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菌种保藏方法及复壮技术
菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺
乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，
达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保
存。需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活
力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命
力、典型的形态特征、优良生产性能。目前常用的菌种保
藏方法有以下几种。1菌种保藏方法
1.1斜面低温保藏法
将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，
菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4益的冰箱
保藏。由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养
基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适
于长期保藏。每隔六个月转管一次。草菇菌种不耐低温，
需保藏在10~12益，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防
冻剂（10%的甘油）。如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，
用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或
冰箱中保藏。这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免
培养基干燥，使用方便。1.2液体石蜡保藏法
石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接
触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延
长微生物的生命，保持菌种优良的种性。一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121益下高温灭菌30分
钟，再将液体石蜡在160益烘箱中保温1~2小时，蒸发掉
液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60益温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成
无色透明。在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无
菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜
面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立
地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干
涸。如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。1.3滤纸保藏法
严格厌氧菌菌种保藏方法
1.冷冻保存：
将培养基中的菌体经过初步清洁处理，如去除杂质和溶液，然后将其转移到冷冻保藏管中。添加一定量的保护剂，如甘油、DMSO等，以提高菌体的存活率。将管子迅速置于液氮罐或-80°C冰箱中保存。这种方法广泛适用于大多数严格厌氧菌，并且可以长期保存。
2.干燥保存：
将培养基中的菌体在无菌条件下晾干，然后将其转移到无菌干燥保存球或干燥管中。这种方法主要适用于一些特殊的严格厌氧菌，如拟杆菌等。由于干燥后的菌体处于休眠状态，因此其长期保存能力相对较高。
3.真空保藏：
将培养基中的菌体经过初步清洁处理后，将其转移到真空保存管中。用真空泵抽除管中的氧气，然后密封保存。这种方法能够有效地减少氧气的存在，从而延缓菌体的代谢活动，增加保存时间。
4.冷冻干燥保存：
将培养基中的菌体进行冷冻保存后，再进行冻干处理。将菌体在真空条件下冻干，并转移到无菌干燥保存管中。这种方法可以同时减少菌体的新陈代谢和水分含量，从而增加保存时间和稳定性。
5.液氮保存：
将培养基中的菌体直接转移到液氮罐中保存。液氮的低温可以有效地抑制菌体的代谢活动，从而保持菌体的长期稳定性。这种方法适用于一些特别敏感的严格厌氧菌，但操作和管理也相对较为困难。 无论采用何种方法，都需要进行严格的无菌操作，以避免杂菌或其他污染物的引入。同时，保存前需要对菌株进行彻底的鉴定和鉴定，以确保保存的菌株的纯度和可重复性。
此外，为了保证菌株的质量和安全性，菌株应定期复苏和传代，以确保其细胞活力和生物学特性的稳定性。在保存过程中，还可以定期检测菌株的活力和污染情况，以及监测保存条件的稳定性和有效性。
总结起来，严格厌氧菌菌种的保藏方法应考虑到细胞的生物学特性和菌种的要求。选择合适的保存方法，正确操作和管理，并定期检测和验证保存条件和菌株的稳定性，将有助于确保菌种的可持续性和研究的可靠性。
菌种的保藏与复苏
一、菌种保藏
（一）菌种保藏的定义
菌种保藏 （culture preservation） 是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。
（二）菌种保藏的原理
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
（三）菌种保藏的方法
本实验室常用菌种保藏方法主要有：
1.低温保藏法
将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.甘油冷冻管保藏法
菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。野生菌甘油浓度最高可以提高到20-30%。
加工技术-实验室菌种的保藏方法
一、甘油悬液保藏法
此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。
二、冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
三、液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在（1～10）℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。
