镰刀菌产纤维素酶液体发酵工艺研究

树舌灵芝工艺的研究

刘中华;葛红莲;曹昊昊

【期刊名称】《食品安全导刊》

【年(卷),期】2015(000)032

【总页数】2页(P68-69)

【作 者】刘中华;葛红莲;曹昊昊

【作者单位】周口师范学院生命科学与农学学院;周口师范学院生命科学与农学学院;周口师范学院生命科学与农学学院

【正文语种】中 文

纤维素酶是多组分酶系的总称，各种酶协同作用可以降纤维素分解为寡糖和纤维二糖，最终生成葡萄糖。纤维素酶被用来降解纤维素时，反应条件温和、特异性高且环境污染小。纤维素酶已广泛地应用于发酵工业、食品工业、燃料工业等各个方面。

自然界的很多生物体内都产生纤维素酶，如细菌、真菌体内。现已报道的高产纤维素酶的真菌主要有木霉、青霉、黑曲霉，而研究大型真菌所产纤维素酶的报道却很少。大型真菌一般都可药用或食用，它不分泌有害物质，将其分泌的纤维素酶应用于食品或医药行业，市场前景看好。近年来，随着人们对灵芝药理学研究的越来越多，灵芝已成为开发功能性食品和药品的一种重要原材料。

本文通过对树舌灵芝产纤维素酶液体发酵工艺的研究，旨在提高树舌灵芝所产纤维素酶的活力，为进一步开发利用树舌灵芝纤维素酶提供一定的理论基础。

菌株,树舌灵芝周口师范学院生命科学与农学学院提供。培养基

斜面培养基采用PDA培养基；种子及发酵培养基的配制方法同斜面培养基，不加琼脂。主要仪器与设备,电子天平(JD200-3)，气浴恒温振荡箱(THZ-82A)，水浴锅

(HH-S)，分光光度计(Spectrumlab 22PC)，离心沉淀器 (80-2)，电热鼓风干燥

(DGF30/14-ⅡA)。葡萄糖标准曲线的绘制

采用潘春梅的方法绘制葡萄糖标准曲线，所得的标准曲线的线性回归方程为 : y =

0.0012x + 0.0126，R2=0.9966。 粗酶液的制备 ,将树舌斜面母种接入PDA培养基中，于25℃下活化培养5 d后，接入液体种子培养基，在 25℃，100 r/min的摇床培养4 d，按5%接种量接种至发酵培养基中，25℃恒温培养 5 d后，发酵液离心去菌丝体，所得上清液即为粗酶液。纤维素酶活力的测定,于试管中加入2 mL由pH 4.8的柠檬酸缓冲液配置的1%的CMC-Na，预热5 min，再向试管中加入2 mL粗酶液，空白管中加入2 mL灭活的粗酶液，于50℃保温30 min，然后向实验管和对照管中分别加入3 mL的DNS试剂，沸水浴10 min，然后冷却至室温，定容到20 mL，混匀，于540 nm处测吸光度。1个酶活单位(U)定义为1

中国饲料２００８年第１７期

基金项目：四川省教育厅自然科学科研项目（２００５Ａ０３０）＊通讯作者纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶三大类（谢占玲和吴润，２００４），在协同作用下它们可以将纤维素物质彻底水解成葡萄糖，进而发酵产生乙醇，解决能源再生以及环境污染等问题。目前，纤维素酶成本高及酶活力低严重制约其在生产中的广泛应用。为解决这个问题，一方面需要筛选高产量和高酶活力的纤维素酶产生菌，另一方面就是通过现代的基因工程手段，构建高效表达的基因工程菌，或通过对已知的纤维素酶进行分子改造以提高其比活力。由于筛选原始菌株工作量大，且产量一般情况下较基因工程菌低，所以构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。目前，国内外鲜见在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道。本试验以工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ为研究对象，对其产酶条件进行优化，通过优化培养条件以进一步提高表达量，为实现基因工程菌产业化奠定基础。１材料与方法１．１菌种来源四川农业大学生命科学与理学院生物化学与分子生物学实验室自行构建保存的基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ。１．２培养基ＬＢ培养基：１％胰蛋白胨，１％Ｎａ－Ｃｌ，０．５％酵母浸出粉，ｐＨ７．０～７．５；配制固体培养基时需加入１．５％～２．０％的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入四环素（终浓度为１０μｇ／ｍＬ）。ＬＢ－ＣＭＣ培养基：在ＬＢ培养基中加入０．５％的羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）。１．３生物量测定将培养液稀释２５倍，用７２１－型分光光度计在６００ｎｍ下测定光密度，以未接种的培养基等量稀释液作对照。１．４酶活力测定参照郑淑霞等（２００４）方法。以１ｍＬ１％（ｍ／Ｖ）羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）溶液为底物，加入０．１ｍＬ适当稀释的酶液并混匀，置水浴锅中５０℃静置保温３０ｍｉｎ，然后加入２．５ｍＬ二硝基水杨酸钠（ＤＮＳ）溶液，混匀后置１００℃煮沸５ｍｉｎ，取出后用流水冷却至室温，定容至５ｍＬ，最后在５３０ｎｍ波长处测得各管溶液的吸光值并计算酶活力。对照先加ＤＮＳ，后加酶液，其余步骤不变。在上述条件下，１ｍＬ原酶液每分钟催化底物产生相当于１μｇ葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（Ｕ／ｍＬ）。１．５种龄（Ｘ１）对产酶的影响从平板上挑取一纤维素酶基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ培养条件的研究四川农业大学生命科学与理学院韩学易陈惠＊胥兵阮景军［摘要］对基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ培养条件优化的研究结果表明：２５０ｍＬ三角瓶中装入５０ｍＬＬＢ培养基（含有１０μｇ／ｍＬＴｅｔ），按５％的接种量接种种龄为１２ｈ的液体种子，培养４ｈ后加入终浓度为０．２％的木糖进行诱导，９ｈ后上清液中酶活可达８８９Ｕ／ｍＬ，是出发菌株Ｃ－３６（７９．２Ｕ／ｍＬ）的１１．２２倍。［关键词］巨大芽孢杆菌；内切葡聚糖酶；培养条件［中图分类号］Ｓ８１６．３２［文献标识码］Ａ［文章编号］１００４－３３１４（２００８）１７－００１４－０４［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＴｈｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｔｒａｉｎｐＨＢＭ－Ｅｎｄｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｃｕｌｔｕｒｅｗｅｒｅ：ｖｏｌｕｍｅ５０ｍＬ，ｔｈｅｓｅｅｄａｇｅ１２ｈ，ｔｈｅｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｒａｔｅ５％，ｔｈｅｉｎｄｕｃｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０．２％，ａｎｄｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅ９ｈ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅｉｓｕｐｔｏ８８９Ｕ／ｍＬｗｈｉｃｈｉｓａｂｏｕｔ１１．２２ｔｉｍｅｓｏｆｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｓｔｒａｉｎ（７９．２Ｕ／ｍＬ）．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＢａｃｉｌｌｕｓＭｅｇａｔｅｒｉｕｍ；ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ；ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ１４中国饲料２００８年第１７期

里氏木霉产纤维素酶分离纯化工艺研究

发布时间：2021-11-11T06:46:02.936Z 来源：《中国科技人才》2021年第22期 作者： 侯龙龙 谢军 任晓辉 白冠章

[导读] 目前，世界各国都在积极研究利用非粮发酵手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。

义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司 河南省三门峡市 472300

摘要：目前，世界各国都在积极研究利用非粮发酵手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。木质纤维素作为地球上储量最丰富的多糖类物质，利用其生产燃料乙醇已成为各国研究的热点领域。但由于木质纤维素结构致密复杂，大

多数微生物并不能将其作为直接碳源来生产乙醇，只有将其水解成可发酵单糖类物质后，才能被微生物利用。酶解法由于其反应条件温

和、效率高、能耗低、选择性强以及环保效果好等优点，被广泛应用于纤维素水解过程中。但由于纤维素酶的酶组分多体系，底物结构较

为复杂，加大了从发酵液中分离提取较高纯度的纤维素酶的难度，目前文献报道的纤维素酶提取工艺大多是为了获得纯纤维素酶组分并进

行酶学性质的研究，其工艺很难在工业中进行应用。

关键词：纤维素酶；分离提取工艺；盐析；膜分离；色谱层析

前言：在传统的酶粗提方法中，盐析法过程温和，不会使酶分子发生变性，硫酸铵由于其具有较强的盐析能力、较高的水溶性以及较低的温度系数，因此在蛋白质及酶的盐析过程中常被使用。陈红漫等在芽孢杆菌-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性的研究中采用硫酸铵分级沉

淀法对粗酶液分离纯化，结果显示在硫酸铵饱和度区间为20%-60%时，经硫酸铵沉淀后，酶纯化倍数为1.42,回收率为11.41 %。但盐析过程

适合小规模酶的分离提取过程，而当生产规模较大时，由于需要大量的无机盐，会对后续环保处理带来较大压力；而膜分离过程不需要添

加化学试剂，而且整个过程温和，不会造成酶分子的变性失活，当然，膜分离过程也存在投资成本偏高，膜易堵塞等问题。因此，在实际

中国酿造圆园19年第38卷第12期

总第334期

尖孢镰刀菌（）是一种既可侵染植

物又可在土壤内生存的兼性寄生真菌，是一种可引起植物

枯萎病的世界性土传真菌病害[1]。该菌侵染寄主维管束系

统，并在生长代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎

蔫死亡，最终在死亡组织表面产生大量孢子，进一步扩散到

其他部位或其他植株[2]。尖孢镰刀菌可引起100多种植物发

生枯萎病，给作物生产带来严重的损失，国内外已报道的

受害作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、西瓜、大豆等[3-4]。

因此，寻找合适的防治措施成为治理枯萎病的重中之重。

目前防治植物枯萎病的主要方法是化学防治、物理防

治、生物防治和利用农业措施（如作物嫁接[5-6]、合理轮作[7]

和培育抗病品种等）。利用化学方法会产生大量农药残留并造成环境严重污染；培育抗病品种周期长，员工培训困

难，资源耗费高[8]。因此以生物防治为主导的综合防治措施

的研究，对植物枯萎病防治具有非常重要的意义。

用于植物枯萎病的生防菌株主要分为三大类：生防

细菌、生防真菌和生防放线菌。生防细菌主要有假单胞菌（）[9]和芽孢杆菌（）[10]等；生防真菌主

要有木霉（spp.）[11]等；生防放线菌主要有链霉

菌（）[12]等。其中贝莱斯芽孢杆菌（

）作为一种新型菌种，在2008年被确定为解淀粉

芽孢杆菌（）的后期异型体[13]。LIM

SM等[14]筛选出一株对多种病原菌有较强的抑制作用的

G341。孙平平等[15]筛选出一株对梨灰霉和青贝莱斯芽孢杆菌抑菌物质的分析及提取优化

刘安，赵华，张朝正*

（天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津300457）

摘要：为揭示贝莱斯芽孢杆菌（）P9对于致病性尖孢镰刀菌（）的抑制作用机理，考察了菌株P9的产酶能力，并对抑菌物质的提取方法进行优化，分析了抑菌物质的化学成分及稳定性。结果表明，菌株P9具有可分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶的能力，抑菌物质酸沉淀法以氯仿提取，沉淀以甲醇颐磷酸盐缓冲液（PBS）=1颐3（/）重悬。利用牛津杯法测得菌株P9产生的抑菌圈直径为14.3mm左右。薄层层析（TLC）法分析确定菌株P9所产的抑菌物质为脂肽类物质。抑菌物质在温度0～50益稳定，金属离子对其无明显影响。贝莱斯芽孢杆菌P9展示了对致病性尖孢镰刀菌较好的生物防治潜力。关键词：尖孢镰刀菌；贝莱斯芽孢杆菌；拮抗作用；抑菌物质；生物防治中图分类号：S476文章编号：0254-5071（20员9）12-0063-06doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.12.013引文格式：刘安，赵华，张朝正.贝莱斯芽孢杆菌抑菌物质的分析及提取优化[J].中国酿造，2019，38（12）：63-68.