题。

斑马鱼胚胎发育实验报告斑马鱼(zebra fish)，体长约4公分，具暗蓝与银色纵条纹，由于其基因与人类87%相似，因此广泛应用与生命科学的研究。

对水质要求不高，孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。

卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。

发育温度要求在25-31℃之间。

斑马鱼的繁殖周期约7天左右，受精卵经2-3天可孵出仔鱼，一年可连续繁殖6-7次，而且产卵量高。

斑马鱼的胚胎发育分为7个阶段：1.合子期；2。

分裂期；3.囊胚期；4.原肠胚期；5.体节期；6.咽囊期；7.孵化期。

1.合子期：合子是一个包括卵黄和细胞质的半透明混合物，在动物极存在一个小的清晰的细胞质断层，即细胞泡的残余。

2.卵裂期:该时期的特点是细胞分裂间期短；细胞变小；不等裂。

斑马鱼的受精卵为端黄卵，卵裂局限于胚盘部分，为不完全卵裂。

斑马鱼受精后40分左右卵裂开始，平均约每隔15分卵裂一次。

3.囊胚期：从第八次卵裂开始，就进入囊胚期，与其他真骨鱼不同的是，斑马鱼的囊胚期不形成囊胚期腔，只在胚盘的下层细胞的一些小的细胞形成一些细胞外间隙；同时细胞分裂周期开始延长，标志着中胚囊转换开始。

4.原肠胚期：原肠作用是指囊胚细胞有规则的移动，在此时期斑马鱼的生殖层开始形成，斑马鱼的原肠运动主要为外包。

5.体节期：最显著的特征是近轴中胚层节律性分节形成体节。

此外，还有眼原基和耳原基开始出现：脑神经外胚层变厚；脊索细胞开始延展到胚胎尾部6.咽囊期：体轴从原来的弯曲变为伸直；鳍条开始发育7.孵化期：完成基本器官系统的快速形态发生。

以下是对各时期鱼卵的观察记录：左上和左下示未分裂情况合子期右下示1细胞时期示1细胞时期示64至1000细胞时期示。

斑马鱼在生物学研究中的应用斑马鱼是一种小型的热带淡水鱼类，因其身体上黑白相间的斑纹被称为斑马鱼。

在近年来，由于斑马鱼的短生命周期、大量繁殖和易于处理的特点，使其成为了生物学研究中非常重要的模式动物。

在本文中，我们将会探讨斑马鱼在生物学研究中的应用。

一、胚胎发育研究胚胎发育研究一直是重要的生物学研究领域，该领域的研究主要是探究胚胎形态生成及内部生理学过程。

斑马鱼在胚胎发育研究中是一种非常有用的动物模型，其从受精卵发展到成鱼只需要3-4个月的时间，相比其他脊椎动物更加迅速。

事实上，斑马鱼的受精卵在5小时内即可发育成胚胎，并在约24小时后发育出心脏、神经系统和胰腺等重要器官。

如此快速的发育周期为研究人员提供了充足的时间进行研究，并使得斑马鱼在胚胎发育研究中成为了最具有活力和便捷操作的动物模型之一。

二、遗传学研究遗传学是研究遗传物质传递和变异规律的科学，也是当今生物学研究的重要领域。

在遗传学研究中，斑马鱼被广泛用于研究基因功能以及基因突变等。

斑马鱼虽然拥有大量不同的基因序列，但与人类基因相似度高达70%，这意味着斑马鱼和人类拥有许多相同的基因。

由于斑马鱼在发育早期就能够进行带标签的基因转移，而且护理要求比其他动物低，所以斑马鱼被广泛用于研究基因突变所产生的变异表型。

三、药物筛选药物筛选是一个非常庞大而且繁难的过程，以确保所开发的药物在体内能够很好的发挥其治疗功能。

斑马鱼在药物筛选中起到了重要的作用。

由于斑马鱼有很高的代谢活性和药代动力学，可以帮助人们更好地理解药物的代谢途径以及药物的毒性，而这些信息对药物的开发和安全性非常重要。

此外，斑马鱼对于各种化学物质的反应能力也非常高，因此能够对潜在毒性进行全面、高效、廉价的筛选。

这使得斑马鱼成为了药物筛选中非常重要的模式生物之一。

四、神经科学研究神经科学是研究神经系统结构和功能的学科，斑马鱼也被应用到神经科学研究中。

斑马鱼在神经系统结构方面非常相似于人类，可以通过神经细胞的透明度进行实时的观察。